CN106908529A - 一种解决超高效液相色谱电喷雾质谱上发生氧化反应问题的方法 - Google Patents

一种解决超高效液相色谱电喷雾质谱上发生氧化反应问题的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种解决超高效液相色谱电喷雾质谱上发生氧化反应问题的方法。它是在超高效液相色谱电喷雾质谱的流动相中加入(NH4)2S作为还原剂，以此流动相进行洗脱。采用本发明所述方法，黄芩苷在UPLC‑ESI‑MS系统中的氧化率显著降低，仅用以30％流动相A(1mmol/L的(NH4)2S溶液)等浓度洗脱时(400μL/min)，黄芩苷在UPLC‑ESI‑MS系统中的氧化率就可从60％左右降至不可观测。本发明的方法还原效率高、简便实用、成本低廉，且因为(NH4)2S是一种易分解性盐，在ESI源上易分解，不会污染离子源，对分析物没有离子抑制，还能显著提高分析物的质谱信号。

Description

一种解决超高效液相色谱电喷雾质谱上发生氧化反应问题的 方法
技术领域：
本发明属于超高效液相色谱质谱仪器分析领域，特别是涉及一种解决易氧化分析物在超高效液相色谱电喷雾质谱上氧化反应问题的方法。
背景技术：
超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)是近十多年来迅速发展起来的高通量分析技术，已经广泛应用于环境科学、药物研发、临床化学、蛋白质组学、代谢组学、疾病诊断、营养食品科学、毒理学及天然产物化学等领域。UPLC-MS已经成为多类分析实验室普遍使用的检测技术，主要用于检测极性和中等极性有机化学物。UPLC-MS由产生和耐受超高压的液相色谱系统和质谱检测器组成，UPLC的核心是超高效液相色谱柱和耐高压液相泵。超高效液相色谱柱的填料颗粒直径一般在2.0μm以下，最先进的色谱柱填料直径已达到1.7μm。超高效液相色谱柱具有远超普通液相色谱柱的柱效，具有强大的分离能力，能在短时间内达到良好的分离效果，使分析效率得以显著提高。UPLC-MS的接口一般有电喷雾离子源(ESI)、大气压化学电离源(APCI)和大气压光学电离源(APPI)三种，其中以ESI源的应用最为普遍。UPLC与MS的结合具有快速、高效和可靠的分析能力，已经成为分析各类化合物的黄金法则。然而，具有强大分析能力的UPLC-MS也并不是完美无缺的，该技术隐藏着一些缺陷。例如，一些易氧化和易还原的化合物可能会在ESI源上发生氧化还原反应(Kanev IL,Mikheev AY,Shlyapnikov YM,Shlyapnikova EA,Morozova TY,Morozov VN.Anal.Chem.2014,86,1511-1517；Pasilis SP,Kertesz V,Van Berkel GJ.Anal.Chem.2008,80,1208-1214；Boys BL,Kuprowski MC,Noe JJ,Konermann L.Anal.Chem.2009,81,4027-4034.)，从而导致检测信号的降低或对化合物鉴定造成误判。此外，使用UPLC-MS时，UPLC柱能产生强大的剪切力，可导致大分子化合物如聚合物断链，从而影响分析结果(Uliyanchenko E,Van der Wal S,Schoenmakers PJ.2011,1218,6930-6942；Uliyanchenko E,Cools PJ,van der Wal S,Schoenmakers PJ.Anal.Chem.2012,84,7802-7809.)。
最近，我们在一项研究中首次发现，UPLC能导致还原性分析物在UPLC柱上发生氧化反应(图1)，造成分析物信号降低和不稳定，进而导致定量分析不能进行，定性分析也有误判的风险。在该研究中，我们已经确证了氧化反应发生在UPLC柱的出口筛板上(Tang C,Tan J,Jin J,Xi S,Li H,Xie Q,Peng X.Rapid Commun.Mass Spectrom.2015,29,1863-1873.)。
发明内容：
本发明的目的是提供一种解决超高效液相色谱电喷雾质谱上发生氧化反应问题的方法。
本发明的解决超高效液相色谱电喷雾质谱上发生氧化反应问题的方法，其特征在于，在超高效液相色谱电喷雾质谱的流动相中加入(NH4)2S作为还原剂，以此为流动相进行洗脱。
优选：所述的方法包括以下步骤：
a、配置还原剂溶液：取(NH4)2S，用水配置至1mmol/L的(NH4)2S溶液，以此作为流动相A；
b、色谱条件：
超高效液相色谱仪：AcquityTM Waters UPLC；
色谱柱：Waters公司生产的各类UPLC柱；
