CN104225679B - 一种具有抗菌性及促进成骨细胞生长的钛金属改性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法，将钛金属预处理，配制可粘附在钛金属表面的含有一定交联空间结构的混合液，再加入成骨细胞和预处理钛金属，真空干燥，得到涂层中包覆有成骨细胞的钛金属，最后浸入I型胶原酶溶液中15-45秒，超声洗脱，真空干燥，得到本发明所述能够促进成骨细胞生长的改性医用钛金属。本发明方法简单，制备条件温和，在制备过程中无有害物质产生，本发明所得产品能有效识别成骨细胞，促进成骨细胞在钛金属表面的快速生长，将本发明所得产品作为植入体植入体内后，有利于成骨细胞在钛金属表面固定生长。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料的表面改性领域，具体为一种具有抗菌性及促进成骨细胞生长的钛金属改性方法。
背景技术
随着医疗技术发展，医用钛金属被作为牙种植体和骨种植体等种植材料广泛应用在牙列缺损、骨头损失等疾病治疗，在挽救人的生命方面发挥了重要作用。然而该类手术的感染率很高，可能会导致大量抗生素治疗、去除种植体甚至死亡等严重后果。种植体相关感染高发的主要原因有两点：菌斑在种植体表面聚集和种植体骨结合界面抵抗能力低下。因此，需要提高钛金属的抗菌性能和促进成骨细胞生长功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗菌性及促进成骨细胞生长的钛金属改性方法，经过改性之后的钛金属提高涂层的稳定性，增强粘附效果，同时通过加入抗菌性物质，在提高钛金属的促成骨细胞生长能力的同时增强钛金属的抗菌能力。
本发明提供的技术方案是：
一种具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法，其中，包括以下步骤：
步骤一、钛金属预处理，将钛金属在1-3mol/L丙酮溶液中超声处理2-3次，每次15-45分钟，然后放入酸性溶液中浸泡20-30小时，真空干燥，得到预处理钛金属；
步骤二、涂层制备，取交联剂溶液、血清白蛋白溶液和硝酸银溶液混合进行交联反应，得到可结合在钛金属表面的含有一定交联空间结构的混合液，向所述混合液中加入成骨细胞和预处理钛金属，浸泡5-10分钟后，取出预处理钛金属，真空干燥得到涂层中包覆有成骨细胞的钛金属；
步骤三、成骨细胞的移除，将步骤二得到的涂层中包覆有成骨细胞的钛金属浸入I型胶原酶溶液中30-50秒，使所述成骨细胞从所述交联空间结构内移除，并使预处理钛金属表面形成具有与成骨细胞相匹配的空间结构的涂层，即得所述能够促进成骨细胞生长的改性医用钛金属。
优选的是，所述具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法中，步骤一中所述的酸性溶液为1-2mol/L硫酸、0.5-1mol/L盐酸、蒸馏水按照1∶1-2∶1-2体积比制备得到，所述酸性溶液的用量为10-20ml。
优选的是，所述具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法中，所述酸性溶液的用量为10-20ml浓度为1-2mol/L。
优选的是，所述具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法中，步骤二中进行交联反应的各种溶液的配置方法分别为：取0.1-0.5g交联剂与3-8ml75-85％乙醇溶液混合得到所述交联剂溶液；取1-2g血清白蛋白与30-100ml水混合制得所述血清白蛋白溶液；取0.01-0.05g硝酸银与1-5ml蒸馏水混合制得所述硝酸银溶液。
优选的是，所述具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法中，所述血清白蛋白可为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
优选的是，所述具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法，步骤二中所述的交联剂可为环氧树脂或环氧氯丙烷。
优选的是，所述具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法中，步骤二中所述成骨细胞的用量为1-5ml，所述成骨细胞密度为2-10×104/ml。
优选的是，所述具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法中，步骤三中所述I型胶原酶溶液用量为2-10ml，所述I型胶原酶溶液浓度为1-3％；所述蒸馏水用量为30-50ml。
优选的是，所述具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法中，所述真空干燥条件为压强0.1-0.3MPa，温度为80-120℃，干燥时间为10-30分钟。
