CN104267136A

CN104267136A - 鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法

Info

Publication number: CN104267136A
Application number: CN201410539422.6A
Authority: CN
Inventors: 谭建华; 李慧勇; 席绍峰; 郭长虹; 谢文缄; 王继才; 熊小婷; 赵田甜; 张可冬
Original assignee: GUANGZHOU QUALITY SUPERVISION AND TESTING INSTITUTE
Current assignee: GUANGZHOU QUALITY SUPERVISION AND TESTING INSTITUTE
Priority date: 2014-10-13
Filing date: 2014-10-13
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2034-10-13
Also published as: CN104267136B

Abstract

本发明公开了一种鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法，步骤为：取样品，甲醇溶解，加1.8-2.2％甲酸溶液，得A液；取PAX固相萃取柱甲醇、水活化平衡，上样，4.5-5.5％氨水溶液和甲醇淋洗，1.8-2.2％甲酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，吹干，复溶，过滤，将滤液用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱进行测定，其中，色谱柱：CSH C₁₈；流动相：A为0.0015％-0.0025％甲酸水溶液，B为甲醇；梯度洗脱。该方法可对育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶的功效成分(槲皮苷、何首乌苷和芦丁)进行定性定量检测，结果准确可靠。

Description

鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法

技术领域

本发明涉及化妆品分析领域，特别是涉及一种鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法。

背景技术

脱发是临床常见疾病，虽然不属严重疾病，但是有碍容颜，影响美观，常给患者带来巨大的精神压力和心理负担。随着人们对于脱发越来越重视，育发化妆品的市场需求急剧增加，各类新型育发化妆品产品的层出不穷。据查询，目前在我国国家食品药品监督管理局所登记育发化妆品特证备案的国产化妆品近450种，其中大部分产品以中草药植物提取液为主要功效成分。

侧柏、何首乌和桑叶是常见的中草药植物，它们的育发作用已被大量研究所证实，目前已被广泛用于各种具有育发作用的化妆品中。依据中华人民共和国药典第一部(2010版)，选择槲皮苷、何首乌苷和芦丁分别作为与侧柏、何首乌和桑叶的药材或提取液相对应的功效成分。然而，虽然目前关于功效成分槲皮苷QR(式Ⅰ)、何首乌苷THS-GLU(式Ⅱ)和芦丁RT(式Ⅲ)的检测技术研究报道众多，主要采用高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法等，但由于育发化妆品中三功效成分的含量较低，且育发化妆品基质复杂，特别是育发洗发液类产品中含有大量的各类表面活性剂等基质，故现有的检测方法不适于育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶的功效成分槲皮苷、何首乌苷和芦丁的鉴定；而由于缺乏相关功效检测方法及鉴定技术，假冒伪劣、虚假宣传等不良现象充斥着整个育发化妆品行业，严重影响消费者对于中草药植物育发化妆品的信心。因此，为了督促企业加强产品质量控制，提升育发化妆品行业的质量水平，亟需建立相应的检测方法标准对育发化妆品进行植物提取液功效成分的鉴定。

发明内容

基于此，本发明以槲皮苷、何首乌苷和芦丁为检测对象，主要采用固相萃取技术对样品进行有效净化，利用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF)所提供的保留时间和精确质量数对样品中的三种功效成分进行确证检测，建立了快速、准确鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法。

解决上述技术问题的具体技术方案如下：

一种鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法，包括如下步骤：

(1)预处理：称取0.4-0.6g样品，甲醇溶解，定容至10ml，离心，取上清液，过滤，取1-2ml滤液，加8-9ml体积分数为1.8-2.2％的甲酸水溶液，得A液；

(2)固相萃取：取PAX固相萃取柱用甲醇、水活化平衡，将A液通过PAX固相萃取柱，依次用体积分数为4.5-5.5％的氨水溶液和甲醇淋洗，再用体积分数为1.8-2.2％的甲酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干，加1-1.5ml体积分数为48-52％的甲醇水溶液复溶，过滤，得供试品溶液；

(3)测定：将供试品溶液用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱进行测定，条件如下：

色谱条件：

色谱柱：CSH C₁₈，规格为2.1×50mm,1.7μm；

进样体积：4-6μL；

流速：0.3-0.5ml/min；

流动相A：体积分数为0.0015％-0.0025％的甲酸水溶液，流动相B：甲醇；梯度洗脱程序：0-3min，20％-40％B，3-5min，20％B；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源，负离子模式；