流动相：流动相A为1mmol/L的(NH4)2S溶液，流动相B为甲醇或乙腈；
c、质谱条件：
质谱仪：Waters Synapt Q-TOF质谱
离子源：电喷雾离子源，正或负离子模式；
毛细管电压：2.5KV；
锥孔电压：50V；
脱溶剂气温度：400℃；离子源温度：100℃；脱溶剂气流速：600L/h；锥孔气流速：50L/h；四极杆采集质量数范围：100-1000u。
本发明的有益效果如下：
本发明经发明人大量的实验，得出解决超高效液相色谱电喷雾质谱上氧化反应问题最佳方法和条件，该方法以一种易氧化的多酚类天然产物黄芩苷为示例化合物，利用在流动相中加入还原剂(NH4)2S的方法，抑制易氧化分析物在UPLC柱上的氧化反应，或者在ESI源上将分析物在UPLC柱上氧化后的产物还原至原始形态，联合Q-TOF-HRMS技术对氧化产物和分析物进行确证，测定分析物在无还原剂条件下和有还原剂条件下的UPLC-ESI-MS上的氧化反应比率。得出：采用本发明所述方法，黄芩苷在UPLC-ESI-MS系统中的氧化率显著降低，仅用以30％流动相A(1mmol/L的(NH4)2S溶液)等浓度洗脱时(400μL/min)，黄芩苷在UPLC-ESI-MS系统中的氧化率就可从60％左右降至不可观测。本发明的方法还原效率高、简便实用、成本低廉，且因为(NH4)2S是一种易分解性盐，在ESI源上易分解，不会污染离子源，对分析物没有离子抑制，还能显著提高分析物的质谱信号。
附图说明：
图1为分析物在UPLC柱上发生氧化反应的示意图；
图2为(NH4)2S抑制分析物在UPLC柱上发生氧化反应及在ESI源中发生还原反应的示意图；图3为黄芩苷在无还原剂条件下和有还原剂条件下的UPLC-ESI-MS上的氧化反应产物及原形化合物质谱图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：解决黄芩苷在超高效液相色谱电喷雾质谱上发生氧化反应问题的方法
本实施例以黄芩苷为检测对象，通过在流动相中加入还原性盐的方法抑制分析物在UPLC-ESI-MS上的氧化反应，或在ESI源上将在UPLC柱上产生的黄芩苷氧化物还原至黄芩苷，并利用ESI-QTOF-MS监测黄芩苷和黄芩苷氧化物，以分析黄芩苷在UPLC-ESI-MS上的氧化率和(NH4)2S在UPLC-ESI-MS上对黄芩苷氧化反应的抑制效率。
其具体方案如下：
一、实验仪器与装置
超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱仪：美国Waters公司产品，配有电喷雾离子源(ESI)及Masslynx数据处理系统；
Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司产品。
二、主要材料与试剂
黄芩苷标准品：纯度≥98％，上海诗丹德生物技术有限公司产品；
(NH4)2S溶液：(S％≥8％)，广州化学试剂厂；
乙腈：色谱纯，美国Thermo Fisher公司产品；甲酸：色谱级，上海安谱公司产品；甲醇：色谱纯，美国Thermo Fisher公司产品。
称取黄芩苷标准品10.0mg(精确至0.01mg)于玻璃瓶中，用甲醇溶解，配成1mg/mL的单标标准储备液，于-20℃冰箱保存。吸取适量标准储备液，用甲醇/水(1:1,v/v)溶液配制成所需黄芩苷标准溶液(浓度为1μg/mL)，配好后立即使用。
三、实验方法
1、配置(NH4)2S稀溶液
用移液枪准确吸取市售(NH4)2S溶液，加入超纯水稀释至1mmol/L，摇匀得(NH4)2S稀溶液，用作UPLC流动相A。
2、检测
取1.5mL黄芩苷标准溶液(1μg/mL)加入2mL的进样小瓶中，置于UPLC的样品盘上；以1mmol/L的(NH4)2S溶液为流动相A(以不含(NH4)2S的超纯水作为流动相作为对照)；启用UPLC-MS，进样分析黄芩苷溶液。
超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱工作条件如下：
2.1色谱条件
色谱柱：BEH C18UPLC柱(2.1×50mm,1.7μm,Waters)；柱温：30℃；进样体积：5μL；流速：400μL/min；流动相：A为1mmol/L的(NH4)2S溶液，B为乙腈；等度洗脱程序：体积分数30％A。
2.2质谱条件
离子源：电喷雾离子源(ESI)，正或负离子模式；毛细管电压：2.5KV；锥孔电压：50V；脱溶剂气温度：400℃；离子源温度：100℃；脱溶剂气流速：600L/h；锥孔气流速：50L/h；四极杆采集质量数范围：100～1000u。数据采集模式：棒状(centroid)；扫描采集时间：0.2s；TOF运行模式：V模式；以200ng/mL亮氨酸脑啡肽(m/z＝554.2615)溶液进行实时校准。
