CN101596329A - 一种钛材料表面涂层的方法及其涂层复合材料的应用 - Google Patents

一种钛材料表面涂层的方法及其涂层复合材料的应用 Download PDF

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潘明利
蔡玉荣
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Abstract

本发明公开了钛材料表面涂层的方法：经过碱热处理的钛片冷却，放置于12孔板中，每孔分别添加5mL的1.5倍的仿生液，并于37℃下静置2～14天，每12h换一次1.5×CSBF液；取出钛片后，用去离子水清洗，自然干燥，即可得到钛表面生物活性涂层，该涂层为重组胶原蛋白－羟基磷灰石复合涂层。本发明所形成的涂层是纳米羟基磷灰石晶体与重组胶原蛋白的复合物，具有天然骨中的两个主要的组成成分，具有促进细胞黏附、增殖和分化的功能。制备的钛复合材料可作为骨修复或替代材料而应用于骨组织工程。

Description

一种钛材料表面涂层的方法及其涂层复合材料的应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，特别涉及一种通过重组胶原蛋白调控钛表面仿生矿化而形成对成骨细胞具有良好细胞相容性的新型涂层的制备方法。该方法制备的复合材料可作为骨修复或替代材料而应用于骨组织工程。
背景技术
骨骼组织非常复杂，其主要组成部分是有机质骨胶原和无机质羟基磷灰石。另外，还有少量的其他有机物，如蛋白质、多糖和脂类等。从材料科学的角度出发，天然骨可被看作是一种弹性高分子聚合物增韧的羟基磷灰石基复合材料。正是因为骨组织具有如此精微复杂的结构，到目前为止临床上对大块骨缺损的医治仍是一个研究的难点，多年来临床应用的骨修复技术主要采取自体骨移植和异体骨移植，然而自体骨移植受自身供体有限性的限制且给患者增加痛苦，异体骨移植存在抗原性的问题。
随着科技的进步，骨修复材料的开发和应用为骨移植提供新的骨源，其中传统的骨修复材料(如各种以金属、陶瓷或高分子制造的人工骨替代材料等)也已应用于临床，但多数是作为永久植入体使用，它们不能参与人体的新陈代谢，因而长期效果往往不尽人意。具有生物相容性、骨诱导性等生物学特性的骨替代材料研究和制备已成为当今世界生物材料科学研究中的前沿课题，而胶原蛋白、羟基磷灰石和金属钛是目前备受关注的三种骨修复材料。
胶原蛋白由多糖蛋白分子组成，是结缔组织的主要蛋白成分。胶原蛋白具有良好的生物相容性、生物降解性和细胞黏附性能等诸多功能，在生物医用材料和组织工程等领域具有广泛的应用价值。但是天然胶原蛋白来源有限，且具有高感染性和免疫排斥反应的潜在危险(Du CL，Wang MQ，Liu JY，Pan ML，CaiYR，Yao JM.Improvement of thermostability of recombinant collagen-likeprotein by incorporating a foldon sequence.Appl Microbiol Biotechnol2008；79：195-202)。羟基磷灰石是骨基质中无机盐的主要化学成分，化学式为Ca10(PO4)6(OH)2，简称HA，密度为3.16g/cm，折射率是1.64～1.65，Ca/P原子比为1.67。由于羟基磷灰石具有良好的生物相容性、生物活性、骨传导性及其与人体骨矿物相组分的相似性，而被广泛用于生物医用材料领域。然而单一组分的羟基磷灰石烧结性能差，作为种植材料其硬度较低、韧性较差、力学性能不足，致使其难以承受负荷或冲击，因而限制了其在临床上的应用。为了提高羟基磷灰石陶瓷材料的力学性能，许多学者采用与其他材料复合的方法来提高羟基磷灰石的性能。而钛及合金表面会自发形成均匀致密的二氧化钛氧化膜，其介电常数与水相当，因此具有较好的生物性能，且具有较高的强度和断裂韧性，是临床应用的金属植入体中综合性能最为优异的生物医用材料。但它们仍然具有生物惰性，与骨的结合属于机械锁合。且释放出的金属元素会引起细胞出现炎症反应或坏死，导致植入失败(Xiong JY，Li YC，Wang XJ，HodgsonP，Wen CE.Mechanical properties and bioactive surface modification viaalkali-heat treatment of a porous Ti-18Nb-4Sn alloy for biomedicalapplications.Acta Biomaterialia 2008；4：1963-8)。
发明内容
