CN104278044B - 提高截短侧耳素产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了提高截短侧耳素产量的方法。具体地，本发明提供了一种改良截短侧耳素生产菌株的方法，该方法适用范围广，效率高。本发明还提供了一种经改良的截短侧耳素生产菌株。由于采用新颖的经改良的截短侧耳素生产菌，因此可大幅提高截短侧耳素产量。此外，本发明还提供了一种截短侧耳素的生产方法，由于该生产方法对现有生产工艺可不进行修改和调整，因此成本低。
Description
技术领域
本领域涉及生物技术领域，具体地，涉及了一种提高截短侧耳素(Pleuromutilin)产量的方法。
背景技术
截短侧耳素是化学合成泰妙菌素(Tiamulin)的前体，分子式为C22H34O5，分子量为378.51，属二萜类化合物，是高等真菌担子菌侧耳属(Pleurotus mutilus)或其它真菌的次级代谢产物，是一种天然的具有广泛抗菌活性的二萜类化合物。
虽然我国截短侧耳素的产能大，虽然本领域已经有利用不同的生物体来生产截短侧耳素的技术，然而生产菌株的效价水平较低，增加了生产的成本。这大大限制了截短侧耳素的应用。
综上所述，本领域迫切需要开发有效的提高截短侧耳素产量的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效的提高截短侧耳素产量的方法。
本发明提供了通过辅酶因子再生从而提高截短侧耳素产量的方法。
在本发明的第一方面提供了一种双酶偶联的构建物，所述构建物包括：
(a)用于生产外源酮基还原酶(KR)的第一亚构建物，
其中所述的第一亚构建物包括第一启动子、与所述第一启动子可操作地连接的酮基还原酶的编码序列、和终止密码子；
(b)用于生产外源葡萄糖脱氢酶(GDH)的第二亚构建物，
其中所述的第二亚构建物包括第二启动子、与所述第二启动子可操作地连接的酮基还原酶的编码序列、和终止密码子，
其中所述的第一亚构建物和第二亚构建物是相互独立的、或是一体的。
在另一优选例中，所述的酮基还原酶(KR)来源于来源于酿酒酵母、黑曲霉、紫杉、双孢蘑菇、或肠膜明串珠菌。
更佳地，所述的酮基还原酶选自下组：
来源于酿酒酵母的HMGR(Y)；
来源于黑曲霉的HMGR(A)；
来源于紫杉的HMGR(T)；
来源于双孢蘑菇的HMGR(B)；
来源于肠膜明串珠菌亚种J18(Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides Strain J18)的HMGR(L)。
在另一优选例中，所述的葡萄糖脱氢酶(GDH)来源于枯草芽孢杆菌、巨大枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶、酿酒酵母、黑曲霉、紫杉。
更佳地，所述的葡萄糖脱氢酶(GDH)选自下组：
来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(GlucoseDehydrogenase GDH(B))；
来源于巨大枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH(M))；
来源于酿酒酵母的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH(Y))；
来源于黑曲霉的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH(A)；
来源于紫杉的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH(T)。
在另一优选例中，所述的酮基还原酶(KR)和葡萄糖脱氢酶(GDH)选自下列组合：
来源于酿酒酵母的HMGR(Y)与来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH(B))组合成的HMGR(Y)-GDH(B)偶联组合；
来源于黑曲霉的HMGR(A)与来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH(B))组合成的HMGR(A)-GDH(B)偶联组合；
来源于紫杉的HMGR(T)与来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH(B))组合成的HMGR(T)-GDH(B)偶联组合；
来源于双孢蘑菇的HMGR(B)与来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH(B))组合成的HMGR(B)-GDH(B)偶联组合；
来源于肠膜明串珠菌亚种J18(Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides Strain J18)的HMGR(L)与来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH(B))组合成的HMGR(L)-GDH(B)偶联组合；
来源于酿酒酵母的HMGR(Y)与来源于巨大枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(GlucoseDehydrogenase GDH(M))组合成的HMGR(Y)-GDH(M)偶联组合；
来源于酿酒酵母的HMGR(Y)与来源于酿酒酵母的葡萄糖脱氢酶(GlucoseDehydrogenase GDH(Y))组合成的HMGR(Y)-GDH(Y)偶联组合；
