CN104263843B - 马铃薯立枯丝核菌的分子检测引物及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

马铃薯立枯丝核菌的分子检测引物及其检测方法，它涉及马铃薯立枯丝核菌的分子检测引物及其检测方法。是要解决传统方法对马铃薯立枯丝核菌病害检测费时、费力且多种真菌复合侵染时难于区分、鉴定的实际问题。方法：以能够引起马铃薯植物组织立枯丝核菌病害的优势融合群标准菌株为阳性材料，以马铃薯植物组织为阴性材料，以马铃薯晚疫病病原菌致病疫霉菌、马铃薯早疫病病原菌茄链格孢菌和3种主要马铃薯干腐病病原镰刀菌为鉴别材料，分别提取总DNA，使用特异性引物进行PCR检测，阳性材料能够扩增得到特异性片段，阴性材料及鉴别材料无条带产生，即完成。本发明方法简洁，结果准确，灵敏度高，重复性好，可应用于大量样品检测。

Description

马铃薯立枯丝核菌的分子检测引物及其检测方法
技术领域
本发明涉及马铃薯立枯丝核菌的分子检测引物及其检测方法。
背景技术
马铃薯立枯丝核菌是一种威胁我国马铃薯生产的重要土传性病害。其引起的马铃薯溃疡病(苗期)和黑痣病(块茎)，不仅可以大大降低马铃薯产量而且还严重影响其商品性。鉴于该病害在我国马铃薯产区普遍存在，因此，快速、准确的检测技术和方法对于科学防治马铃薯立枯丝核菌病害至关重要。当前关于马铃薯立枯丝核菌的检测还主要以传统分离培养法为主，即采用形态学鉴定结果作为判别依据，然而，这种方法步骤多、周期长，一旦样品分离不当还会导致相应信息的丢失。同时，当马铃薯植物组织被多种真菌复合侵染时，因其生长优势弱于其他真菌，故该菌所造成危害极易被其它真菌症状所掩盖，而传统方法更是难以对其进行分离、鉴定，从而导致判定结果的片面、失准。
发明内容
本发明是要解决传统方法对马铃薯立枯丝核菌病害检测费时、费力且多种真菌复合侵染时难于区分、鉴定的实际问题，提供马铃薯立枯丝核菌的分子检测引物及其检测方法。
本发明的马铃薯立枯丝核菌的分子检测引物，所述的引物序列如序列表Seq ID No：1所示和Seq ID No：2所示。
本发明的马铃薯立枯丝核菌的分子检测方法，它是按照以下步骤进行的：
一、以提取待检测的马铃薯基因组DNA为模板，采用权利要求1的引物，进行PCR扩增，
二、取PCR产物进行凝胶电泳检测，若能够检测出242bp大小的片段，则可判断出所述的马铃薯中存在立枯丝核菌。
本发明包含以下有益效果：
本发明的引物及检测方法为马铃薯立枯丝核菌的检测鉴定提供了一种快速、简便、准确的分子生物学检测方法。相对于传统方法的局限性，本方法操作简单，流程便捷，发明所提供特异性检测引物灵敏度高、重复性及可靠性好，能够满足马铃薯生产中各种检测需求，获得快速、准确的检测结果。
本方法所需耗材、设备均为常规分子生物学用品，成本低、易获取，且对品牌、型号无特殊要求，检测条件极易满足。同时，检测材料及结果保存和运输方便，可根据需要随时开展复检工作。
附图说明
图1为马铃薯立枯丝核菌检测引物特异性验证结果；其中，M：DL2000 Marker；1：无菌水；2：健康马铃薯植物组织；3-5：马铃薯立枯丝核菌标准融合群菌株AG-2-1、AG-3、AG-5；6：致病疫霉菌(晚疫病菌)；7：茄链格孢菌(早疫病菌)；8-10：分别为接骨木镰刀菌、燕麦镰刀菌和茄病镰刀菌蓝色变种；
图2马铃薯立枯丝核菌特异性引物灵敏度检测结果；其中，M：DL2000 Marker；1-11为稀释浓度DNA样品：300ng/ul，100ng/μl，50ng/ul，10ng/μl，lng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl，100fg/μl，10fg/μl，1fg/μl。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式的马铃薯立枯丝核菌的分子检测引物，所述的引物序列如序列表Seq ID No：1所示和Seq ID No：2所示。
具体实施方式二：本实施方式的马铃薯立枯丝核菌的分子检测方法，它是按照以下步骤进行的：
一、以提取待检测的马铃薯基因组DNA为模板，采用权利要求1的引物，进行PCR扩增；
二、取PCR产物进行凝胶电泳检测，若能够检测出242bp大小的片段，则可判断出所述的马铃薯中存在立枯丝核菌。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述的提取待检测的马铃薯基因组DNA的提取部位为马铃薯根茎或薯块。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：所述的242bp大小的片段的核苷酸序列为：
GAATGTAATGGATGTAACACATCTCATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAATCTTCAAAATCAATCTTTTTGTTAACTCAATTAGTTTGATTTT GGTATTGGAG。
其它与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是所述的PCR反应体系如下：
PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。
其它与具体实施方式二至四之一相同。
为验证马铃薯立枯丝核菌的分子检测引物及其检测方法的使用效果，进行以下实验：
采用常规植物病原鉴定技术，分别对能够引起马铃薯植物组织真菌病害的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、致病疫霉菌(Phytophthora infestans)、茄链格孢菌(Alternaria dauci)和3种病原镰刀菌(接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)及茄病镰刀菌蓝色变种(Fusarium solani var.coeruleum))进行分离、培养，获得各病原菌纯化菌株；
所述引起马铃薯立枯丝核菌病害的优势融合群(Anastomosis Group)包括AG-2-1、AG-3、AG-5，均为马铃薯主要致病融合群。
以能够引起马铃薯植物组织立枯丝核菌病害的优势融合群标准菌株为阳性材料，以马铃薯植物组织为阴性材料，以能够引起马铃薯其它真菌病害的上述病原菌为鉴别材料，采用常规分子生物学技术分别提取各组织的基因组DNA，并利用各病原菌相应特异性引物进行阳性验证。
根据上述马铃薯真菌病原的转录间隔区(ITS,internal transcribed spacer)设计马铃薯立枯丝核菌特异性引物，
上游引物：5'-GAATGTAATGGATGTAACACATCTCATACTAAG-3'；
下游引物：5'-CTCCAATACCAAAATCAAACTAATTGAGTTAAC-3'。
1、检测样品DNA的提取
分别称取上述马铃薯真菌病原组织及健康马铃薯组织0.1～0.2g，液氮研磨至粉末，采用SDS法提取各检测样品DNA，4℃保存，备用。
2、检测引物特异性验证
以马铃薯立枯丝核菌DNA为阳性样品，马铃薯晚疫病菌DNA、早疫病菌DNA和3种干腐病菌DNA为鉴别样品，以健康马铃薯组织DNA为阴性对照，无菌水为空白对照。
采用常规PCR进行立枯丝核菌引物特异性检测，PCR反应体系及反应条件如下：
PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。
3、PCR产物检测及序列验证
利用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。PCR产物纯化后，送生物技术公司测序，并通过Blast比对进行序列验证。
4、引物灵敏度检测
采用梯度稀释法进行引物灵敏度检测，稀释浓度依次为：300ng/ul，100ng/μl，50ng/ul，10ng/μl，lng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl，100fg/μl，10fg/μl，1fg/μl，PCR反应条件及体系同上，1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
5、结果分析
经马铃薯立枯丝核菌特异性引物扩增出现特异性条带的为阳性结果。检测结果如图1所示，马铃薯立枯丝核菌标准融合群菌株AG-2-1、AG-3、AG-5均获得特异性扩增条带，片段大小为242bp。测序后经Blast比对，其与立枯丝核菌的同源性为99％，验证扩增条带的正确性。灵敏度检测结果如图2所示，特异性检测引物灵敏度为10pg/μl。
所述的片段大小序列如下，其中，下划线为引物所在位置：GAATGTAATGGATGTAACACATCTCATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAATCTTCAAAATCAATCTTTTTGTTAACTCAATTAGTTTGATTTT GGTATTGGAG。