本发明的目的在于针对钛材料作为骨修复材料的缺陷，采用重组类人胶原蛋白来调控钛基体上羟基磷灰石的生成，从而制备出一种新型的对成骨细胞具有良好细胞相容性的钛表面生物活性涂层材料，包括以下步骤：
(1)将钛片依次经去离子水、无水丙酮和无水乙醇超声清洗各30min；
(2)将清洗后的钛片放入5mol/L的NaOH溶液中，80℃处理24h；取出钛片，用去离子水轻轻清洗，并放置烘箱中于40℃下干燥；
(3)将干燥后的钛片放入炉中以10℃/min，升温至600℃，保温热处理1h，待炉内温度自然冷却到室温之后，取出钛片；
(4)配制含有重组胶原蛋白的1.5倍的仿生液；
(5)将步骤(1)处理好的钛片放置于12孔板中，每孔分别添加5mL的1.5倍的仿生液，并于37℃下静置2～14天，每12h换一次1.5×CSBF液；
(6)将步骤(5)中浸泡于1.5×CSBF中的钛片取出，用去离子水清洗，自然干燥，即可得到钛表面生物活性涂层，该涂层为重组胶原蛋白-羟基磷灰石复合涂层。
所述步骤(1)中的钛片为10×10×1mm3的钛片。
所述钛片包括纯钛金属、镍钛合金、钛铬合金或其它钛合金。
所述步骤(4)配制含有重组胶原蛋白的1.5倍的仿生液：按下表1L仿生液中包含的成分，pH值为7.4，由去离子水定容，得到含有重组胶原蛋白的1.5倍的仿生液(简称：1.5×CSBF溶液)；
所述步骤(4)用1M盐酸调pH至7.4。
更进一步：
(1)将10×10×1mm3的钛片依次经去离子水、无水丙酮和无水乙醇超声清洗各30min；
(2)将清洗后的钛片放入5mol/L的NaOH溶液中，80℃处理24h；取出钛片，用去离子水轻轻清洗，并放置烘箱中于40℃下干燥；
(3)将干燥后的钛片放入炉中以10℃/min，升温至600℃，保温热处理1h，待炉内温度自然冷却到室温之后，取出钛片；
(4)配制含有重组胶原蛋白的1.5倍的仿生液：按下表依次称量相应的成分，并按表中的顺序逐一溶解在去离子水中，用1M盐酸调pH至7.4，定容至1L，为1.5×CSBF溶液；
Figure A20091010062400081
(5)将步骤(1)处理好的钛片放置于12孔板中，每孔分别添加5mL的1.5×CSBF溶液，并于37℃下静置2～14天，每12h换一次1.5×CSBF液；
(6)将步骤(5)中浸泡于1.5×CSBF中的钛片取出，用去离子水小心清洗，自然干燥，即可得到钛表面生物活性涂层，该涂层为重组胶原蛋白-羟基磷灰石复合涂层。
本发明的方法制备的具有重组胶原蛋白-羟基磷灰石复合涂层的钛复合材料。
本发明的钛复合材料作为骨修复或替代材料而应用于骨组织工程。
本发明所形成的涂层是纳米羟基磷灰石晶体与重组胶原蛋白的复合物，具有天然骨中的两个主要的组成成分，具有促进细胞黏附、增殖和分化的功能。制备的钛复合材料可作为骨修复或替代材料而应用于骨组织工程。
附图说明
图1为本发明中钛材料在1.5×CSBF液中浸泡14天后的表面涂层形貌；
图2为本发明中对照例，即在不含重组胶原蛋白的1.5倍仿生液(1.5×SBF)中浸泡14天后的表面涂层形貌；
图3比较了MG-63细胞在不同材料上培养不同时间后的密度；
图4比较了MG-63细胞在不同材料上培养不同时间后碱性磷酸酶(ALP)活性；
图5比较了MG-63细胞在不同材料上培养不同时间后骨钙素(OC)表达水平。
具体实施方式
1.5倍的仿生液(1.5×CSBF)配方如下：
Figure A20091010062400091
1.5倍的仿生液(1.5×SBF)配方如下(Lin，F.；Li，Y.C.；Jin，J.；Cai，Y.R.；Wei，K.M.；Yao，J.M.Deposition behavior and properties of silkfibroin scaffolds soaked in simulated body fluid.Mater.Chem.Phys.，2008，111，92-97.)：
Figure A20091010062400092
Figure A20091010062400101
实施例1
(1)将钛片(10×10×1mm3)依次经去离子水、无水丙酮和无水乙醇超声清洗各30min。
(2)将清洗后的钛片放入5mol/L的NaOH溶液中，80℃处理24h。取出钛片，用去离子水轻轻清洗，并放置烘箱中于40℃下干燥。
(3)将干燥后的钛片放入炉中以10℃/min，升温至600℃，保温热处理1h，待炉内温度自然冷却到室温之后，取出钛片。
(4)配制含有重组胶原蛋白的1.5倍的仿生液(1.5×CSBF)，依次称量相应的成分，并逐一溶解在去离子水中，用1M盐酸调pH至7.4，定容至1L。
(5)将步骤(1)处理好的钛片放置于12孔板中，每孔分别添加5mL的1.5×CSBF溶液，并于37℃下静置2天，每12h换一次1.5×CSBF液。