锥孔电压：30-40V。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述的甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.002％。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述的锥孔电压为35V。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述的PAX固相萃取柱的规格为500mg/6mL。

在其中一些实施例中，将步骤(2)所述的洗脱液于40℃水浴条件下氮吹至近干。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述的预处理为：准确称取0.4-0.6g样品，用甲醇溶解，并定容至10ml，以转速9000-11000r/min离心，取上清液，PVDF滤膜过滤，取1ml滤液，加9ml体积分数为2％的甲酸水溶液，得A液。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述的固相萃取为：取500mg/6mL的PAX固相萃取柱用5-7mL甲醇、5-7mL水活化平衡，将A液以不高于1mL/min的流速通过PAX固相萃取柱，依次用6-8mL体积分数为5％的氨水溶液和10-12mL的甲醇淋洗，4×3mL体积分数为2％的甲酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干，加1ml体积分数为50％甲醇水溶液复溶，过滤，得供试品溶液。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述的色谱条件中：进样体积：5μL；流速：0.4mL/min；流动相A：体积分数为0.002％的甲酸水溶液。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述的质谱条件中毛细管电压：2.4-2.6KV；脱溶剂气温度：445-455℃；离子源温度：95-105℃；脱溶剂气流速：590-610L/h；锥孔气流速：45-55L/h；四极杆采集质量数范围：100～1000u。

在其中一些实施例中，所述的质谱条件中数据采集模式：棒状；扫描采集时间：0.2s；TOF运行模式：V模式。

本发明所述的一种鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶功效成分的方法具有以下优点和有益效果：

本发明经发明人大量的实验和研究，得出鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的最佳方法和条件，该方法以侧柏、何首乌和桑叶的功效成分槲皮苷、何首乌苷和芦丁为检测对象，主要采用固相萃取技术对基质复杂的育发化妆品，特别是含高表面活性剂和油脂的育发化妆品进行有效净化，并结合超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱法，确定了所用固相萃取技术的最佳萃取柱及最佳上样方式，同时对色谱-质谱中流动相的组成及质谱参数也进行了优化，并通过线性与方法检出限、回收率、精密度等实验，得出：采用本发明所述方法，三种目标物质在5～250μg·L^-1浓度范围内均呈良好线性，相关系数大于0.999；方法检出限为0.01～0.04mg·kg^-1；定量限为0.03-0.1mg·kg^-1；在阴性洗发乳基质中的加标回收率为80.9％～104.7％，相对标准偏差小于19.2％。该方法前处理净化效果好、检测限低且结果准确度高、重复性好，非常适用于育发化妆品(特别是高含量表面活性剂及油脂)中侧柏、何首乌和桑叶中的功效成分槲皮苷、何首乌苷和芦丁的定性定量检测。

附图说明

图1为三种目标物在不同上样方式条件下的回收率比较图；

图2为流动相中不同的甲酸浓度对响应丰度的影响图；

图3为质谱条件中不同锥孔电压对响应丰度的影响图；

图4A为槲皮苷的提取离子质谱图；

图4B为芦丁的提取离子质谱图；

图4C为何首乌苷的提取离子质谱图。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

一、实验仪器、材料和试剂

主要仪器：超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱仪(美国Waters公司)；

高速冷冻离心机(Allegra64R,Beckman)；

MS3basic漩涡混合器(德国IKA公司)；

BG-02C型超声波发生器(广州邦洁超声设备有限公司)；

24孔位固相萃取装置(上海安谱有限公司)；

超纯水系统(Milli-Q，美国Millipore公司)；

PVDF滤膜(直径25m,孔径0.2μm,美国Agilent公司)；

HLB固相萃取柱(美国Waters公司,200mg/6mL)；

PAX固相萃取柱(美国Agilent公司,500mg/6mL)。

主要试剂：甲醇、乙腈(HPLC级，Fisher Scientific)；甲酸、氨水、磷酸氢二钠(分析纯，上海安谱公司)；

何首乌苷(THS-GLU)、芦丁(RT)、槲皮苷(QR)标准品，纯度大于99.0％，均购自上海诗丹德生物技术有限公司。

二、实验方法

2.1 标准溶液的配制

分别称取标准品10.0mg(精确至0.01mg)于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成1g/L的单标标准储备液。分别吸收适量标准储备液，用甲醇配制成所需系列混合标准工作溶液，4℃避光保存。

