CN104302660B - 一种检测c型肝炎病毒感染的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在活体外检测生物样品中的C型肝炎病毒(HCV)感染的方法,其包括同时检测HCV衣壳蛋白及针对所述衣壳蛋白的抗体,所述方法使用包括衍生自截短HCV衣壳的抗原性片段的肽来捕获抗衣壳抗体。本发明还涉及用于捕获抗衣壳抗体的肽及包括所述肽的试剂盒。
Description
本发明涉及C型肝炎病毒(HCV)感染的活体外检测及衍生自病毒的衣壳蛋白的抗原性肽用于此目的的用途。
背景技术
人们早已认识到,C型肝炎病毒感染尤其在输血中是令人担心的健康问题。
为降低输血后的风险,需要在抗体出现之前及在污染后尽可能快地检测病毒本身的存在。该介于污染与血清转化(即出现抗体)之间的时期被称为“血清学窗口期”。
为了找到一种简单、灵敏、特异性、可再现、廉价且容易使用并且可自动进行大规模筛选以首先检测血清学窗口期期间的HCV抗原、然后监测患者在血清转化后的血清学演化的方法,已提出检测抗HCV抗体以及检测HCV抗原。
然而,主要问题在于存在于血清中的抗HCV抗体与经标记的抗HCV抗体之间存在干扰。因此,出于检测所给出抗体的目的,在固相上引入具有与被用于同时夹心(sandwich)检测抗原的经标记的抗体所识别的那些表位相同的表位的靶抗原将使得经标记的抗体不可逆地固定在固相上,且因此使测试产生假阳性反应。
在用于在同一固相上同时检测抗HCV衣壳抗体及HCV衣壳抗原的系统中尤其如此。因此,出于检测抗HCV衣壳抗体的目的,在固相上沉积具有与被用于检测衣壳抗原的经标记的抗HCV衣壳抗体所识别的那些表位相同的表位的衣壳抗原可使得经标记的抗体固定在固相上,且使测试产生假阳性反应。
为了解决干扰问题,申请EP1020727(先端生命科学研究所(Advanced LifeScience Institute))提出用于同时测定HCV衣壳抗原及抗HCV衣壳抗体的方法(“组合(Combo)”型测试),其中用针对衣壳表位的抗体捕获且标记该抗原,所述衣壳表位与用于同时捕获且检测抗衣壳抗体的衣壳表位不同。该申请给出代表性实施例,其中在以间接分析夹心检测抗原及抗体的同时分析中,为了检测抗原,使用针对HCV衣壳的第100位氨基酸(AA)至第130位氨基酸的序列的表位的第一(捕获)抗体以及针对序列AA40-50的表位的第二(检测)抗体,并且为了检测抗体,所使用的捕获抗原就其本身而言含有序列AA1-42及AA66-80。
专利申请WO01/96875(CHIRON)尤其描述了采用N-月桂基肌氨酸作为洗涤剂来同时检测衣壳及抗NS3和NS4抗体的分析。其提及用于同时检测衣壳抗原(夹心法)及抗衣壳和抗非结构HCV蛋白抗体(夹心法,双抗原)的分析。为捕获抗原,使用两种抗体c11-3及c11-7,这两种抗体被认为可识别HCV衣壳的延长的N端部分(AA10-53),并且为了检测,使用第三抗体c11-14,该第三抗体被认为可识别HCV衣壳的C端部分(AA120-130)。为了检测抗体,所使用的捕获抗原是与超氧化物歧化酶(“SOD”)的片段融合的具有多个表位的融合抗原,其含有抗原NS3、NS4、NS5及一系列来自若干HCV菌株的衣壳序列:带有R47L突变的AA9-53、AA64-88及AA67-84。
专利申请EP1251353(Ortho-Clinical Diagnostics)描述了使用相同抗体来检测衣壳的“组合型完全”分析,但并未说明抗体的来源或其表位特异性。抗衣壳抗体通过以下经修饰(通过诱变)的衣壳抗原来检测:C22KSNV47、48(具有SOD的融合蛋白,其包括第47和48位氨基酸缺失的衣壳序列AA10-99)或C22KSR47L(具有SOD的融合蛋白,其包括衣壳序列AA10-99,且在第47位用亮氨酸替代精氨酸)。
专利申请WO2003/002749(Abbott)描述了多种抗原及用于检测HCV衣壳抗原的分析。其以名称“真实组合(Real Combo)”描述的唯一“组合型完全”分析采用被固定于固相中的对应于衣壳的第11-28位氨基酸的生物素化肽来检测抗衣壳抗体。为了检测衣壳,其采用在固相中的先端生命科学研究所抗体C11-14(识别衣壳序列AA45-50)与经吖啶标记的C11-10(识别衣壳序列AA32-36)的组合。因此,申请WO03/002 749通过两个明显分开即不重叠的衣壳位点(用于检测抗体及抗AA32-36抗体的AA11-28,以及用于检测抗原的AA45-50)来捕获衣壳抗原并捕获抗衣壳抗体。