四、结果与讨论
4.1UPLC-MS上的氧化反应对分析结果的影响
如图1所示，黄芩苷在UPLC柱上能发生氧化反应，生成带邻苯醌结构的化合物。一半以上的黄芩苷都被氧化成了邻苯醌类化合物，而且反应的比率还不稳定，这样就导致黄芩苷的定量分析结果显著变差，甚至由此不能进行定量分析；另外，在定性分析中，这种氧化反应也可能导致误判的鉴定结果，即把黄芩苷在UPLC柱上的氧化产物当作实际样品中的化合物；尤其是在色谱分离能力不够的情况下，这种误判更容易发生。
4.2流动相中加入还原剂(NH4)2S对UPLC-MS上的氧化反应的影响
如图2和图3所示，在流动相中加入还原剂(NH4)2S后，黄芩苷在整个UPLC-ESI-MS系统中的氧化反应比率显著下降，用ESI-MS几乎不能检测到黄芩苷氧化物的母离子，氧化产物子离子的相对信号强度也非常低。这说明流动相中的还原剂(NH4)2S能有效地抑制黄芩苷的氧化反应，或将黄芩苷氧化物还原至黄芩苷。如图3所示，在没有还原剂的条件下，黄芩苷在UPLC-ESI-MS系统中的氧化比率为59.2％；而以1mmol/L的(NH4)2S溶液为流动相A时，黄芩苷在UPLC-ESI-MS系统中的氧化比率急剧下降至不可观测。
4.3还原剂种类对还原效率的影响
本发明还试用其他的还原剂，包括维生素C、氢醌、多巴胺、儿茶酚、邻苯二胺、五倍子酸丙酯、间苯二酚、甲醛和间苯三酚。其中维生素C、氢醌、多巴胺、儿茶酚、邻苯二胺和五倍子酸丙酯都能降低黄芩苷在UPLC-ESI-MS系统中的氧化比率，在相同物质的量浓度下，维生素C、邻苯二胺和五倍子酸丙酯还原黄芩苷氧化物的效率还比较高，然而都没能超过(NH4)2S在ESI源上对黄芩苷氧化物的还原效率。
4.3最高效、最适用还原剂的选择
本发明最终挑选(NH4)2S为解决UPLC-ESI-MS上的氧化反应问题的还原剂，因为(NH4)2S被证明为最高效、最适用的还原剂。尽管维生素C、氢醌、多巴胺、儿茶酚、邻苯二胺和五倍子酸丙酯等还原剂也都能比较有效地解决发生在UPLC-ESI-MS上的氧化反应问题，但是它们的还原效率明显不如(NH4)2S。其次，(NH4)2S能在ESI源(400℃)中分解为气体，因而不会在ESI源中沉积；而其他还原剂都是分子量相对于(NH4)2S较大的有机物，不大可能在ESI源中分解成气体，因而可能会在ESI源中沉积，可能会污染离子源和堵塞喷雾针。最后，(NH4)2S被发现一般不会对分析物产生离子抑制效应，相反，在负ESI源条件下，它还能促进分析物的离子化，提高分析物的质谱信号；其他还原剂本身能在ESI源中离子化，因而会跟分析物竞争离子化，一般酸性还原剂会在负ESI源中抑制分析物离子化，碱性还原剂会在正ESI源中对分析物有离子抑制作用。
4.4结论
本实施例通过在流动相中加入低浓度还原剂(NH4)2S的方法解决了黄芩苷在UPLC-ESI-MS系统中的氧化反应问题。该方法优选(NH4)2S为最高效、最适用的还原剂，1mmol/L的(NH4)2S稀溶液为流动相，即可将黄芩苷的氧化率从约60％降至不可观测。
结果表明：以(NH4)2S稀溶液为流动相能有效地抑制还原性分析物在UPLC-ESI-MS上的氧化反应，或者将分析物在UPLC柱上的氧化产物还原至原分析物形态，能成功解决易氧化分析物在UPLC-ESI-MS系统中的氧化反应问题，使应用UPLC-ESI-MS分析易氧化分析物的工作得以顺利进行。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.一种解决超高效液相色谱电喷雾质谱上发生氧化反应问题的方法，其特征在于，是在超高效液相色谱电喷雾质谱的流动相中加入(NH4)2S作为还原剂，以此流动相进行洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
a、配置还原剂溶液：取(NH4)2S，用水配置至1mmol/L的(NH4)2S溶液，以此作为流动相A；
b、色谱条件：
超高效液相色谱仪：AcquityTM Waters UPLC；
色谱柱：Waters公司生产的各类UPLC柱；
流动相：流动相A为1mmol/L的(NH4)2S溶液，流动相B为甲醇或乙腈；
c、质谱条件：
质谱仪：Waters Synapt Q-TOF质谱
离子源：电喷雾离子源，正或负离子模式；
毛细管电压：2.5KV；
锥孔电压：50V；
脱溶剂气温度：400℃；离子源温度：100℃；脱溶剂气流速：600L/h；锥孔气流速：50L/h；四极杆采集质量数范围：100-1000u。
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