2.2 样品的制备与提取

准确称取0.5g(精确至0.001g)试样于10mL具塞比色管中，用甲醇定容至刻度后，于漩涡振荡器上混合使样品分散1min，超声提取15min，取上清液于离心管中10000r/min离心5min，用PVDF滤膜后，再准确量取1mL清液，加入9mL2％甲酸水溶液(v/v)，混匀，得A液，待固相萃取净化。

2.3 固相萃取净化

PAX固相萃取柱先用6mL甲醇、6mL水活化平衡。将A液以不高于1mL/min的流速通过萃取小柱后，依次用6mL5％(体积分数)氨水溶液和10mL甲醇淋洗，4×3mL2％(体积分数)甲酸甲醇溶液洗脱。洗脱液于40℃水浴中氮吹至近干，加1mL50％(体积分数)甲醇水溶液复溶，过滤，得供试品溶液，待测。(注：可根据样品中功效成分含量调整复溶液体积)

2.4 色谱-质谱条件

2.4.1 色谱条件

色谱柱：CSH C₁₈(2.1×50mm,1.7μm,waters)；柱温：30℃；进样体积：5μL；流速：0.4mL/min；流动相：A为0.002％(体积分数)甲酸水溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0～3min，20％～40％B，3～5min，20％B。

2.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI),负离子模式；毛细管电压：2.5KV；锥孔电压：35V；脱溶剂气温度：450℃；离子源温度：100℃；脱溶剂气流速：600L/h；锥孔气流速：50L/h；四极杆采集质量数范围：100～1000u。数据采集模式：棒状(centroid)；扫描采集时间：0.2s；TOF运行模式：V模式；以200pg/μL亮氨酸脑啡肽(m/z＝554.2615)溶液进行实时校准。

2.5 线性与方法检出限

分别配制质量浓度为5.0～250μg·L^-1的系列标准溶液，在本方法实验条件下，对目标化合物进行测定，根据其色谱峰面积积分值(Y)和相应的质量浓度(X,μg·L^-1)响应关系，得线性回归方程及相关系数。

2.6 方法回收率和精密度

选用阴性洗发乳为加标基质，按本试验条件进行0.1、1.0和2.0mg/kg三个添加水平的回收率与精密度试验。

2.7 实际样品的测定

采用本方法对10份育发化妆品产品，包括洗发乳、精华液等产品，其中7份产品标称含有何首乌提取物，4份产品标称含有侧柏叶提取物，1份样品标称含有桑叶提取物(部分产品同时标称含有多种提取物)，进行何首乌苷、芦丁和槲皮苷成分的鉴定检测。

三、实验结果

3.1 固相萃取方法的优化

3.1.1 固相萃取小柱的优化

通过研究表明：由于育发化妆品特别是育发洗发产品中含有大量的表面活性剂(如十二烷基硫酸铵、月桂醇聚醚硫酸酯钠等)，而这些表面活性剂非常容易电离，能在ESI源上与目标物竞争，从而造成严重的离子抑制。而且，由于表面活性剂的含量很高，容易在液相进样系统、色谱管路、色谱柱及离子源上残留，造成质谱的持续污染。因此，此类样品需要经过净化才能进入质谱分析，发明人通过大量的实验，得出采用固相萃取方法对育发化妆品进行处理，净化效果良好，固相萃取柱筛选原理如下：

由于三种功效成分均具有酚羟基的苯环化学结构，能显示出弱酸性和弱反相保留能力(pKa和Log P值见表1)，故本实施例研究比较了两种不同填料类型的固相萃取小柱(HLB、PAX)的净化效果。实验结果显示，反相保留为主的HLB小柱能同时对三种功效成分、阴离子表面活性剂和油脂进行保留，但无法将各杂质进行分离而去除；PAX柱属于混合型强阴离子交换柱，同时具有强阴离子交换能力和反相保留能力。三种功效成分的酚羟基在碱性条件下离子化成较为稳定的酚羟基负离子，能与PAX柱上的强阴离子交换树脂进行弱吸附，通过甲醇淋洗萃取柱能将中性、碱性的具反相保留的杂质(油脂等)去除。同时，样品中常见的阴离子表面活性剂属强阴离子表面活性剂，能在任何条件下与PAX柱发生强吸附。因此，三种功效成分在酸性甲醇条件被洗脱时，阴离子表面活性剂类杂质仍在PAX柱上保留而被去除。因此，本实施例采用PAX柱对样品提取液进行净化，取得了非常好的去除基质效果。