来源于酿酒酵母的HMGR(Y)与来源于黑曲霉的葡萄糖脱氢酶(GlucoseDehydrogenase GDH(A)组合成的HMGR(Y)-GDH(A)偶联组合；
来源于酿酒酵母的HMGR(Y)与来源于紫杉的葡萄糖脱氢酶(GlucoseDehydrogenase GDH(T))组合成的HMGR(Y)-GDH(T)偶联组合。
在本发明第二方面，提供了一种载体，所述表达载体携带本发明第一方面所述的构建物。
在本发明第三方面，提供了一种载体组合，所述载体组合包括第一载体和第二载体，其中第一载体携带本发明第一方面所述的构建物的第一亚构建物，而第二载体携带本发明第一方面所述的构建物的第二亚构建物。
在本发明的第四方面，提供了一种基因工程的细胞，所述细胞含有本发明第三方面所述的载体或第四方面所述的载体组合。
在本发明的第五方面，提供了一种基因工程细胞，所述细胞的基因组中整合有本发明第一方面所述的构建物；或者
所述细胞的基因组中整合有(a)用于表达外源酮基还原酶(KR)的第一表达盒和(b)用于表达外源葡萄糖脱氢酶(GDH)的第二表达盒，
其中所述的第一表达盒包括第一启动子、与所述第一启动子可操作地连接的酮基还原酶的编码序列、和终止密码子；
所述的第二表达盒包括第二启动子、与所述第二启动子可操作地连接的酮基还原酶的编码序列、和终止密码子。
在另一优选例中，所述的细胞是生产截短侧耳素的工程菌。
在另一优选例中，所述的细胞为底盘细胞；较佳地，所述细胞选自下组：斜盖菇（Clitopilus prunulus）、担子菌侧耳属（Pleurotus mutilus）、截短侧耳素产生斜盖菇（Clitopilus passeckerianus）、猴头菇（Hericium erinaceus）、灵芝（Ganodermalucidum）、云芝（Coriolus versicolor）等高等真菌。
在本发明的第六方面，提供了一种生产截短侧耳素的方法，包括步骤：
培养截短侧耳素的生产菌，从而产生截短侧耳素；
其中所述的生产菌的基因组中整合有本发明第一方面所述的构建物；或者
所述生产菌的基因组中整合有(a)用于表达外源酮基还原酶(KR)的第一表达盒和(b)用于表达外源葡萄糖脱氢酶(GDH)的第二表达盒，
其中所述的第一表达盒包括第一启动子、与所述第一启动子可操作地连接的酮基还原酶的编码序列、和终止密码子；
所述的第二表达盒包括第二启动子、与所述第二启动子可操作地连接的酮基还原酶的编码序列、和终止密码子；
以及从培养物中分离出截短侧耳素。
在本发明的第七方面，提供了一种对截短侧耳素的生产菌进行改造的方法，包括步骤：
(i)将本发明第一方面所述的构建物引入所述的截短侧耳素的生产菌，从而获得经转化的生产菌，其中所述的经转化的生产菌的基因组中整合入本发明第一方面所述的构建物。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(ii)对经转化的生产菌进行NADPH生产能力或截短侧耳素的生产能力的筛选，从而选出生产能力提高的生产菌。
在另一优选例中，在步骤(i)中，通过根癌农杆菌转化法进行转化，从而将所述的构建物引入所述的截短侧耳素的生产菌。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
通过根癌农杆菌转化系统，将外源HMGR基因和GDH基因先后或同时转入Clitopilus prunulus。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
通过根癌农杆菌表达系统将将不同来源葡萄糖脱氢酶基因转入到根癌农杆菌中，即将GDH基因与根癌农杆菌的表达载体PBI121构建重组载体(PBI-GDH)，然后转入到根癌农杆菌中；
通过携带有重组载体PBI-GDH的根癌农杆菌与Clitopilus prunulus共培养转化GDH至受体细胞Clitopilus prunulus中，获得携带有外源GDH的Clitopilus prunulus-GDH菌株。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
通过根癌农杆菌表达系统将不同来源HMGR基因转入到根癌农杆菌中，即将HMGR基因与根癌农杆菌的表达载体pCAMBIA1301构建重组载体(pCAMBIA-HMGR)，然后转入到根癌农杆菌中；
通过携带有重组载体pCAMBIA-HMGR的根癌农杆菌与携带有外源GDH的Clitopilusprunulus-GDH共培养转化HMGR至受体细胞Clitopilus prunulus-GDH中，获得携带有外源GDH和HMGR的Clitopilus prunulus-GDH-HMGR工程菌株。
在本发明的第八方面，提供了用本发明上述方法改造所获得的经改良的工程菌。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了PBI121载体的电泳检测图。
图2显示了枯草芽孢杆菌基因组电泳检测图。
图3显示了GDH基因扩增产物的电泳检测图，泳道1的条带为得到的GDH(B)基因。
图4显示了GDH(B)菌落PCR鉴定。
图5显示了PMD18T-GDH(B)质粒的电泳检测图。
图6显示了GDH(B)和PBI121双酶切后的图谱。各泳道如下：1为GDH(B)，2为PBI121。
图7显示了PBI-GDH(B)菌落PCR鉴定结果。泳道1-8对应于克隆管号。
图8显示了PGH-HMGR菌落PCR鉴定结果。泳道1-10对应于克隆管编号。
图9显示了PGH-HMGR质粒(左)和PGH-HMGR质粒PCR(右)电泳检测图。
图10显示了pCAMBIA1301载体与HMGR(L)酶切图谱。各泳道如下：1为pCAMBIA1301载体，2为HMGR(L)。
