CN103409526A - 用于检测立枯丝核菌的特异性引物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测立枯丝核菌的特异性引物、试剂盒及其分子检测方法，并且验证所述特异性引物具有极高的特异性，利用该组引物及鉴定方法能够快速、准确地鉴定立枯丝核菌，该体系的建立将对潜伏期和幼苗期立枯病的早期快速检测、土壤病菌群体分布及种子携带病菌的监测具有重要意义。

Description

用于检测立枯丝核菌的特异性引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种能够快速检测立枯丝核菌的特异性引物序列、试剂盒及其方法。

背景技术

立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kühn.，属半知菌亚门真菌，可以侵染油菜、白菜、马铃薯、棉花、甜菜、采用大豆、花生、茄子、黄瓜、葫芦、甜瓜等160余种植物。该病菌主要为害幼苗茎基部位，引起根腐或立枯病，如黄瓜立枯病，染病幼苗在床温较高或育苗后期成批死亡。而另一类在保护地苗期常发的由瓜果腐霉菌(Pythiumaphanidermatum)引起的猝倒病的发病初期症状与立枯病很相似，亟需能够在幼苗发病初期就能够准确诊断病害的技术，并做到及时防治。近来研究还发现，立枯丝核菌侵染甜瓜后不仅能引起苗期的甜瓜立枯病，而且能够在采收期果实上引起真菌性甜瓜果腐病，使甜瓜在贮藏运输过程中极易腐烂，给生产者和经营者造成严重的经济损失，因此监测采后甜瓜表皮潜在的立枯丝核菌对甜瓜的正常贮运起到早起预警作用。立枯丝核菌以菌丝体或菌核在土壤或病组织上越冬，在土壤中可存活2-3年。同时，该病菌还能通过种子携带传播病害使幼苗染病。因此，对土壤和种子的立枯丝核菌的监测也能更好地控制该病害。

传统的病原菌分离和鉴定来诊断病害的方法时间长、操作繁琐，准确度低，并且难以对潜在的病原菌进行鉴定，因此亟需开发出一种能够准确、快速鉴定立枯丝核菌的分子生物学方法，对病害潜伏期和发病初期就能进行诊断、检测和病原菌鉴定，及时有效地进行病害防治，控制病害的流行，减少经济损失，对田间病害防控具有重要的指导意义。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题是提供检测立枯丝核菌的特异性引物序列，该组引物灵敏度好特异性高，利用该组引物能对立枯丝核菌引起的病害进行早期预警和及时防治。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供检测立枯丝核菌的试剂盒，该试剂盒内引物灵敏度好特异性高，利用该组引物能对立枯丝核菌引起的病害进行早期预警和防治。

本发明所要解决的再一个技术问题是提供相关的检测立枯丝核菌的方法。

本发明解决上述首要技术问题的技术方案是：一种用于检测立枯丝核菌的特异性引物，上游引物具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列，下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。

本发明解决上述另一个技术问题的技术方案是：一种检测立枯丝核菌的试剂盒，该试剂盒包含两条引物，上游引物具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列，下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。所述试剂盒还可以进一步包含PCR反应所需的缓冲液、酶体系以及用于提取待测样品DNA的试剂。

本发明解决上述再一个技术问题的技术方案是：一种检测立枯丝核菌的方法，提取待测样品DNA作为模板，利用上述引物进行PCR扩增反应，PCR产物经凝胶电泳后用溴化乙锭染色，根据凝胶中条带大小判断：若存在631-bp的DNA条带，则检测样品中含有立枯丝核菌。

优选，所述的PCR反应的扩增体系为：1μL DNA模板（约0.4ng），引物各0.2μmoll^－1，dNTP0.2μmol l^－1,MgCl₂2mmol l^－1,1×缓冲液（上海博彩生产），聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25μL。

优选，所述的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1.5%的琼脂糖在1×TAE缓冲液中电泳后，用溴化乙锭显色拍照。

研究表明，植物病原真菌的分类鉴定主要依据其营养体和子实体的形态特征，由于形态特征容易受到培养条件和其他因素的影响，给真菌的分类鉴定工作带来困难。而病原真菌的基因组DNA遗传稳定，不易受环境影响，而且在真菌生活史的任何阶段都能获得。真菌的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，简称ITS)在绝大多数的真菌中表现为种内相对一致，种间差异比较明显。因此利用立枯丝核菌的ITS序列可以对该病原菌进行分子鉴定，用于区别其他植物病原真菌。

根据立枯丝核菌的ITS序列，设计引物Rs-F和Rs-R，对含有立枯丝核菌DNA的样品进行扩增，可以得到631-bp的条带，对含有其他真菌DNA的样品进行扩增，都不能扩增出任何产物。