(6)将步骤(5)中浸泡于1.5×CSBF中的钛片取出，用去离子水小心清洗，自然干燥，即可得到钛表面生物活性涂层。
实施例2
(1)将钛片(10×10×1mm3)依次经去离子水、无水丙酮和无水乙醇超声清洗各30min。
(2)将清洗后的钛片放入5mol/L的NaOH溶液中，80℃处理24h。取出钛片，用去离子水轻轻清洗，并放置烘箱中于40℃下干燥。
(3)将干燥后的钛片放入炉中以10℃/min，升温至600℃，保温热处理1h，待炉内温度自然冷却到室温之后，取出钛片。
(4)配制含有重组胶原蛋白的1.5倍的仿生液(1.5×CSBF)，依次称量相应的成分，并逐一溶解在去离子水中，用1M盐酸调pH至7.4，定容至1L。
(5)将步骤(1)处理好的钛片放置于12孔板中，每孔分别添加5mL的1.5×CSBF溶液，并于37℃下静置8天，每12h换一次1.5×CSBF液。
(6)将步骤(5)中浸泡于1.5×CSBF中的钛片取出，用去离子水小心清洗，自然干燥，即可得到钛表面生物活性涂层。
实施例3
(1)将钛片(10×10×1mm3)依次经去离子水、无水丙酮和无水乙醇超声清洗各30min。
(2)将清洗后的钛片放入5mol/L的NaOH溶液中，80℃处理24h。取出钛片，用去离子水轻轻清洗，并放置烘箱中于40℃下干燥。
(3)将干燥后的钛片放入炉中以10℃/min，升温至600℃，保温热处理1h，待炉内温度自然冷却到室温之后，取出钛片。
(4)配制含有重组胶原蛋白的1.5倍的仿生液(1.5×CSBF)，依次称量相应的成分，并逐一溶解在去离子水中，用1M盐酸调pH至7.4，定容至1L。
(5)将步骤(1)处理好的钛片放置于12孔板中，每孔分别添加5mL的1.5×CSBF溶液，并于37℃下静置14天，每12h换一次1.5×CSBF液。
(6)将步骤(5)中浸泡于1.5×CSBF中的钛片取出，用去离子水小心清洗，自然干燥，即可得到钛表面生物活性涂层。
对照例
(1)将钛片(10×10×1mm3)依次经去离子水、无水丙酮和无水乙醇超声清洗各30min。
(2)将清洗后的钛片放入5mol/L的NaOH溶液中，80℃处理24h。取出钛片，用去离子水轻轻清洗，并放置烘箱中于40℃下干燥。
(3)将干燥后的钛片放入炉中以10℃/min，升温至600℃，保温热处理1h，待炉内温度自然冷却到室温之后，取出钛片。
(4)配制不含重组胶原蛋白的1.5倍的仿生液(1.5×SBF)，依次称量相应的成分，并逐一溶解在去离子水中，用1M盐酸调pH至7.4，定容至1L。
(5)将步骤(1)处理好的钛片放置于12孔板中，每孔分别添加5mL的1.5×SBF溶液，并于37℃下静置14天，每12h换一次1.5×SBF液。
(6)将步骤(5)中浸泡于1.5×SBF中的钛片取出，用去离子水小心清洗，自然干燥，即可得到钛表面生物活性涂层。
细胞相容性实验步骤如下：
(1)分别经过碱热处理(实施例1中第三步)的钛片(Pretreated Ti)、1.5×SBF液中浸泡14天(对照例)的钛片(SBF-14d)和1.5×CSBF液中浸泡14天(实施例3)的钛片(CSBF-14d)样品用75％的酒精杀菌消毒。
(2)将杀菌消毒过的样品用PBS洗涤3次，再用DMEM细胞培养液(美国GIBCO公司)预洗一次，然后放入12孔细胞培养板中。
(3)每孔滴加密度为1×105个细胞/mL的MG-63细胞悬液300μL(中科院上海生命科学研究院细胞库)，然后每孔分别加1mL的DMEM细胞培养液。将培养板置于37℃、饱和湿度、体积分数5％CO2培养箱内培养，次日更换培养液，以后隔天换液1次。设不加钛片的孔做空白对照(Blank)。
(4)将分别培养到3小时、12小时、2天和5天的钛片样品取出，用PBS清洗掉样品表面的培养液和未黏附的细胞。然后用FITC标记的绿色荧光染料和DAPI染料对样品上黏附的细胞进行双荧光染色，并用荧光显微镜观察细胞形态，并进行计数以做统计分析。
(5)细胞分化分析：将分别培养到2天和5天的钛片上的细胞用2％TritonX-100破膜，并经反复冻融，裂解细胞，离心收集细胞裂解液。然后借助试剂盒来测定细胞内碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OC)的含量。
(6)细胞分化结果表明，在具有重组胶原蛋白-羟基磷灰石复合涂层的钛片上生长的细胞与不含胶原蛋白的羟基磷灰石涂层的钛片上生长的细胞相比，具有更高的碱性磷酸酶活性和更高的骨钙素表达水平，说明该重组胶原蛋白-羟基磷灰石复合涂层具有促进细分化的功能。