图11显示了pCAMBIA1301-HMGR(L)菌落PCR鉴定。
图12显示了载体pBI121-GDH的构建。
图13显示了载体pCMBIA1301-HMGR的构建。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次将外源的酮基还原酶(KR)和外源的葡萄糖脱氢酶(GDH)基因转入截短侧耳素生产菌株，从而大幅提高了截短侧耳素的产量。在此基础上完成了本发明。
本发明的实验表明，将不同来源的外源酮基还原酶(KR)和葡萄糖脱氢酶(GDH)基因转化到目标底盘细胞(如Clitopilus prunulus)，经改良后的基因工程菌株，其截短侧耳素的产量可显著提高(如18%或更高)。
定义
如本文所用，“酮基还原酶(KR)”指催化酮基发生还原反应的酶。酮基还原酶是氧化还原酶的一种，在手性药物合成中的具有广泛的应用，如氨基酸的生产，羟基酸的合成，醇类，醛类和酮基修饰，甾体转化等。
一种代表性的酮基还原酶是戊二酰单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR)。其发挥活性依赖于辅酶因子NADPH。
如本文所用，“葡萄糖脱氢酶(GDH)”指催化葡萄糖进行脱氢反应的酶。
构建物和载体
本发明提供了一种双酶偶联的构建物，所述构建物可用于生产(或辅助生产)辅酶因子NADPH，并可用于显著提高截短侧耳素的产量。
本发明的构建物包括：
(a)用于生产外源酮基还原酶(KR)的第一亚构建物，
其中所述的第一亚构建物包括第一启动子、与所述第一启动子可操作地连接的酮基还原酶的编码序列、和终止密码子；
(b)用于生产外源葡萄糖脱氢酶(GDH)的第二亚构建物，
其中所述的第二亚构建物包括第二启动子、与所述第二启动子可操作地连接的酮基还原酶的编码序列、和终止密码子，
其中所述的第一亚构建物和第二亚构建物是相互独立的、或是一体的。
在本发明的一个实例中，将第一亚构建物克隆入一个载体，形成第一载体如pCMBIA1301-HMGR；将第二亚构建物克隆入另一载体，形成第二载体如pBI121-GDH。
在另一优选例中，将二个亚构建物(串联方式连接)克隆入同一载体。
改良方法
本发明还提供了一种对截短侧耳素生产菌株进行改造或改良的方法。包括将本发明所述的构建物引入底盘细胞，从而改善其生产截短侧耳素的能力。
一种优选的方法是通过T-DNA进行转化。T-DNA是根癌农杆菌Ti(tumor—inducing)质粒的一部分，它能够通过根癌农杆菌作用将插入其两边界之间的任何DNA序列整合进基因组中．在没有同源序列的情况下，T-DNA能够进行非同源重组，而产生随机插入。本发明的实验表明，即使对于非植物细胞，也可利用根癌农杆菌转化系统，实现外源辅酶因子双酶偶联组合的转入。
本发明的试验证实，将外源酮基还原酶(KR)和葡萄糖脱氢酶(GDH)基因转入截短侧耳素生产菌株，得到改良后的基因工程菌株，提高截短侧耳素的产量。
截短侧耳素的生产
在本发明中，可采用常规的生产方法，采用常规的培养条件，进行截短侧耳素的生产。
在本发明中，可根据所使用的生产菌，采用本领域常规的培养基、培养条件进行生产。这些培养基等原料可以通过市售方式获得，也可按常规方法进行制备。
在本发明中，对于来源于真菌的底盘细胞，常用的培养基包括(但并不限于)：
斜面培养基(g/L)：土豆180，葡萄糖25，琼脂15，水余量，pH7.0。
种子培养基(g/L)：葡萄糖45，酵母提取物20，MgSO40.3，Ca(NO3)2，0.1，KH2PO40.5，水余量，pH5.0。
发酵基本培养基(g/L)：葡萄糖45，玉米浆粉25，MgSO40.2，CaCO32，豆油3，水余量，pH1.0。
一种常规的培养方法包括：
将菌种接种到斜面培养基上，在35℃培养5天，对菌种进行活化；将活化的菌种接种到种子培养基中，35℃、100r/min下进行一级种子培养，振摇培养5天，然后以5%的接种量将一级种子液在相同的种子培养基、相同条件下进行二级种子培养，培养3天，得二级种子液。按1%接种量转入发酵培养基中，在35℃、500r/min、湿度60%、pH1.0、溶氧为100%的条件下振摇培养10d，得发酵液；将发酵液用甲醇浸提、离心分离得浸提液，浸提液经浓缩、结晶得截短侧耳素。
在本发明中，由于采用新颖的经改良的截短侧耳素生产菌，因此可大幅提高截短侧耳素产量。
本发明的主要优点包括：
(a)截短侧耳素的产量高；
(b)对于生产工艺可不进行修改和调整，因此成本低；
(c)工程菌株改造和遗传操作简便，对底盘细胞无不利影响。
(d)本发明方法的可适用于不同的生产菌株，适用范围广，效率高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
菌株、质粒和基因
根癌农杆菌LBA4404，载体pBI121(购自Invitrogen)，载体pCAMBIA1301，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌(E.coli)DH5α、TG1系中国科学院上海生物工程研究中心保藏；克隆载体PMD-18T和PGH购自英俊生物公司，斜盖菇细胞(Clitopilus prunulus)购自ATCC(保藏号ATCC34646)。
目的基因：3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase，HMGR(L)(NC_016805.1))基因在上海英俊生物技术有限公司合成(PGH-HMGR)，华大基因测序验证。
主要试剂及试剂盒
基因组抽提试剂盒为AXYGEN公司产品；