本发明带来的有益效果是：本发明中采用分子印迹的方法，先将血清白蛋白溶液与交联剂产生交联反应，形成一个交联的空间结构，蛋白独特的空间结构有助于形成独特的交联空间，同时再引入成骨细胞，在加热条件下将成骨细胞包覆在交联空间结构中，同时血清白蛋白中的巯基以配位键与钛金属表面结合，稳定的粘附在钛金属表面，并且本发明将钛金属放在酸液中浸泡使用化学侵蚀的方法增加钛金属的比表面积，增加了涂层在钛金属表面的稳定性；在胶原酶的作用下将成骨细胞移除，钛金属表面留下成骨细胞的“印迹”，即为与成骨细胞相匹配的空穴，具有对成骨细胞分子有效识别的功能，当钛金属表面的空穴与成骨细胞接触时，成骨细胞在钛金属表面固定生长。并且在对钛金属进行改性前，先通过丙酮溶液进行除油处理，除去钛金属表面的氧化膜，有效防止涂层脱落，促进涂层的稳定性，同时使用的血清白蛋白是脊椎动物血浆中含量最丰富的蛋白质，与人体具有良好的生物相容性，使钛金属制成的植入体与人体具有很好的生物相容性，减少排斥反应造成的不良影响，同时本发明中加入了硝酸银溶液，利用银可以杀菌的原理，提高了本发明所得钛金属的抗菌性，减少了植入体在种植时会造成的细菌感染。本发明的制备方法简单，制备条件温和，无有害副产物生成。
附图说明
图1为本发明所述具有抗菌性及促进成骨细胞生长的钛金属改性方法备方法流程示意图图；
图2为本发明所得产品进行抗菌能力实验的结果示意图；
图3为本发明所得产品与普通钛片进行细胞活性检测的结果示意图；
图4为本发明所得产品与普通钛片进行细胞毒性分析的结果示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
如图1所示，一种具有抗菌性及促进成骨细胞生长的钛金属改性方法，其中，包括以下步骤：
步骤一、钛金属预处理，将钛金属在1-3mol/L丙酮溶液中超声处理2-3次，每次15-45分钟，然后放入10-20ml以硫酸、盐酸、蒸馏水按照1∶1-2∶1-2体积比制备得到的酸性溶液中浸泡30-60分钟，在压强0.1-0.3MPa，温度为80-120℃，干燥时间为10-30分钟，得到预处理钛金属；
步骤二、涂层制备，取0.1-0.5g交联剂与3-8ml75-85％乙醇溶液混合得到所述交联剂溶液；取1-2g血清白蛋白与30-100ml水混合制得所述血清白蛋白溶液；取0.01-0.05g硝酸银与1-5ml蒸馏水混合制得所述硝酸银溶液，将所述三种溶液混合进行交联反应，得到可结合在钛金属表面的含有一定交联空间结构的混合液，向所述混合液中加入1-5ml密度为2-10×104/ml成骨细胞，搅拌均匀后，再加入面积为1x1cm2的预处理钛金属，浸泡5-10分钟后，取出预处理钛金属，真空干燥得到涂层中包覆有成骨细胞的钛金属；
步骤三、成骨细胞的移除，将步骤二得到的涂层中包覆有成骨细胞的钛金属浸入2-10ml浓度为1-3％I型胶原酶溶液中静置30-50秒，取出浸入30-60ml蒸馏水超声5-10分钟，在压强0.1-0.3MPa，温度为80-120℃，干燥10-30分钟，使所述成骨细胞从所述交联空间结构内移除，并使预处理钛金属表面形成具有与成骨细胞相匹配的空间结构的涂层，即得所述能够促进成骨细胞生长的改性医用钛金属。
所述具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法中，所述血清白蛋白可为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
所述具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法中，步骤二中所述的交联剂可为环氧树脂或环氧氯丙烷。
实施例1
步骤一、钛金属预处理，将钛金属在1mol/L丙酮溶液中超声处理3次，每次45分钟，然后放入20ml以硫酸、盐酸、蒸馏水按照1∶1∶2的体积比制备得到的酸性溶液中浸泡40分钟，在压强0.1MPa，温度为80℃，干燥30分钟，得到预处理钛金属；
步骤二、涂层制备，取0.15g环氧氯丙烷与5ml85％乙醇溶液混合得到所述交联剂溶液；取1.5g血清白蛋白与100ml水混合制得所述血清白蛋白溶液；取0.02g硝酸银与2ml蒸馏水混合制得所述硝酸银溶液，将所述三种溶液混合进行交联反应，得到可粘附在钛金属表面的含有一定交联空间结构的混合液，向所述混合液中加入2ml密度为3×104/ml成骨细胞，搅拌均匀后，再加入面积为1x1cm2的预处理钛金属，浸泡10分钟后，取出预处理钛金属，真空干燥得到涂层中包覆有成骨细胞的钛金属；
步骤三、成骨细胞的移除，将步骤二得到的涂层中包覆有成骨细胞的钛金属浸入10ml浓度为2％I型胶原酶溶液中静置50秒，取出浸入30ml蒸馏水超声5分钟，在压强0.1MPa，温度为100℃，干燥30分钟，使所述成骨细胞从所述交联空间结构内移除，并使预处理钛金属表面形成具有与成骨细胞相匹配的空间结构的涂层，即得所述能够促进成骨细胞生长的改性医用钛金属。
1、抗菌能力实验
将本发明所得产物对金黄色葡萄菌、大肠埃希氏菌、白假丝酵母、枯草芽孢杆菌黑色变种进行抑菌试验。每个试样表面接种1ml浓度为105的菌液在37℃培养1d后，试样用PBS轻轻漂洗3次以去除未粘附的细菌，然后试样上粘附的细菌用超声振荡(40W)5min洗脱到1ml蒸馏水中，洗脱液用来检测试样表面粘附细菌中的活菌数。用倍比稀释和涂布培养法检测活菌数。试验结果如图2所示。
2、细胞活性检测