专利申请EP1 310 512(Ortho-Clinical Diagnostics)描述了使用含有突变衣壳序列的肽,从而消除了与用于检测HCV感染的测试中所用的HCV特异性小鼠单克隆抗体结合的可能性。
专利申请WO2003/095968中所描述的发明的作者通过结构修饰人为地使用于捕获抗体的靶抗原的某些表位有所不同。然后破坏由此修饰的表位。同时,用于捕获和/或检测抗原的抗体就其本身而言被选择成使其精确识别存在于患者抗原上的未经修饰的表位,且从而使得其因此无法与不再具有这些相同表位的经修饰的抗原结合。由于表位不再相同,用于捕获和/或检测HCV抗原的抗体与患者的抗体之间不再存在竞争。专利申请WO2003/095968更精确地描述了在至少两个分开的表位位点处被突变的HCV衣壳肽,且尤其描述了肽1-75(G34-G44-G47)。
发明内容
本发明人现提出甚至更有利的检测HCV感染的方法。
在避免干扰问题的同时,该方法具有极佳灵敏度,允许早期检测,同时容许监测患者在血清转化后的血清学演化。
更精确而言,本发明提供了在活体外检测生物样品中的C型肝炎病毒(HCV)感染的方法,其包括同时检测HCV衣壳蛋白及针对所述衣壳蛋白的抗体,所述方法采用包括衍生自截短HCV衣壳的抗原性片段的肽来捕获抗衣壳抗体。
因此,本发明的一个目标是在活体外检测生物样品中的C型肝炎病毒(HCV)感染的方法,其包括同时检测存在于生物样品中的HCV衣壳蛋白及针对所述衣壳蛋白的抗体,所述方法包括a)使生物样品与针对所述衣壳蛋白的捕获抗体及能够捕获存在于样品中的抗衣壳蛋白抗体的捕获抗原接触;b)在允许形成抗原-抗体复合物的条件下温育混合物;c)检测所形成的抗原-抗体复合物,这任选地采用能够与捕获的衣壳蛋白结合的经标记的检测抗体和/或任选地也采用能够与针对捕获的衣壳的抗体结合的经标记的检测抗原;所述方法的特征在于所述捕获抗原是包括衍生自HCV衣壳的至多第1位氨基酸至第44位氨基酸的抗原性片段或由所述抗原性片段组成的肽,所述抗原性片段包括以下序列或由以下序列组成:i)来自HCV衣壳蛋白的第6至37位氨基酸且在第33至36位的至少一个氨基酸、且优选第34位的氨基酸处具有至少一个点突变的序列,或ii)后者的同源序列。
本发明的另一个目标是包括所述抗原性片段的肽。
本发明的另一个目标是用于检测生物样品中的HCV病毒感染的试剂盒,其包括所述肽作为抗HCV衣壳抗体的捕获抗原。
具体实施方式
定义
术语“C型肝炎病毒”或“HCV”在本文中涵盖引起C型肝炎的病毒的所有菌株、所有类型、亚型及基因型。本发明的方法实际上旨在检测任何HCV感染,无论其来源及其基因型如何。具体而言,这包括在欧洲、美国、日本等流行的病毒的熟知类型及亚型(即6种主要基因型:1、2、3、4、5、6及其亚型1a、1b、3a等)。参见Stuyver等人(1994);Bukh(1995)。
HCV衣壳蛋白是具有191个氨基酸的蛋白质,其序列为SEQ ID NO:1:
1 mstnpkpqrk tkrntnrrpq dvkfpgggqi vggvyllprr gprlgvratr ktsersqprg
61 rrqpipkarq pegrawaqpg ypwplygneg mgwagwllsp rgsrpswgps dprrrsrnlg
121 kvidtltcgf adlmgyiplv gaplggaara lahgvrvled gvnyatgnlp gcsfsiflla
181 llscltipas a
除非另有说明,否则氨基酸定位于衣壳蛋白中(参考序列SEQ IDNO:1),该序列是基因型1(亚型1a、1b、1c)的共有序列。
已鉴别出衣壳蛋白的若干表位。尤其已知定位于第16位氨基酸与第40位氨基酸之间的表位。
表述“至多第1位氨基酸至第44位氨基酸”意指具有至多44个氨基酸的肽不延伸超出序列SEQ ID NO:1的第44位氨基酸,但可任选地缩短,前提是其含有第6-37位序列(仍参考SEQ ID NO:1)。
在本发明背景下,“生物样品”优选由生物流体例如血液、血浆、血清、尿、脑脊液、唾液等组成。
术语“抗体”是指任何全抗体或抗体的功能片段,所述功能片段包括至少一个抗原识别位点或由至少一个抗原识别位点组成,所述至少一个抗原识别位点允许所述抗体与抗原性化合物的至少一个抗原决定簇结合。可提及片段Fab、Fab’、F(ab’)2以及链scFv(单链可变片段)、dsFv(双链可变片段)等作为抗体片段的实例。这些功能片段尤其可通过遗传工程来获得。
用于本发明背景下的单克隆抗体或单特异性多克隆血清是基于常规技术而产生,其细节在稍后给出。