实施例结合图1：图1为本发明中钛材料在1.5×CSBF液中浸泡14天后的表面涂层形貌。钛材料表面形成的羟基磷灰石呈现针状整齐排列。
实施例结合图2：图2为本发明中对照例，即在不含重组胶原蛋白的1.5倍仿生液中浸泡14天后的表面涂层形貌。钛材料表面形成的羟基磷灰石呈现针状整齐排列。
实施例结合图3：图3比较了MG-63细胞在不同材料上培养不同时间后的密度。随着培养时间的增加，不同材料表面的细胞数量明显增加；CSBF-14d与Pretreated Ti和SBF-14d相比，细胞数量增加明显要快，体现了CSBF-14d具有很好的细胞粘附增殖性能。
实施例结合图4：图4比较了MG-63细胞在不同材料上培养不同时间后碱性磷酸酶(ALP)活性。随着培养时间的增加，不同材料的ALP活性明显增加；CSBF-14d与Pretreated Ti和SBF-14d相比，ALP活性显著增加，体现了CSBF-14d具有很好的促进细胞分化的性能。
实施例结合图5：图5比较了MG-63细胞在不同材料上培养不同时间后骨钙素(OC)表达水平。随着培养时间的增加，不同材料的OC含量明显增加；CSBF-14d与Pretreated Ti、SBF-14d和Blank相比，OC含量显著增加，体现了CSBF-14d具有很好的促进细胞分化的性能。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (8)

1、一种钛材料表面涂层的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将钛片依次经去离子水、无水丙酮和无水乙醇超声清洗各30min；
(2)将清洗后的钛片放入5mol/L的NaOH溶液中，80℃处理24h；取出钛片，用去离子水轻轻清洗，并放置烘箱中于40℃下干燥；
(3)将干燥后的钛片放入炉中以10℃/min，升温至600℃，保温热处理1h，待炉内温度自然冷却到室温之后，取出钛片；
(4)配制含有重组胶原蛋白的1.5倍的仿生液；
(5)将步骤(1)处理好的钛片放置于12孔板中，每孔分别添加5mL的1.5倍的仿生液，并于37℃下静置2～14天，每12h换一次1.5×CSBF液；
(6)将步骤(5)中浸泡于1.5×CSBF中的钛片取出，用去离子水清洗，自然干燥，即可得到钛表面生物活性涂层，该涂层为重组胶原蛋白-羟基磷灰石复合涂层。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的钛片为10×10×1mm3的钛片。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述钛片包括纯钛金属、镍钛合金、钛铬合金或其它钛合金。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)配制含有重组胶原蛋白的1.5倍的仿生液：按下表1L仿生液中包含的成分，pH值为7.4，由去离子水定容，得到1.5×CSBF溶液；
Figure A2009101006240002C1
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：用1M盐酸调pH至7.4。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
(1)将10×10×1mm3的钛片依次经去离子水、无水丙酮和无水乙醇超声清洗各30min；
(2)将清洗后的钛片放入5mol/L的NaOH溶液中，80℃处理24h；取出钛片，用去离子水轻轻清洗，并放置烘箱中于40℃下干燥；
(3)将干燥后的钛片放入炉中以10℃/min，升温至600℃，保温热处理1h，待炉内温度自然冷却到室温之后，取出钛片；
(4)配制含有重组胶原蛋白的1.5倍的仿生液：按下表依次称量相应的成分，并按表中的顺序逐一溶解在去离子水中，用1M盐酸调pH至7.4，定容至1L，为1.5×CSBF溶液；
Figure A2009101006240003C2
(5)将步骤(1)处理好的钛片放置于12孔板中，每孔分别添加5mL的1.5×CSBF溶液，并于37℃下静置2～14天，每12h换一次1.5×CSBF液；
(6)将步骤(5)中浸泡于1.5×CSBF中的钛片取出，用去离子水小心清洗，自然干燥，即可得到钛表面生物活性涂层，该涂层为重组胶原蛋白-羟基磷灰石复合涂层。
7、权利要求1至6中任一权利要求所述的方法制备的具有重组胶原蛋白-羟基磷灰石复合涂层的钛复合材料。
8、权利要求7所述钛复合材料作为骨修复或替代材料而应用于骨组织工程。
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