质粒抽提试剂盒为TIANGEN公司产品；
DNA胶回收试剂盒为TIAGEN公司产品；
其余试剂均为国产分析纯。
培养基
(1)大肠杆菌液体培养基(LB培养基)：
胰化蛋白胨(Tyrptone) 10g/L
酵母粉(Yeast Extract) 5g/L
氯化钠(NaCl) 10g/L
调整pH值到7.0，121℃灭菌20min，室温保存。
(2)大肠杆菌固体培养基(LB固体培养基)：
调整pH值到7.0，121℃灭菌20min，室温保存。
(3)Amp抗性选择平板：LB固体培养基融化后至温度约为60℃时，在超净工作台上加入氨卞青霉素至终浓度为100mg/L，摇匀，然后倒平板，凉干后4℃冰箱中储存备用。
(4)Kan抗性选择平板：LB固体培养基融化后至温度约为60℃时，在超净工作台上加入卡纳霉素至终浓度为100mg/L，摇匀，然后倒平板，凉干后4℃冰箱中储存备用。
潮霉素(HygB)抗性选择平板：LB固体培养基融化后至温度约为60℃时，在超净工作台上加入卡纳霉素至终浓度为60mg/L，摇匀，然后倒平板，凉干后4℃冰箱中储存备用。
(5)YEB培养基：
调整pH值到7.2，121℃灭菌20min，液体培养基室温保存，固体培养基倒平板后4℃冰箱中储存备用。
合成的引物
GDH(B)基因引物(Sma1/Sac1)：
GDHF:5'TCCCCCGGGATGTATACAGATTTAAAA3'(SEQ ID No.:1)
GDHR:5'CGAGCTCTTAGCCTCTTCCTGCTTG3'(SEQ ID No.:2)
HMGR(L)基因引物(BamH1/Sac1)：
GSF：5'CGGGATCCATGAGTAAAAAATTTTATGAAT3'(SEQ ID No.:3)
GSR：5'CGAGCTCTTAATTTTTGGGTTCATTTCTT3'(SEQ ID No.:4)
下划线为酶切位点
实施例1
PBI121及pCAMBIA1301载体制备
1)将购买的分别含PBI121载体和pCAMBIA1301载体的甘油菌分别在Ka抗性的LB平板上及HygB抗性的LB平板上划线
2)37℃培养至有单克隆出现
3)挑取单克隆进行扩大培养
4)用质粒抽提试剂盒进行质粒抽提
5)抽提的质粒进行电泳检测。
实施例2
GDH(B)基因的获得
1)用AXYGEN细菌基因组抽提试剂盒抽提枯草芽孢杆菌的基因组DNA，
步骤如下：
1.用2ml离心管收集1.0×109(1ml菌液OD600为1-1.5)的细菌培养物，12,000×g离心1min，弃尽上清。用150μl已加入RNase A的Buffer S悬浮沉淀。
2.加入20μl溶菌酶贮存液，混合均匀，室温静置5min。
3.加入30μl0.25M EDTA(pH8.0)，混合均匀，冰浴5min。
4.加入450μl Buffer G-A,旋涡振荡15s，65℃水浴10min。
5.加入400μl Buffer G-B和1ml Buffer DV(取2ml Buffer DV-A，125ml异丙醇，75ml异丁醇，加入250ml试剂瓶中，混合均匀，即为Buffer DV。)(4℃预冷)，用力混合，12,000×g离心2min。
6.尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1ml4℃预冷Buffer DV，用力混合，12,000×g离心2min。
7.丢弃上相，将下相转移至滤器(滤器置于2ml离心管中)。12,000×g离心1min。
8.弃滤器，在滤液中加入400μl Buffer BV，混合均匀。
9．将制备管置于2ml离心管中，将步骤8中的混合液移入制备管中，12,000×g离心1min。
10．弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入500μl Buffer W1，12,000×g离心1min。
11．弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入700μl Buffer W2(已加入无水乙醇)，12,000×g离心1min。以同样的方法再用700μl BufferW2洗涤一次。
12．弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，12,000×g离心1min。
13.将制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加100-200ulEluent或去离子水(预热到65℃)，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。
2)将抽提的基因进行电泳检测
3)用合成的引物(GDHF/GDHR)(SEQ ID NO.:1和2)进行PCR扩增
4)将扩增出的基因跑琼脂糖凝胶电泳
5)将目的条带进行切胶回收
6)胶回收后的GDH(B)基因与T载体进行连接，连接体系如下：
16℃水浴，连接过夜
7)将连接产物转化TG1感受态细胞
8)挑单克隆进行菌落PCR鉴定
9)验证正确的单克隆进行扩大培养
10)抽质粒PMD18T-GDH(B)，送华大基因进行测序。
实施例3
PBI121载体和GDH(B)基因连接
1)将PBI121载体和GDH基因分别进行Sma1酶切，酶切体系如下：
PBI121载体酶切：37℃水浴酶切2h
GDH(B)基因酶切：37℃水浴酶切24h
2)将酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳
3)将目的条带切胶回收
4)回收产物分别进行Sac1酶切，酶切体系如下：