将普通钛片和本发明产物分别置于24孔板中(每组设三个平行孔)。1ml密度为2×104/ml的细胞悬液接种于试样表面，然后培养1、4和7d。到预定时间点后，试样用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液轻柔漂洗三次后转移到新的24孔板内。每孔加入200μl浓度为5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐和800μl无血清无酚红DMEM培养基。37℃孵育4h后吸弃上清，加入1ml二甲基亚砜溶解生成的结晶物，每孔取200μl溶解液转到96孔培养板，用分光光度计于490nm处测其OD值。试验结果如图3所示。
3、细胞毒性分析
(1)试验原理：以乳酸脱氢酶(LDH)的活性作为细胞毒性指标来评估本发明产物的细胞毒性大小，其原理为乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外；LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和四唑盐类(INT)反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。
(2)试验步骤：分别普通钛片和本发明产物分别放入24孔板中，然后将1×104个细胞的成骨细胞接种到24孔板中，并培育1天。分别收集培养液，离心后取上清用于LDH活性检测。试验结果如图4所示。
4、试验结果
从图2中可以看出，由本发明所得产品对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠埃希氏菌(ATCC25922)、白假丝酵母(ATCC10231)、枯草芽孢杆菌黑色变种(ATCC9372)都具有很强的杀菌性，其杀菌率达99％以上。
从图3中可以看出普通钛片和本发明产物的OD值随着培养时间的增加而增大，但是可以看出，普通钛片随着培养时间的增加OD值的增长缓慢，相比之下，本发明产物的OD值在随着培养时间的增加快速增长，在培养7天时，本发明产品相较于普通钛片的OD值成倍增长。由此可以得出，本发明产品具有明显的细胞增殖活性效果。
从图4中可以知道本发明产品与普通钛片相比，普通钛片的LDH活性(U/L)值为236，而本发明产品的LDH活性(U/L)值为230，低于普通钛片的LDH值，表明本发明产物无细胞毒性。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (7)
1.一种具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、钛金属预处理，将钛金属在1-3mol/L丙酮溶液中超声处理2-3次，每次15-45分钟，然后放入酸性溶液中浸泡30-60分钟，真空干燥，得到预处理钛金属，所述酸性溶液为1-2mol/L硫酸、0.5-1mol/L盐酸、蒸馏水按照1∶1-2∶1-2体积比制备得到，所述酸性溶液的用量为10-20ml；
步骤二、涂层制备，取交联剂溶液、血清白蛋白溶液和硝酸银溶液混合进行交联反应，得到可粘附在钛金属表面的含有一定交联空间结构的混合液，向所述混合液中加入成骨细胞和预处理钛金属，浸泡5-10分钟后，取出预处理钛金属，真空干燥得到涂层中包覆有成骨细胞的钛金属；
步骤三、成骨细胞的移除，将步骤二得到的涂层中包覆有成骨细胞的钛金属浸入I型胶原酶溶液中30-50秒，取出浸入蒸馏水中超声5-10分钟，使所述成骨细胞从所述交联空间结构内移除，并使预处理钛金属表面形成具有与成骨细胞相匹配的空间结构的涂层，即得所述能够促进成骨细胞生长的改性医用钛金属。
2.如权利要求1所述的具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法，其特征在于，步骤二中进行交联反应的各种溶液的配置方法分别为：取0.1-0.5g交联剂与3-8ml75-85％乙醇溶液混合得到所述交联剂溶液；取1-2g血清白蛋白与30-100ml水混合制得所述血清白蛋白溶液；取0.01-0.05g硝酸银与1-5ml蒸馏水混合制得所述硝酸银溶液。
3.如权利要求2所述的具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法，其特征在于，所述血清白蛋白可为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
4.如权利要求2所述的具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法，其特征在于，步骤二中所述的交联剂可为环氧树脂或环氧氯丙烷。
5.如权利要求1所述的具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法，其特征在于，步骤二中所述成骨细胞的用量为1-5ml，所述成骨细胞密度为2-10×104/ml。
6.如权利要求1所述的具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法，其特征在于，步骤三中所述I型胶原酶溶液为用量为2-10ml，所述I型胶原酶溶液浓度为1-3％；所述蒸馏水用量为30-50ml。
7.如权利要求1所述的具有抗菌性及促成骨细胞生长的钛金属改性方法，其特征在于，步骤一和步骤二中所述真空干燥条件均为压强0.1-0.3MPa，温度为80-120℃，干燥时间为10-30分钟。
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