表1 三种植物功效成分及其化学性质

本实施例还比较了不同规格的PAX柱(60mg/3mL、150mg/6mL和500mg/6mL)的净化效果。实验发现，由于离子交换柱的交换容量一般较小(约为0.6-0.9meq/g)，而洗发液中的阴离子表面活性剂的含量可能达到5％甚至以上，导致在本方法的稀释倍数下，阴离子表面活性剂在60mg/3mL和150mg/6mLPAX柱上因吸附过载而被洗脱。因此，本研究采用500mg/6mL的PAX柱。

3.1.2 上样方式的优化

通过比较不同上样方式条件，研究三种功效成分的在固相萃取小柱上的保留吸附行为，以确定最佳的上样方式。

分别采用以下四种方式上PAX柱净化：

①取1mL甲醇提取液加20μL氨水，混匀上样；

②取1mL甲醇提取液加1mL5％氨水溶液(v/v)，混匀，上样；

③取1mL甲醇提取液加9mL5％氨水溶液(v/v)，混匀，上样；

④取1mL甲醇提取液加9mL2％甲酸水溶液(v/v)，混匀，上样后，萃取柱上加5mL5％氨水锁定。

四种方式上样后，PAX柱均再采用甲醇淋洗，2％甲酸甲醇洗脱。

加标试验结果显示，三种功效成分随化学性质的不同，其回收率受上样方式的影响情况不同。芦丁和槲皮苷的pKa均为6.43(见表1)，酚羟基酸性较强，在碱性条件下很容易失去一个质子形成稳定的酚羟基负离子，能与PAX填料发生较强的吸附，因此在四种上样方式条件下均具有较理想的回收率。何首乌苷的pKa值为9.20，Log P值分别为0.83，酚羟基酸性较弱。何首乌苷的反相保留和离子交换吸附较弱，在较高甲醇比例的上样溶液①中能大部分锁定在PAX填料上。但是，随着氨水溶液比例的增加，何首乌苷的回收率在下降，在进样方式④中的回收率降至45％，上样过柱液和甲醇淋洗液中也未见何首乌苷被洗脱。尝试增加洗脱溶液中甲酸的比例以及更换反相洗脱能力更强的乙腈、二氯甲烷等酸化溶剂进行洗脱均未成功。这可能是因为在有氨水的水溶液条件下，何首乌苷会与PAX填料发生某种不可逆的吸附，导致少量何首乌苷无法洗脱。这种吸附随着氨水溶液的比例上升而增加。采用④的上样方式，由于同样必须采用氨水锁定，何首乌苷也有部分损失，回收率在85％左右，但是仍然能够基本能满足鉴定方法要求(三种目标物质在不同上样方式下的回收率比较图见图1)。因此，本研究中采用④的上样方式。

3.2 色谱-质谱条件的优化

3.2.1 色谱条件的优化

经研究表明：三种功效组分在ESI-模式下具有较强的离子响应，所以本实施例在ESI-模式下对色谱和质谱参数进行了系统的优化。而由于三种功效组分的化学结构均具有多个酚羟基，因此，本实施例选择甲醇和水为流动相，且在水相中添加少量的甲酸以得到理想的色谱峰形。而进一步的试验发现，水相流动相中的甲酸会对目标物产生离子抑制。本实施例比较了水相中不同体积浓度的甲酸水溶液(0.002％，0.005％，0.010％，0.020％，0.04％)对目标物的抑制情况。结果发现：随着甲酸浓度的升高，三种功效组分的响应均呈下降趋势(见图2)。综合考虑流动相的稳定性和方法的灵敏度，本实施例采用甲醇-0.002％甲酸水溶液为流动相。

3.2.2 质谱条件的优化

Q-TOF的质谱参数有毛细管电压，锥孔电压，萃取电压，离子源温度和雾化气流量等等，其中锥孔电压对于不同目标物的灵敏度影响最大。Q-TOF一般采用全扫模式，因此无法针对每个离子对设置单独的锥孔电压。本研究选择各目标物的准分子离子峰[M-H]^-在优化好其他质谱参数的条件下，比较了不同锥孔电压条件(25、35、45、55V)下各目标物准分子离子峰的响应丰度。结果显示，三种功效成分的灵敏度受锥孔电压变化的影响各不相同(见图3)。综合考虑三种功效成分的灵敏度差异，本研究选用锥孔电压为35V进行试验。