37℃水浴，GDH(B)酶切24h，PBI121酶切2h
5)将酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳
6)将目的条带切胶回收
7)回收产物在16℃水浴进行连接，连接体系如下：
8)将连接产物转化TG1感受态细胞
9)挑取单克隆，37℃摇床过夜培养
10)将过夜培养的菌体进行GDH菌落PCR鉴定
11)抽质粒(PBI-GDH(B))
12)取质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测，送华大基因测序验证。
实施例4
HMGR(L)基因的获得
1)合成HMGR(L)引物：HMGR(L)F/HMGR(L)R(SEQ ID NO.:3和4)
2)取合成的质粒基因PGH-HMGR(L)2ul转化入TG1感受态细胞
3)挑单克隆进行菌落，PCR鉴定
4)经过鉴定正确的克隆进行扩大培养
5)抽质粒PGH-HMGR(L)，取质粒送华大基因进行测序验证
6)质粒PCR扩增，获得带酶切位点(BamH1/Sac1)的HMGR基因。
或者，使用引物HMGR(L)F/HMGR(L)R(SEQ ID NO.:3和4)，以用常规方法抽提的肠膜明串珠菌亚种J18(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides Strain J18)基因组DNA为模板，通过PCR获得HMGR(L)基因。
实施例5
pCAMBIA1301载体和HMGR(L)基因连接
1)将pCAMBIA1301载体和HMGR(L)基因分别进行BamH1/Sac1酶切，双酶切体系的缓冲液要求0.5*K buffer；酶切体系如下：
pCAMBIA1301载体酶切：37℃水浴酶切2h
HMGR(L)基因酶切：37℃水浴酶切24h
2)将酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳
3)切目的片段进行胶回收
4)回收产物转化16℃水浴进行连接，连接体系如下：
5)将连接产物转化TG1感受态细胞
6)挑取单克隆，37℃摇床过夜培养
7)将过夜培养的菌体进行GDH菌落PCR鉴定
8)抽质粒pCAMBIA1301-HMGR(L)
9)取质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测，送华大基因测序验证。
结果
1.PBI121载体
抽提出PBI121载体跑琼脂糖凝胶电泳(如图1)，图谱显示质粒为明显的两条带，一条亮带，一条较暗的条带，说明质粒抽提正确，将质粒送华大基因进行测序验证，结果显示质粒序列正确，可以进行后续试验。
2.GDH(B)基因
用基因抽提试剂盒抽提出的GDH(B)基因组跑电泳检测(如图2)，图谱显示为一条带，可以拿来做GDH基因的PCR扩增，扩增产物跑琼脂糖凝胶电泳(如图3)，图谱显示长度正确，将扩增出的条带进行胶回收、连接T载体，转化TG1感受态细胞后进行菌落PCR鉴定(如图4)，图谱显示所挑克隆均为阳性克隆，将单克隆扩大培养后抽质粒(PMD18T-GDH)(如图5)，图谱显示质粒为两条弱带，一条亮带。质粒测序结果显示，与已知的GDH同源性很高，说明该基因确实为GDH(B)基因。
3.PBI121载体与GDH(B)基因连接
PBI121载体和GDH基因分别酶切后跑电泳(如图6)，图谱显示两者都为一条明显的条带，说明酶切效果很好，基因没有切散，可以用作后续试验。目的条带切胶回收后进行连接、转化、菌落PCR鉴定(如图7)，图谱中Marker的长度看不清楚，但是第3号管可能为阳性克隆，将其进行扩大培养后抽质粒PBI-GDH(B)，质粒送华大基因进行测序。测序结果显示，与之前所测GDH(B)基因序列一致，说明重组载体PBI-GDH(B)构建成功(如图12)。
4.HMGR(L)基因
PGH-HMGR(L)转化TG1感受态细胞后挑克隆进行菌落PCR鉴定(如图8)，图谱显示所挑克隆均为阳性克隆，将单克隆扩大培养后抽质粒(PGH-HMGR)(如图9)，图谱显示质粒为两条弱带，一条亮带。质粒测序结果显示，序列与NCBI上公布的肠膜明串珠菌亚种J18(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides Strain J18)的HMGR基因序列一致，说明基因合成正确。质粒进行PCR扩增后进行胶回收(如图9)，图谱显示条带长度正确，可以作为后续试验材料。
4.pCAMBIA1301载体与HMGR(L)基因连接
pCAMBIA1301载体与HMGR(L)分别酶切后跑电泳(如图10)，图谱显示1号为PGH-HMGR(L)载体酶切后的条带，较长的为PGH载体，短的为HMGR基因，2号为PBI121载体酶切后条带，为一条亮的的条带，说明酶切效果很好，基因没有切散，可以用作后续试验。目的条带切胶回收后进行连接、转化、菌落PCR鉴定(如图11)，图谱显示第7和8号管可能为阳性克隆，取7号管菌液进行扩大培养后抽质粒pCAMBIA1301-HMGR(L)，质粒送华大基因进行测序，测序结果显示，与公示的HMGR基因序列一致，说明重组载体pCAMBIA1301载体与HMGR(L)构建成功(如图13)。
实施例6
PBI-GDH(B)和pCAMBIA1301-HMGR(L)转化根癌农杆菌细胞
(1)农杆菌LBA4404甘油保存菌种，接种在YEB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养过夜。
(2)活化过夜的农杆菌按1:50的比例接种在相同的YEB液体培养基中，继续培养至对数生长期。