Claims (5)

1. 马铃薯立枯丝核菌的分子检测引物，其特征在于所述的引物序列如序列表Seq ID No：1所示和Seq ID No：2所示。
2.马铃薯立枯丝核菌的分子检测方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
一、以提取待检测的马铃薯基因组DNA为模板，采用权利要求1的引物，进行PCR扩增，
二、取PCR产物进行凝胶电泳检测，若能够检测出242bp大小的片段，则可判断出所述的马铃薯中存在立枯丝核菌。
3.根据权利要求2所述的铃薯立枯丝核菌的分子检测方法，其特征在于所述的提取待检测的马铃薯基因组DNA的提取部位为马铃薯根茎或薯块。
4.根据权利要求2所述的铃薯立枯丝核菌的分子检测方法，其特征在于所述的242bp大小的片段的核苷酸序列为：
GAATGTAATGGATGTAACACATCTCATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAATCTTCAAAATCAATCTTTTTGTTAACTCAATTAGTTTGATTTTGGTATTGGAG。
5.根据权利要求2所述的马铃薯立枯丝核菌的分子检测方法，其特征在于所述的PCR反应体系如下：
PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30 s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。
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水稻立枯丝核菌G蛋白β 亚基基因的克隆、表达及序列分析;肖勇 等;《中国水稻科学》;20080930;第22卷(第5期);第541-544页 *

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