“捕获抗体”意指优选固定在固相上的抗体或抗体的一部分,其能够通过亲和结合来保留存在于生物样品中的HCV抗原。
生物样品中抗体及抗原的存在通过特异性标记物来揭露。就抗原检测而言,本发明尤其构想了通过至少一种“检测抗体”来检测。所述经标记的“检测抗体”能够通过亲和结合、识别与捕获抗体所识别的表位位点不同的表位位点来结合捕获的抗原。就抗体检测而言,尤其可使用经标记的抗免疫球蛋白抗体或抗同种型抗体,例如间接ELISA形式中的抗免疫球蛋白G抗体或夹心形式中的经标记的抗原。
捕获抗体和/或检测抗体识别HCV衣壳蛋白的第33-36位部分的天然表位。
术语“经标记”是指直接标记(经由酶、放射性同位素、荧光染料、发光化合物等)及间接标记(例如,经由本身经直接标记的抗体或利用经标记的“亲和对”试剂,例如但不限于经标记的抗生物素蛋白-生物素对等)二者。
“捕获抗原”意指优选固定在固相上的分离的抗原性片段,其能够被抗HCV抗体识别且能够允许与后者亲和结合。
“检测抗原”意指经标记的抗原。其使得可通过竞争来检测捕获的抗原或通过常规的抗原-抗体-抗原夹心技术(也称为“双抗原夹心”方法)来检测抗体(Maiolini等人(1978))。
术语“特异性的”或“特异性地”在指抗体识别或特异性结合抗原时表示,抗体与该抗原相互作用且实质上不与其它抗原相互作用,或者如果谈及“特异性”识别表位则指接近唯一地识别该表位。结合常数优选大于108L.mol-1。
术语“同源物”是指包括衍生自HCV衣壳的至多44个氨基酸的抗原性片段的肽。该抗原性片段包括与HCV衣壳蛋白的至多第1至44位氨基酸的序列不同的序列,该不同之处在于一个或多个氨基酸的保守取代或在N末端(第1至5位氨基酸)和/或C末端(第38至44位氨基酸)处的一个或多个氨基酸的缺失。
捕获并检测抗体及抗原
本发明中所使用的抗体是抗原的特异性抗体,且出于此原因为单克隆抗体或单特异性多克隆抗体,即其仅特异性识别一个表位。
本发明的方法更具体而言涉及抗衣壳抗体的检测,且采用能够固定存在于生物样品中的抗衣壳抗体的捕获抗原。
欲用于捕获抗衣壳抗体的肽包括衍生自HCV衣壳的至多第1至44位氨基酸的抗原性片段,所述抗原性片段包括HCV衣壳蛋白的第6至37位氨基酸的序列或后者的同源序列。因此应理解,本发明的捕获抗原缺少第45至191位氨基酸(其在HCV衣壳蛋白中通常存在)。根据具体实施方式,可用作本发明捕获抗原的肽的氨基酸序列包括32至44个氨基酸或由32至44个氨基酸组成,例如由44个氨基酸的序列组成。
肽在第33-36位序列中的至少一个氨基酸、且优选第34位氨基酸处具有至少一个点突变。其可以是用任何非保守氨基酸取代。对于第34位氨基酸而言,优选使用不同于异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸残基的氨基酸。优选选择不带电荷的氨基酸。第34位氨基酸缬氨酸优选被甘氨酸取代。
由于捕获抗原性肽的突变,在样品的经固定的抗原-抗衣壳抗体反应与样品的经固定的抗体-衣壳抗原反应之间不存在干扰。
根据优选实施方式,固定在固相上的捕获抗体是针对衣壳蛋白的第33-36位天然表位的抗体,而在c1)处经直接或间接标记的检测抗体针对与存在于所述HCV衣壳蛋白的第33至36位、更通常为第6至37位部分中的天然表位不同的表位。例如,其可以是针对衣壳的第44-47位表位的抗体。
根据另一优选实施方式,固定在固相上的捕获抗体是针对与存在于所述HCV衣壳蛋白的第33至36位、更通常为第6至37位部分中的天然表位不同的表位的抗体,例如其可以是针对衣壳的第44-47位表位的抗体,而在c1)处经直接或间接标记的检测抗体是针对衣壳蛋白的第33-36位天然表位的抗体。
根据具体实施方式,捕获抗原是由HCV衣壳蛋白的第1至44位序列组成且在第34位的氨基酸处具有点突变、优选为取代成甘氨酸的肽。
因此,优选的实例是序列SEQ ID NO:2的肽。
1MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGG34 YLLPRRGPRL
也可使用由如上文所定义的序列组成、但此外在N端或C端侧截短1至5个氨基酸的同源肽。因此,可使用肽6-37,其在第33-36位序列中的至少一个氨基酸、且优选第34位氨基酸处具有点突变。其优选为序列SEQ ID NO:3的肽。
6KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGG34 YLL37
本发明也包括与以上肽的不同之处仅为保守取代的肽。