另外，本研究分别以准分子离子峰为母离子，通过优化碰撞电压(Trap CEvoltage)，利用氩气碰撞产生碎片离子进行二级质谱扫描，得到各化合物一个丰度最高的稳定碎片离子作为定性确证依据。表2列出了各化合物的质谱参数，保留时间，精确分子量以及通过MassLynx软件中Elemental Composition计算分析得到的理论分子量和质量精确度。结果显示，本研究得到的分子质量准确度非常高，与理论值的误差均在5ppm以内。

表2 目标化合物的质谱参数，保留时间，精确分子量，理论分子量和质量精确度

3.3 线性与方法检出限

本实施例采用基质样品加标，通过计算其标样的响应与背景噪音的比值(S/N＝3)确定方法检出限，(S/N＝10)确定方法定量限，得到三种功效组分的方法检出限(LOD)和方法定量限(LOQ)结果见表3，从表3可知：在5.0～250μg·L^-1范围内，3种目标物的线性关系良好，R²均在0.999以上，见表3。

表3 目标物的线性方程、线性范围、相关系数和方法检出限和定量限

3.4 方法回收率和精密度

回收率与精密度试验结果见表4，结果显示：三个浓度添加水平的回收率为80.9％～104.7％，相对标准偏差小于19.2％，表明方法能满足育发化妆品中三种功效成分的鉴定要求。

表4 回收率和精密度测定结果(n＝6)

3.5 实际样品的测定

实验结果显示，样品中各功效成分实际检出率：何首乌苷为29％，槲皮苷为50％，芦丁为100％，含量范围为<LOD-27.6mg/kg，典型育发化妆品实际样品的提取离子质谱图见图4A-图4C。

四、结论

本研究采用阴离子交换固相萃取技术结合超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF)建立了同时鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶中槲皮苷、何首乌苷和芦丁三种功效成分的定性定量检测方法。通过对固相萃取方法和色谱-质谱条件的优化，成功解决了育发洗发液中高含量表面活性剂所造成的基质干扰问题，大大提高了方法的灵敏度和适用性，该方法成功应用于市售中草药育发化妆品的实际检测工作。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：

色谱条件：

色谱柱：CSH C₁₈，规格为2.1×50mm,1.7μm；

进样体积：4-6μL；

流速：0.3-0.5ml/min；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源，负离子模式；

锥孔电压：30-40V。

2.根据权利要求1所述的鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法，其特征在于，步骤(3)所述的甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.002％。

3.根据权利要求1或2所述的鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法，其特征在于，步骤(3)所述的锥孔电压为35V。

4.根据权利要求1或2所述的鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法，其特征在于，步骤(2)所述的PAX固相萃取柱的规格为500mg/6ml。

5.根据权利要求1或2所述的鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法，其特征在于，将步骤(2)所述的洗脱液于40℃水浴条件下氮吹至近干。

6.根据权利要求1或2所述的鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法，其特征在于，步骤(1)所述的预处理为：准确称取0.4-0.6g样品，甲醇溶解，定容至10ml，以转速9000-11000r/min离心，取上清液，PVDF滤膜过滤，取1ml滤液，加9ml体积分数为2％的甲酸水溶液，得A液。

7.根据权利要求1或2所述的鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法，其特征在于，步骤(2)所述的固相萃取为：取500mg/6ml的PAX固相萃取柱用5-7mL甲醇、5-7mL水活化平衡，将A液以不高于1ml/min的流速通过PAX固相萃取柱，依次用6-8ml体积分数为5％的氨水溶液和10-12ml的甲醇淋洗，4×3ml体积分数为2％的甲酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干，加1ml体积分数为50％的甲醇水溶液复溶，过滤，得供试品溶液。

8.根据权利要求1或2所述的鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法，其特征在于，步骤(3)所述的色谱条件中：进样体积：5μL；流速：0.4ml/min；流动相A为体积分数0.002％的甲酸水溶液。

9.根据权利要求1或2所述的鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法，其特征在于，步骤(3)所述的质谱条件中毛细管电压：2.4-2.6KV；脱溶剂气温度：445-455℃；离子源温度：95-105℃；脱溶剂气流速：590-610L/h；锥孔气流速：45-55L/h；四极杆采集质量数范围：100-1000u。

10.根据权利要求9所述的鉴定育发化妆品中侧柏、何首乌和桑叶类功效成分的方法，其特征在于，所述的质谱条件中数据采集模式：棒状；扫描采集时间：0.2s；TOF运行模式：V模式。