(3)当OD600=0.5～0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心5min，收集菌体。
(4)用预冷的氯化钙溶液(0.1mol/L)重悬菌体，4℃，8000rpm离心5min，收集菌体。
(5)重复第四步操作。
(6)用8mL预冷的氯化钙溶液重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7%。
(7)冰浴10min后，分装保存于-80℃冰箱中。
(8)从-80℃冰箱中取出LBA4404感受态细胞(100ul)放冰上融化
(9)分别取PBI-GDH(B)和pCAMBIA1301-HMGR(L)载体2ul加入到LBA4404感受态细胞中，冰上放30min
(10)42℃热击90s
(11)冰上放置2-3min
(12)加入700ul LB培养基，30℃、200r摇床复苏培养40min
(13)复苏培养后，取出，3000rpm离心3min
(14)吸出600ul上清液，将剩余液体混匀，分别涂布在Kan抗性和HygB抗性的LB平板上，30℃倒置培养至有转化子出现。
(15)挑取单菌落，经PCR确证获得携带有PBI-GDH(B)和pCAMBIA1301-HMGR(L)载体的菌株LBA4404-PBI-GDH(B)和LBA4404-pCAMBIA1301-HMGR(L)，接种在20ml含100mg/L Kan和50mg/L的YEB液体培养基中，30℃，180rpm振荡培养过夜。
(16)活化过夜的农杆菌按1:50的比例接种在相同的YEB液体培养基中，继续培养至对数生长期。5000rpm离心5min，收集菌体，用YEB液体培养基悬浮至OD600=0.2～0.5，备用。
实施例7
将含PBI-GDH(B)和pCAMBIA1301-HMGR(L)根癌农杆菌分别转化Clitopilusprunulus
将Clitopilus prunulus菌株接种PDA培养基(20%马铃薯汁，2%葡萄糖，0．8%KH2PO4，0.15%MgSO4·7H2O，pH6．0)平板，于30℃培养7～20d，加入10ml无菌生理盐水洗脱孢子，并用IM液体培养基(取1.25mol/L磷酸缓冲液800ul，MgSO4一NaC1缓冲液20ml，10mg/mlCaCl2.2H2O溶液1ml，1mg/ml FeSO.7H2O溶液1ml，微量元素溶液5ml，200mg/ml的葡萄糖溶液2ml，50%甘油10ml，1mol/L MES溶液40ml，200mg/ml葡萄糖溶液5ml，混匀后加入900.7ml无菌水)调整孢子悬液至终浓度为2×107个/ml，留待转化用。
各取100ul YEB培养基悬浮的根癌农杆菌LBA4404-PBI-GDH(B)和LBA4404-pCAMBIA1301-HMGR(L)与上述Clitopilus prunulus孢子悬浮液100ul混合均匀后涂布于含0.2mmol/L乙酰丁香酮的IM培养基平板上，22℃避光培养3d；将培养物转移至含100mg/L卡那霉素和100mg/L潮霉素的PDA培养基平板上，于28℃培养7～10d，待转化子长出后提取基因组DNA进行PCR鉴定表明GDH(R)和HMGR(L)成功转入Clitopilus prunulus。获得Clitopilus prunulus-GDH(B)-HMGR(L)工程菌株。
实施例8
Clitopilus prunulus-GDH(B)-HMGR(L)工程菌株的发酵
1.所用培养基
斜面培养基(g/L)：土豆180，葡萄糖25，琼脂15，水余量，pH7.0。
种子培养基(g/L)：葡萄糖45，酵母提取物20，MgSO40.3，Ca(NO3)2，0.1，KH2PO40.5，水余量，pH5.0。
发酵基本培养基(g/L)：葡萄糖45，玉米浆粉25，MgSO40.2，CaCO32，豆油3，水余量，pH1.0。
2.发酵方法
将菌种接种到斜面培养基上，在35℃培养5天，对菌种进行活化；将活化的菌种接种到种子培养基中，35℃、100r/min下进行一级种子培养，振摇培养5天，然后以5%的接种量将一级种子液在相同的种子培养基、相同条件下进行二级种子培养，培养3天，得二级种子液。按1%接种量转入发酵培养基中，在35℃、500r/min、湿度60%、pH1.0、溶氧为100%的条件下振摇培养10d，得发酵液；将发酵液用甲醇浸提、离心分离得浸提液，浸提液经浓缩、结晶得截短侧耳素。发酵液通过HPLC方法进行检测。
3.结果
检测结果显示发酵液中截短侧耳素的生物效价为13mg/ml，较原始菌株的11mg/ml提高了约18%。
实施例9
截短侧耳素工程菌株的改良
重复实施例1-8，不同点在于，采用不同来源的基因，构建形成不同的双酶偶联组合，并同样导入Clitopilus prunulus，获得改良的截短侧耳素生产菌株。
发酵结果：
采用上述双酶组合的经改良的生产菌株，其发酵液中截短侧耳素的生物效价较原始菌株(11mg/ml)均有不同程度的提高，提高幅度为10-22%不等。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (14)
1.一种基因工程细胞，其特征在于，所述细胞的基因组中整合有构建物；或者所述细胞的基因组中整合有(a)用于表达外源酮基还原酶(KR)的第一表达盒和(b)用于表达外源葡萄糖脱氢酶(GDH)的第二表达盒，
其中所述的第一表达盒包括第一启动子、与所述第一启动子可操作地连接的酮基还原酶的编码序列、和终止密码子；
所述的第二表达盒包括第二启动子、与所述第二启动子可操作地连接的葡萄糖脱氢酶(GDH)的编码序列、和终止密码子，并且所述的细胞是生产截短侧耳素的工程菌，所述构建物包括：