表述“保守取代”表示一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基的任何替代而不改变该肽的一般构象或抗原性。保守取代包括但不限于被具有相似性质(例如形状、极性、氢键合电位、酸度、碱度、疏水性等)的氨基酸替代。具有相似性质的氨基酸是本领域技术人员所熟知的。例如,精氨酸、组氨酸及赖氨酸是碱性亲水性氨基酸且可互换。按照相同方式,疏水性氨基酸异亮氨酸可被亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸替代。可彼此替代的中性亲水性氨基酸包含天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸及苏氨酸。本发明的“经取代”及“经修饰”意指相对于在自然界中发现的氨基酸已经改变或修饰的氨基酸。
因此,在本发明背景下,保守取代是一个氨基酸被另一个具有相似性质的氨基酸取代。保守取代的实例在下表1中给出:
表1.保守取代I
侧链的特征 | 氨基酸 |
非极性 | G A P I L V |
极性,不带电荷 | C S T M N Q |
极性,带电荷 | D E K R |
芳香族 | H F W Y |
其它 | N Q D E |
根据Lehninger,1975,保守氨基酸也可以如下表2中所示进行分组:
表2.保守取代II
侧链的特征 | 氨基酸 |
非极性(疏水性) | |
A.脂肪族: | A L I V P |
B.芳香族: | F W |
C.含有硫酰基: | M |
D.其它 | G |
极性,不带电荷 | |
A.羟基: | S T Y |
B.酰胺: | N Q |
C.巯基: | C |
D.其它 | G |
带正电荷(碱性) | K R H |
带负电荷(酸性) | D E |
另一替代性保守取代示于下表3中:
表3.保守取代III
原始残基 | 取代的实例 |
Ala(A) | Val(V)、Leu(L)、Ile(I) |
Arg(R) | Lys(K)、Gln(Q)、Asn(N) |
Asn(N) | Gln(Q)、His(H)、Lys(K)、Arg(R) |
Asp(D) | Glu(E) |
Cys(C) | Ser(S) |
Gln(Q) | Asn(N) |
Glu(E) | Asp(D) |
His(H) | Asn(N)、Gln(Q)、Lys(K)、Arg(R) |
Ile(I) | Leu(L)、Val(V)、Met(M)、Ala(A)、Phe(F) |
Leu(L) | Ile(I)、Val(V)、Met(M)、Ala(A)、Phe(F) |
Lys(K) | Arg(R)、Gln(Q)、Asn(N) |
Met(M) | Leu(L)、Phe(F)、Ile(I) |
Phe(F) | Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Ala(A) |
Pro(P) | Gly(G) |
Ser(S) | Thr(T) |
Thr(T) | Ser(S) |
Trp(W) | Tyr(Y) |
Tyr(Y) | Trp(W)、Phe(F)、Thr(T)、Ser(S) |
Val(V) | Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Ala(A) |
本发明的肽可通过所有传统肽合成技术、即尤其通过化学合成或遗传重组来制备。在优选实施方式中,肽由化学合成获得。更优选地,肽通过以下方式获得:以所需顺序连续缩合氨基酸残基;或在先前形成且已含有若干氨基酸的片段上以适当顺序缩合残基;或缩合先前制备的若干片段,其中事先小心保护氨基酸残基携载的所有反应性官能团,但在缩合期间插入肽键的胺及羧基官能团除外;以及尤其是Merrifield氏固相合成技术,其因纯度、抗原特异性、不存在不想要的副产物及容易实施而有利(Merrifield,(1963);R.C.Sheppard(1971);Atherton等人(1989))。就自动化合成仪而言,可使用来自Millipore的“9050Plus Pep合成仪”、来自Perseptive的“Pioneer”合成仪、来自ABI(AppliedBiosystems公司)的“433A”合成仪或来自Rainin的“Symphony”合成仪。肽也可通过均相合成来获得。
欲用于捕获抗衣壳抗体的抗原性肽可在其N末端处用间隔物延长。
本发明还涉及包括抗原性肽的所述偶联肽,所述抗原性肽在其N末端共价结合至间隔物。