与常规的植物病害的鉴定技术相比，本发明根据立枯丝核菌的ITS序列，设计了上述两条特异性引物，能用来快速、准确、便捷地鉴定样品中立枯丝核菌，该鉴定方法为建立病原菌的分子监测和病害的快速诊断技术奠定基础，对植物病害的防治具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明引物特异性检测样品DNA扩增后的凝胶电泳图；

图2为本发明田间病株DNA扩增后的凝胶电泳图。

具体实施方式

为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：

菌株选用

3个分别采自葫芦幼苗、甜瓜幼苗、甜瓜果实的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)编号为RSh-2、RSt-1和RSt-4；瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、蔓枯病菌(Didymellabryoniae)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(F.solani)、灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea）、稻瘟病菌(Magnaprothe grisea)和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)。

上述菌株均保藏于宁波市农科院蔬菜研究所，也可以通过病原真菌分离纯化方法从瓜类等病株中获得。

DNA提取

本发明中立枯丝核菌和其他病原真菌均采用简便快速的菌丝DNA提取办法，具体操作步骤如下：

用灭菌牙签从平板上刮取菌丝约100mg，置于1.5-mL Eppendorf管中，加500μLDNA提取裂解液（0.2mol/L Tris-HCl，0.05mol/L EDTA，0.02mol/L NaCl，1%SDS），用电钻充分研磨，振荡混匀，室温静止10min；13200r/min4℃，离心5min；取上清液约400μL于新的1.5-mL Eppendorf管中，加750μL无水乙醇，混和混匀，13200r/min4℃，离心5min，弃上清；沉淀用70%乙醇洗涤，室温放置干燥5-10min，溶于30μL TE缓冲液(pH8.0)，-20℃保存备用。

本发明中田间病株DNA提取方法：剪取病组织约100mg，置于1.5-mL Eppendorf管中，加500μL抽提液（2%聚乙烯吡咯烷酮和DNA提取裂解液混合物），其他步骤参照菌丝DNA提取办法，将提取后的DNA溶液用UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒（上海生工生产）过柱纯化，-20℃保存备用。

引物合成

根据立枯丝核菌ITS序列，设计正向引物Rs-F和反向引物Rs-R。

上述引物的具体序列与序列表中序列对应关系如下表1所示：

表1、本发明中所有的PCR引物序列

上述序列的引物由上海博彩合成。

引物特异性验证

以提取的立枯丝核菌和其它7种真菌的DNA为模板，用种特异性引物Rs-F和Rs-R进行常规PCR反应，每个反应均有一个阴性对照（以无菌水作为模板）。

PCR反应的扩增体系为：1μL DNA模板（约0.4ng），两条引物各0.2μmol l^－1，dNTP0.2μmol l^－1,MgCl₂2mmol l^－1,1×缓冲液（上海博彩生产），聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25μL。

PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1.5%的琼脂糖在1×TAE缓冲液中电泳后，用溴化乙锭显色拍照。

从电泳照片上看（如图1所示），用Rs-F和Rs-R引物组扩增的PCR产物中，3个含有立枯丝核菌的样品均能扩增到631-bp的DNA条带，而其它病原真菌没有扩增到任何条带。说明该组种特异性引物能够鉴定立枯丝核菌。

苗期病株检测

采集甜瓜幼苗茎基部有暗褐色病斑的病株提取DNA，提取方法参照病株DNA提取。提取的DNA利用Rs-F和Rs-R进行常规PCR反应，每个反应均有一个阴性对照（以无菌水作为模板）。PCR反应的扩增体系和反应条件如上所述。如图2所示，病株5、8、9均能扩增到631-bp的DNA条带，说明病株被立枯丝核菌侵染，病株1，2扩增不到任何条带，说明病斑是由除立枯丝核菌外的致病菌引起的。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种用于检测立枯丝核菌的特异性引物，其特征在于：上游引物具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列，下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。

2.一种用于检测立枯丝核菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的特异性引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含PCR反应所需的缓冲液、酶体系以及用于提取待测样品DNA的试剂。

4.一种用于检测立枯丝核菌的方法，其特征在于：采用权利要求2或3所述的试剂盒对待测样品进行检测。

5.一种用于检测立枯丝核菌的方法，其特征在于：提取待测样品DNA作为模板，利用权利要求1所述的特异性引物进行PCR扩增反应，PCR产物经凝胶电泳后用溴化乙锭染色，根据凝胶中条带大小判断：若存在631-bp的DNA条带，则检测样品中含有立枯丝核菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的PCR反应的扩增体系为：1μL DNA模板（约0.4ng），引物各0.2μmol l^－1，dNTP0.2μmol l^－1,MgCl₂2mmol l^－1,1×缓冲液，聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25μL。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸5min；PCR产物用1.5%的琼脂糖在1×TAE缓冲液中电泳后，用溴化乙锭显色拍照。

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