(a)用于生产外源酮基还原酶(KR)的第一亚构建物，
其中所述的第一亚构建物包括第一启动子、与所述第一启动子可操作地连接的酮基还原酶的编码序列、和终止密码子；
(b)用于生产外源葡萄糖脱氢酶(GDH)的第二亚构建物，
其中所述的第二亚构建物包括第二启动子、与所述第二启动子可操作地连接的葡萄糖脱氢酶(GDH)的编码序列、和终止密码子，
其中所述的第一亚构建物和第二亚构建物是相互独立的、或是一体的；
其中，所述的酮基还原酶选自下组：来源于酿酒酵母的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)；来源于黑曲霉的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)；来源于紫杉的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)；来源于双孢蘑菇的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)；来源于肠膜明串珠菌亚种J18(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides Strain J18)的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)。
2.如权利要求1所述的基因工程细胞，其特征在于，所述的葡萄糖脱氢酶(GDH)来源于枯草芽孢杆菌、巨大枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶、酿酒酵母、黑曲霉、紫杉。
3.如权利要求1或2所述的基因工程细胞，所述的葡萄糖脱氢酶(GDH)选自下组：
来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(Glucose DehydrogenaseGDH)；
来源于巨大枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH)；
来源于酿酒酵母的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH)；
来源于黑曲霉的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH)；
来源于紫杉的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH)。
4.如权利要求1所述的基因工程细胞，其特征在于，所述的酮基还原酶和葡萄糖脱氢酶选自下列组合：
来源于酿酒酵母的HMGR与来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH)组合成的HMGR-GDH偶联组合；
来源于黑曲霉的HMGR与来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH)组合成的HMGR-GDH偶联组合；
来源于紫杉的HMGR与来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH)组合成的HMGR-GDH偶联组合；
来源于双孢蘑菇的HMGR与来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH)组合成的HMGR-GDH偶联组合；
来源于肠膜明串珠菌亚种J18(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroidesStrain J18)的HMGR与来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH)组合成的HMGR-GDH偶联组合；
来源于酿酒酵母的HMGR与来源于巨大枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(GlucoseDehydrogenase GDH)组合成的HMGR-GDH偶联组合；
来源于酿酒酵母的HMGR与来源于酿酒酵母的葡萄糖脱氢酶(Glucose DehydrogenaseGDH)组合成的HMGR-GDH偶联组合；
来源于酿酒酵母的HMGR与来源于黑曲霉的葡萄糖脱氢酶(Glucose DehydrogenaseGDH组合成的HMGR-GDH偶联组合；
来源于酿酒酵母的HMGR与来源于紫杉的葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase GDH)组合成的HMGR-GDH偶联组合。
5.如权利要求1所述的基因工程细胞，其特征在于，所述的细胞是底盘细胞。
6.如权利要求5所述的基因工程细胞，其特征在于，所述的细胞为选自下组的高等真菌：
斜盖菇(Clitopilus prunulus)、担子菌侧耳属(Pleurotus mutilus)、截短侧耳素产生斜盖菇(Clitopilus passeckerianus)、猴头菇(Hericium erinaceus)、灵芝(Ganodermalucidum)、云芝(Coriolus versicolor)。
7.一种生产截短侧耳素的方法，其特征在于，包括步骤：
培养截短侧耳素的生产菌，从而产生截短侧耳素；
其中所述的生产菌的基因组中整合有构建物；或者
所述生产菌的基因组中整合有(a)用于表达外源酮基还原酶(KR)的第一表达盒和(b)用于表达外源葡萄糖脱氢酶(GDH)的第二表达盒，