“间隔物”意指优选为肽的分子,其优选具有1至8个氨基酸,优选被官能化,即具有例如硫醇、酰肼、醛官能团或生物素。其通常是1至8个氨基酸的肽,其可包括非天然氨基酸,例如ω-氨基酸。所述间隔物优选含有至少一个半胱氨酸残基。根据优选实施方式,间隔物是C-Hx,其中C是半胱氨酸且Hx是6-氨基己酸。根据另一实施方式,间隔物是序列CGG的肽。
捕获肽可与其本身共价偶合或其可经由间隔物与携载分子偶合。因此,间隔物使得可优化抗原性肽在固体表面、蛋白质或可溶性官能化聚合物上的附接和/或使得可偶联若干个抗原性分子。携载分子优选为蛋白质例如牛血清白蛋白(BSA)或卵白蛋白。根据另一实施方式,肽经由间隔物结合至氨基-葡聚糖。
因此,根据具体实施方式,肽偶联物包括共价结合至若干可相同或不同的抗原性肽的间隔物。优选由此形成同源二聚体。
尤其优选地,抗衣壳抗体的捕获抗原仅仅是一种如上文所定义的抗原性肽(例如序列SEQ ID NO:2的肽)。
然而,在具体实施方式中,如上文所定义的本发明的捕获抗原(例如序列SEQ IDNO:2的肽)可与另一捕获抗原(优选与本发明的捕获抗原存在于同一固相上)组合使用,所述另一捕获抗原的氨基酸序列包括HCV衣壳蛋白的在第45或46位氨基酸至介于第60位与第80位之间、优选介于第65位与第75位之间或介于第68位与第75位之间(仍参考SEQ ID NO:1)的一个氨基酸范围内的片段或由所述片段组成。在更具体实施方式中,另一捕获抗原由第45-65位、第45-66位、第45-67位、第45-68位、第45-69位、第45-70位、第45-71位、第45-72位、第45-73位、第45-74位或第45-75位序列,或第46-65位、第46-66位、第46-67位、第46-68位、第46-69位、第46-70位、第46-71位、第46-72位、第46-73位、第46-74位或第46-75位序列组成。可提及肽45-65、肽45-68或更优选肽45-75作为实例。
此外,抗衣壳抗体的检测可与针对另一HCV蛋白的抗体的检测组合进行。可将多种捕获或检测抗原组合在一起。该实施方式采用若干不同的捕获和/或检测抗原,从而使得可例如同时检测抗衣壳抗体及抗非结构蛋白例如HCV的NS3和/或NS4或NS5的抗体。尤其优选同时检测抗衣壳抗体及抗NS3抗体。本发明还包括同时检测衣壳抗原、抗衣壳抗体、抗包膜结构蛋白E1和/或E2抗体、包膜E1和/或E2抗原和/或抗HCV的非结构蛋白NS3和/或NS4或NS5的抗体。可想象得到的其它组合也构成本发明的一部分。
检测方法
本发明的方法包括同时检测存在于生物样品中的HCV衣壳蛋白及针对所述衣壳蛋白的抗体,所述方法包括a)使生物样品与针对所述衣壳蛋白的捕获抗体及能够捕获存在于样品中的抗衣壳蛋白抗体的捕获抗原接触;b)在允许形成抗原-抗体复合物的条件下温育混合物;c)检测所形成的抗原-抗体复合物,所述检测任选地采用能够与捕获的衣壳蛋白结合的经标记的检测抗体和/或任选地也采用能够与针对捕获的衣壳的抗体结合的经标记的检测抗原。
通常且除非另有说明,否则捕获抗原在本文中是指衍生自HCV衣壳的至多第1位氨基酸至第44位氨基酸的抗原性片段与包括所述片段的偶联肽二者,如上文所述。
生物样品可任选地在初步步骤中处理或可使其与捕获抗原及捕获抗体在促进欲检测的抗原暴露的条件下接触。
有利地,在检测前且优选在使样品与所使用抗体接触前,将样品用变性剂处理。该变性剂可尤其由一种或多种非离子型洗涤剂例如Tween20、Triton X-100、Nonidet P-40(NP40)(叔辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇,也称为IGEPAL CA630)、正辛基β-D-吡喃糖苷或酸性溶液组成。
该组合免疫分析可根据本领域技术人员熟知的多种形式来实施:作为非限制性实例,在固相或均相中;一或两次;在双夹心方法(用于检测抗原及抗体二者的夹心法)中;或在与夹心方法(用于检测抗原)组合的间接方法(用于检测抗体)中。
根据优选实施方式,将捕获抗体及捕获抗原固定在固相上。作为固相的非限制性实例,可使用微量板,具体而言为聚苯乙烯微量板,例如由Nunc公司,Denmark出售的那些微量板。也可使用固体颗粒或珠粒、顺磁珠粒(例如由Dynal或Merck-Eurolab(France)以商标名Estapor供应的那些顺磁珠粒),或聚苯乙烯或聚丙烯试管,或硝酸纤维素膜等。
两种抗体(用于捕获及用于检测)之间的夹心类型的免疫分析形式对于检测存在于生物样品中的抗原来说尤其有利,而抗体可通过采用捕获抗原及固定在抗体(例如经标记的蛋白A或经标记的抗免疫球蛋白抗体或抗同种型抗体)上的经标记的偶联物(根据通常称为“间接形式”的形式)来检测。有利地也可通过采用固定在抗体上的捕获抗原及经标记的抗原(根据名为“抗原-抗体-抗原夹心法”或“双抗原夹心法”的形式)来检测抗体。
也可使用通过竞争来检测抗原的免疫分析形式。也可构想其它类型的免疫分析且其是本领域技术人员所熟知的。
根据本发明同时检测HCV抗原及抗HCV抗体可一次实施,即,使生物样品同时与检测构件(例如尤其为检测抗体)以及捕获抗体及捕获抗原接触。在此情形下,用于检测抗原的免疫分析及用于检测抗体的免疫分析二者优选以夹心法来实施。或者,可延后、即在已形成第一抗原-抗体复合物之后,将检测构件(例如尤其为检测抗体)添加至混合物。则此称为两步式分析。
根据本发明的优选实施方式,检测生物样品中的C型肝炎病毒(HCV)感染的方法包括:a)使样品与固定在固相上的HCV衣壳蛋白的捕获抗体及抗HCV衣壳抗体的捕获抗原接触;b)在允许形成抗原-抗体复合物的条件下温育混合物;c)分离固相与液相;d)使固相与能够结合捕获的HCV抗原的经标记的检测抗体及一种或多种能够结合捕获的抗HCV抗体的经标记的抗免疫球蛋白抗体或抗同种型抗体接触。
可采用ELISA分析、放射免疫分析或任何其它检测技术来揭露所形成的抗原-抗体复合物的存在。
可向对生物样品中的抗原或抗体的存在的检测补充根据本领域技术人员熟悉的标准技术通过例如测定标记物发射的信号(颜色、发光、放射性等)来实施的量化。
试剂盒
可用于根据本发明的方法检测生物样品中的HCV感染的试剂盒及试剂可被供应用于本发明的适用于众多生物样品的简单实践应用。
因此,本发明提供可用于检测生物样品中的HCV病毒感染的试剂盒,其包括能够捕获抗HCV衣壳抗体的抗原性肽。该试剂盒还可以包括用于检测存在于生物样品中且与所述捕获抗原复合的抗HCV抗体的构件,所述检测构件优选是经标记的抗免疫球蛋白抗体或抗同种型抗体。
有利地,所述试剂盒可含有若干抗原及若干捕获抗体。
该试剂盒可另外含有该病毒的其它蛋白质的抗原例如NS3和/或NS4和/或NS5,则这些抗原意欲捕获抗NS3抗体和/或抗NS4抗体和/或抗NS5抗体。这些抗原优选与衍生自衣壳的捕获抗原混合。
如上文所述,捕获抗体及捕获抗原可有利地以固定在固相例如微量板上的形式呈现。
优选的试剂盒包括
a1)捕获抗原,其是包括衍生自HCV衣壳的至多第1位氨基酸至第44位氨基酸的抗原性片段或由所述抗原性片段组成的肽,所述抗原性片段包括以下序列或由以下序列组成:i)来自HCV衣壳蛋白的第6至37位氨基酸且在第34位的氨基酸处具有至少一个点突变的序列,或ii)后者的同源序列;
a2)优选以及抗非结构蛋白抗体的捕获抗原,所述捕获抗原包括非结构蛋白NS3、NS4和/或NS5中的一些或全部,
b)针对HCV衣壳蛋白的捕获抗体;
所述捕获抗原及所述捕获抗体被固定在固相上;以及
c1)经标记的检测抗体,
c2)一种或多种抗免疫球蛋白抗体或任选地经标记的检测抗原,所述检测抗原包括抗原性片段或为抗原性片段,所述抗原性片段是包括衍生自HCV衣壳的至多第1位氨基酸至第44位氨基酸的抗原性片段或由所述抗原性片段组成的肽,所述抗原性片段包括以下序列或由以下序列组成:i)来自HCV衣壳蛋白的第6至37位氨基酸且在第33至36位的至少一个氨基酸处具有点突变的序列,或ii)后者的同源序列。
捕获抗体和/或检测抗体识别HCV衣壳蛋白的第33-36位部分的天然表位。
根据优选实施方式,固定在固相上的捕获抗体是针对衣壳蛋白的第33-36位天然表位的抗体,而在c1)处经直接或间接标记的检测抗体针对与存在于所述HCV衣壳蛋白的第33至36位、更通常为第6至37位部分中的天然表位不同的表位。例如,其可以是针对衣壳的第44-47位表位的抗体。
根据另一优选实施方式,固定在固相上的捕获抗体是针对与存在于所述HCV衣壳蛋白的第33至36位、更通常为第6至37位部分中的天然表位不同的表位的抗体,例如其可以是针对衣壳的第44-47位表位的抗体,而在c1)处经直接或间接标记的检测抗体是针对衣壳蛋白的第33-36位天然表位的抗体。
该试剂盒还可以包括洗涤剂,更具体而言为本领域技术人员所知的非离子型洗涤剂。
下列实施例说明本发明而非限制其范围。
实施例:C型肝炎病毒感染的检测
用于分析方案的材料:
1)所选固相:Maxisorp微量板,Nunc(Denmark)。
2)抗衣壳单克隆抗体-生物素偶联物(“acm-POD”):经过氧化物酶标记的抗衣壳单克隆抗体Acm2的偶联物是根据专利申请EP 0 752 102中所描述的方案制备的。