其中所述的第一表达盒包括第一启动子、与所述第一启动子可操作地连接的酮基还原酶的编码序列、和终止密码子；
所述的第二表达盒包括第二启动子、与所述第二启动子可操作地连接的葡萄糖脱氢酶(GDH)的编码序列、和终止密码子；
以及从培养物中分离出截短侧耳素；
其中，所述的酮基还原酶选自下组：来源于酿酒酵母的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)；来源于黑曲霉的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)；来源于紫杉的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)；来源于双孢蘑菇的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)；来源于肠膜明串珠菌亚种J18(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides Strain J18)的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)，所述构建物包括：
(a)用于生产外源酮基还原酶(KR)的第一亚构建物，
其中所述的第一亚构建物包括第一启动子、与所述第一启动子可操作地连接的酮基还原酶的编码序列、和终止密码子；
(b)用于生产外源葡萄糖脱氢酶(GDH)的第二亚构建物，
其中所述的第二亚构建物包括第二启动子、与所述第二启动子可操作地连接的葡萄糖脱氢酶(GDH)的编码序列、和终止密码子，
其中所述的第一亚构建物和第二亚构建物是相互独立的、或是一体的；
其中，所述的酮基还原酶选自下组：来源于酿酒酵母的HMGR；来源于黑曲霉的HMGR；来源于紫杉的HMGR；来源于双孢蘑菇的HMGR；来源于肠膜明串珠菌亚种J18(Leuconostocmesenteroides subsp.mesenteroides Strain J18)的HMGR。
8.一种对截短侧耳素的生产菌进行改造的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)将构建物引入所述的截短侧耳素的生产菌，从而获得经转化的生产菌，其中所述的经转化的生产菌的基因组中整合入所述的构建物，所述构建物包括：
(a)用于生产外源酮基还原酶(KR)的第一亚构建物，
其中所述的第一亚构建物包括第一启动子、与所述第一启动子可操作地连接的酮基还原酶的编码序列、和终止密码子；
(b)用于生产外源葡萄糖脱氢酶(GDH)的第二亚构建物，
其中所述的第二亚构建物包括第二启动子、与所述第二启动子可操作地连接的葡萄糖脱氢酶(GDH)的编码序列、和终止密码子，
其中所述的第一亚构建物和第二亚构建物是相互独立的、或是一体的；
其中，所述的酮基还原酶选自下组：来源于酿酒酵母的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)；来源于黑曲霉的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)；来源于紫杉的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)；来源于双孢蘑菇的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)；来源于肠膜明串珠菌亚种J18(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides Strain J18)的戊二酰单酰辅酶A还原酶(HMGR)。
9.如权利要求8所述的进行改造的方法，其特征在于，在步骤(i)中，通过根癌农杆菌转化法进行转化，从而将所述的构建物引入所述的截短侧耳素的生产菌。
10.如权利要求8所述的进行改造的方法，其特征在于，还包括步骤：
(ii)对经转化的生产菌进行NADPH生产能力或截短侧耳素的生产能力的筛选，从而选出生产能力提高的生产菌。
11.如权利要求8所述的进行改造的方法，其特征在于，包括步骤：
通过根癌农杆菌转化系统，将外源HMGR基因和GDH基因先后或同时转入斜盖菇(Clitopilus prunulus)。
12.如权利要求8所述的进行改造的方法，其特征在于，包括步骤：通过根癌农杆菌表达系统将不同来源葡萄糖脱氢酶基因转入到根癌农杆菌中，即将GDH基因与根癌农杆菌的表达载体PBI121构建重组载体，然后转入到根癌农杆菌中；
通过携带有重组载体PBI-GDH的根癌农杆菌与斜盖菇(Clitopilus prunulus)共培养转化GDH至受体细胞斜盖菇(Clitopilus prunulus)中，获得携带有外源GDH的Clitopilusprunulus-GDH菌株。
13.如权利要求8所述的进行改造的方法，其特征在于，包括步骤：
通过根癌农杆菌表达系统将不同来源HMGR基因转入到根癌农杆菌中，即将HMGR基因与根癌农杆菌的表达载体pCAMBIA1301构建重组载体，然后转入到根癌农杆菌中；
通过携带有重组载体pCAMBIA-HMGR的根癌农杆菌与携带有外源GDH的Clitopilusprunulus-GDH共培养转化HMGR至受体细胞Clitopilus prunulus-GDH中，获得携带有外源GDH和HMGR的Clitopilus prunulus-GDH-HMGR工程菌株。
14.一种经改良的工程菌，其特征在于，是经权利要求8所述方法改造所获得。
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