也使用另一抗衣壳单克隆抗体Acm1。
3)小鼠抗IgG(Fcγ)人类多克隆抗体-POD偶联物:该偶联物从JacksonImmunoresearch Laboratories,USA获得(间接ELISA形式)。经生物素标记的衣壳肽偶联物(夹心形式)。
4)用于本发明方案第1步及第2步的稀释剂:
用于第1步的稀释剂:Tris缓冲液、0.05M NaCl,pH6.7,添加有0.25%IGEPALCA630(Sigma)。
用于第2步的稀释剂:50mM柠檬酸盐缓冲液,pH6.7,在20%甘油中的溶液。
5)显影溶液:该显影溶液由以下物质组成
5a)底物缓冲液:柠檬酸(0.075M)与乙酸钠(0.1M)的溶液,pH4.0,含有0.015%H2O2及4%二甲基亚砜(DMSO)(PROLABO),以及
5b)色素原:含有8mM四甲基联苯胺(TMB)的溶液(Sigma)。
方法:
用于同时检测样品(血清或血浆)中的C型肝炎病毒的衣壳抗原及抗体(抗衣壳抗体及抗NS3、NS4抗体)的方案
分析的原理基于用于检测抗原的夹心类型及用于检测抗体的间接类型的免疫酶方法。
其基于以下步骤:
首先在缓冲液Tris(0.5M,pH7.4)中制备含有以下物质的敏化溶液:
●HCV抗原的混合物:包括序列SEQ ID No.2的突变肽CHx-1-44(G34)(衣壳),以及由来自于选自非结构区NS3(AA1192-1657)及NS4(AA1694-1735)的克隆的大肠杆菌(Escherichia coli)产生的两种重组蛋白,以及
●抗衣壳单克隆抗体(Acm1)。
然后用上述溶液以110μl/孔的比率敏化微量滴定板(Nunc,Maxisorp)的孔。
在室温(18℃-24℃)下将微量滴定板温育过夜。
移除敏化溶液后,用含有0.1%Tween20的磷酸盐缓冲液(0.01M,pH7.4)洗涤板,然后通过添加含有5%蔗糖、25%脱脂乳(CandiaTM,France或任何其它等效商业脱脂乳)及10mM EDTA的磷酸盐缓冲液(0.01M,pH7)来饱和。
在每孔中连续分布100μl含有经过氧化物酶标记的抗衣壳单克隆抗体Acm2的用于第1步的稀释剂,然后分布50μl样品(血清或血浆)。
在37℃下将反应混合物温育1.5h。任何可能存在的HCV衣壳抗原附接至固相单克隆抗体Acm1上且与经过氧化物酶标记的抗衣壳单克隆抗体Acm2形成复合物。此外,如果存在抗HCV抗体,则它们结合于固定在固相上的抗原。
然后用洗涤溶液(缓冲液Tris NaCl0.01M,pH7.4,添加有0.1%Tween20)洗涤板(3次)。
在每孔中分布100μl含有经过氧化物酶标记的抗人类IgG抗体或经生物素标记的衣壳肽的用于第2步的稀释剂。在室温(18℃-24℃)下将反应混合物温育30分钟。经标记的抗人类IgG抗体或经生物素标记的衣壳肽依序固定至保留在固相上的特异性抗体上。
然后用洗涤溶液(缓冲液Tris NaCl0.01M,pH7.4,添加有0.1%Tween20)洗涤板(5次)。由此移除未结合的抗人类IgG偶联物。
在每孔中分布100μl显影溶液(底物缓冲液+色素原)。使反应物在室温(18℃-24℃)下在黑暗中显影30分钟。
然后在每孔中分布100μl终止溶液(1N H2SO4)。
反应终止后,在分光光度计上在450/620nm下读取光学密度。
阈值的定义:
在使用ROC(受试者操作特征)曲线对特异性及灵敏度数据进行统计分析后测定阈值(Berck及Schultz,(1986))。
特异性研究是基于来自健康受试者的5000个样品,并且灵敏度研究是基于来自以下商业组的HCV阳性样品(尤其为已血清转化):BBI(Boston Biomedica公司,USA)、Impath(USA)、Serologicals(USA)、Nabi(USA)、ProMedDx(USA)。
将阳性对照上获得的信号除以测试特异性常数系数X来计算每块板的阈值。其在间接形式所呈现的实施例中为约0.45OD(光学密度)单位。
实施例1:HCV抗原阴性样品(血清或血浆)中的抗衣壳抗体的检测
根据夹心方案测试三组市售(Seracare Life Sciences/BBI Diagnostics,USA)血清转化样品PHV905、907及914(即,在HCV感染后或在血清转化过程中取自两个患者的两种连续血清或血浆样品)。然后用生物素标记衣壳肽1-44G34(SEQ ID NO:2),并且用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶揭示复合物。因此,其为单一的抗衣壳抗体检测。
根据从三个阴性样品的平均值加上6个标准偏差(OD:0.077)计算得到的阈值发现,这些样品为阳性。
表1:
因此,本发明使得可检测经HCV污染的受试者中的对抗衣壳抗体呈阳性的样品。
实施例2:在对抗体和/或抗原呈阳性的血清转化血清上比较多种技术的性能及分类
用本发明的分析根据所指示的方案测试9个具有不同特异性的市售血清转化组(Seracare Life Sciences/BBI,USA;Impath,USA),并且将结果与一系列市售测试作比较。该比较考虑到了检测相对于RNA检测(PCR分析)延迟的天数。因此,具有最小总和的试剂盒给出最佳早期检测性能。发现这些组对抗原和/或针对HCV病毒的NS3蛋白及衣壳的抗体呈阳性(由Ortho Clinical Diagnostics公司出售的RIBA测试实施表征)。
表2:
本发明使得可早于抗体分析检测出对抗体及抗原呈阳性的样品。
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Claims (16)
1.针对C型肝炎病毒(HCV)衣壳蛋白的捕获抗体和能够捕获存在于生物样品中的抗衣壳蛋白抗体的捕获抗原在制备通过包括以下的方法检测生物样品中的HCV病毒感染的试剂盒中的应用:同时检测存在于所述生物样品中的HCV衣壳蛋白及针对所述衣壳蛋白的抗体,所述方法包括a)使所述生物样品与针对所述衣壳蛋白的捕获抗体及能够捕获存在于所述样品中的抗衣壳蛋白抗体的捕获抗原接触;b)在允许形成抗原-抗体复合物的条件下温育混合物;c)检测所形成的抗原-抗体复合物,其中任选地采用能够与捕获的衣壳蛋白结合的经标记的检测抗体和/或任选地也采用能够与捕获的抗衣壳抗体结合的经标记的检测抗原来检测所形成的抗原-抗体复合物;所述方法的特征在于所述捕获抗原是由所述HCV衣壳蛋白的第1至44位氨基酸组成且在第34位的氨基酸处具有点突变的肽,其中第34位的氨基酸是甘氨酸残基。
2.权利要求1的应用,其中将所述捕获抗体及所述捕获抗原固定在固相上。
3.权利要求2的应用,其中所述固相还包括至少一种衍生自非所述衣壳的HCV蛋白的抗原。
4.权利要求3的应用,其中所述HCV蛋白为NS3或NS4。
5.权利要求1至4中任一项的应用,其中所述检测抗体在抗原-抗体复合物形成后添加至所述混合物。
6.权利要求1至4中任一项的应用,其中使所述检测抗体和/或所述检测抗原与所述捕获抗体及所述捕获抗原同时与所述生物样品接触。
7.一种肽,其由HCV衣壳蛋白的第1至44位氨基酸组成且在第34位的氨基酸处具有点突变,其中第34位的氨基酸是甘氨酸残基。
8.一种偶联肽,其包括权利要求7的肽,其中权利要求7的肽在其N末端共价结合至间隔物。
9.权利要求8的偶联肽,其中所述间隔物是C-Hx,其中C是半胱氨酸且Hx是6-氨基己酸。
10.权利要求8和9中任一项的偶联肽,其中如权利要求7中所定义的肽与其本身共价偶合或经由所述间隔物而具有携载分子。
11.一种可用于检测生物样品中的HCV病毒感染的试剂盒,其包括如权利要求7中所定义的肽作为抗HCV衣壳抗体的捕获抗原。
12.权利要求11的试剂盒,其除了所述捕获抗原外还包括用于检测存在于所述生物样品中且与所述捕获抗原复合的抗HCV抗体的构件。
13.权利要求11和12中任一项的试剂盒,其包括
a)抗HCV衣壳抗体的捕获抗原,其是如权利要求7中所定义的肽;
b)针对所述HCV衣壳蛋白的捕获抗体;
将所述捕获抗原及所述捕获抗体固定在固相上;以及
c1)经标记的检测抗体,
c2)一种或多种抗免疫球蛋白抗体或任选地经标记的检测抗原,所述检测抗原是如权利要求7中所定义的肽。
14.权利要求13的试剂盒,其还包括抗非结构蛋白抗体的捕获抗原,所述捕获抗原包括非结构蛋白NS3、NS4和/或NS5中的一些或全部。
15.权利要求11和12中任一项的试剂盒,其包括:抗HCV衣壳抗体的捕获抗体,其被固定在固相上,针对所述衣壳蛋白的第33-36位天然表位;以及经直接或间接标记的检测抗体,其针对与存在于所述HCV衣壳蛋白的第33至36位部分中的天然表位不同的表位。
16.权利要求11和12中任一项的试剂盒,其包括:抗HCV衣壳抗体的捕获抗体,其被固定在固相上,针对与存在于所述HCV衣壳蛋白的第33至36位部分中的天然表位不同的表位;以及经直接或间接标记的检测抗体,其针对所述HCV衣壳蛋白的第33-36位天然表位。
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