CN104224969B - 一种垂丝海棠叶提取物、提取方法及用途 - Google Patents

Abstract

一种垂丝海棠叶提取物、提取方法及用途，属于制药技术领域，其中，垂丝海棠叶提取物为垂丝海棠叶的正丁醇部位或/和乙酸乙酯部位；提取方法包括以下步骤：将垂丝海棠叶的乙醇浸膏分散于水中，依次用乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，挥干溶剂，所得乙酸乙酯萃取物即为垂丝海棠叶的乙酸乙酯部位，所得正丁醇萃取物即为垂丝海棠叶的正丁醇部位。实验证实，本发明提供的垂丝海棠叶提取物能够有效清除DPPH、ABTS自由基，还原Fe3+，因此可用于制备抗氧化剂；该提取物还能够显著降低急性肝损伤小鼠血清中的GPT、GOT的含量以及小鼠肝组织中的MDA含量，提高SOD活力，可用于制备保肝护肝药物。

Description

一种垂丝海棠叶提取物、提取方法及用途

技术领域

本发明属于制药技术领域，具体涉及一种垂丝海棠叶提取物，同时还涉及该提取物的提取方法和用途。

背景技术

垂丝海棠(Malus halliana Koehne)为蔷薇科苹果属落叶乔木，分布于中国大陆的陕西、四川、江苏、安徽、浙江和云南等地。目前，国内外对垂丝海棠的研究主要集中在人工栽培、组培再生及品种数量分类等方面，而对垂丝海棠的药用价值则极少涉及。据有关中医药典籍记载，垂丝海棠花可入药，具有调经和血的功效，多用于治疗吐血、尿血、便血、跌打损伤、骨折等症。但是，垂丝海棠花的其他药理作用或是垂丝海棠其它部位的药用价值目前尚不明确。

肝脏是机体内以代谢功能为主的器官，承担着去氧化、储存肝糖、合成分泌性蛋白质等重要任务。同时，肝脏也是一个比较脆弱的器官，容易受到多种因素损害。由肝损伤引发的肝脏疾病现已成为常见病、多发病，更为严重的是，由肝损伤引发的肝功能衰竭和肝性脑病发病率和死亡率都很高，对人类健康造成了极大地威胁。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种垂丝海棠叶提取物，同时还提供了该提取物的提取方法和用途。

基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：一种垂丝海棠叶提取物，为垂丝海棠叶的正丁醇部位或/和乙酸乙酯部位。

所述垂丝海棠叶的乙酸乙酯部位是将垂丝海棠叶的乙醇浸膏分散于水中，用乙酸乙酯进行萃取所得的乙酸乙酯萃取物。

所述垂丝海棠叶的正丁醇部位是将垂丝海棠叶的乙醇浸膏分散于水中，用正丁醇进行萃取所得的正丁醇萃取物。

所述乙醇浸膏通过以下方法获得：垂丝海棠叶经干燥、粉碎后，用60～80V%的乙醇浸提2～3次，每次1～3h，合并浸液，过滤、浓缩即得乙醇浸膏。

浸提温度为50～70℃。

所述垂丝海棠叶提取物的提取方法，包括以下步骤：将垂丝海棠叶的乙醇浸膏分散于水中，依次用乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，挥干溶剂，所得乙酸乙酯萃取物即为垂丝海棠叶的乙酸乙酯部位，所得正丁醇萃取物即为垂丝海棠叶的正丁醇部位。

所述提取方法中，乙醇浸膏通过以下方法获得：垂丝海棠叶经干燥、粉碎后，用60～80V%的乙醇浸提2～3次，每次1～3h，合并浸液，过滤、浓缩即得乙醇浸膏。

乙醇浸提时温度为50～70℃。

将所述的垂丝海棠叶提取物用于制备抗氧化剂。

将所述的垂丝海棠叶提取物用于制备保肝护肝药物。

本发明分别用DPPH、ABTS和FRAP三种方法对垂丝海棠叶的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位进行了体外抗氧化测定，并以二丁基羟基甲苯（BHT）为阳性对照，对测定结果进行了分析：垂丝海棠叶的乙酸乙酯部位和正丁醇部位均具有较强的抗氧化活性，其中，垂丝海棠叶乙酸乙酯部位清除ABTS自由基的能力强于其它提取部位，垂丝海棠叶正丁醇部位清除DPPH自由基和还原Fe³⁺的能力较强。由此可见，本发明提供的垂丝海棠叶提取物可以用于制备抗氧化剂。

近几年来，抗氧化剂在国内发展迅速，其用途越拓越广，不但可以添加在动植物油及食品中，防止食物变质，还可以添加到化妆品中延缓皮肤老化速度。

对于机体而言，抗氧化物质能够抑制ROS的产生和过氧化氢的生成，减少DNA的氧化损伤，抑制脂质过氧化。人类的许多疾病包括衰老、癌变、糖尿病、心血管病及肝损伤等都与过氧化有关，因此，有些抗氧化剂还可以用于治疗疾病。

本发明以联苯双酯为阳性对照，分别考察了垂丝海棠叶的正丁醇部位和乙酸乙酯部位对四氯化碳诱导的急性肝损伤小鼠的治疗作用。实验结果表明，垂丝海棠叶的乙酸乙酯部位和正丁醇部位能够使四氯化碳致急性肝损伤小鼠血清中的GOT和GPT水平显著降低，降低急性肝损伤小鼠肝脏中MDA含量，升高SOD活力；本发明提供的垂丝海棠叶提取物对急性肝损伤具有很好的保护作用，可用于制备保肝护肝药物。

附图说明

图1为不同提取部位质量浓度对ABTS自由基的影响；

图2为Trolox标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种垂丝海棠叶提取物，为垂丝海棠叶的乙酸乙酯部位。垂丝海棠叶的乙酸乙酯部位是将垂丝海棠叶的乙醇浸膏分散于水中，用乙酸乙酯进行萃取所得的乙酸乙酯萃取物。

其相应的提取方法包括以下步骤：

（1）垂丝海棠叶经自然干燥、粉碎后，用60V%的乙醇常温下浸提3次，每次3h，合并浸液，过滤、浓缩即得乙醇浸膏。

（2）将垂丝海棠叶的乙醇浸膏分散于水中，用乙酸乙酯进行萃取，萃取液挥干溶剂，得到乙酸乙酯萃取物，即为垂丝海棠叶的乙酸乙酯部位。

将上述垂丝海棠叶提取物用于制备抗氧化剂。

将上述垂丝海棠叶提取物用于制备保肝护肝药物。

实施例2

一种垂丝海棠叶提取物，为垂丝海棠叶的正丁醇部位。垂丝海棠叶的正丁醇部位是将垂丝海棠叶的乙醇浸膏分散于水中，用正丁醇进行萃取所得的正丁醇萃取物。

其相应的提取方法包括以下步骤：

（1）垂丝海棠叶经干燥、粉碎后，用80V%的乙醇于70℃浸提2次，每次1h，合并浸液，过滤、浓缩即得乙醇浸膏。

（2）将垂丝海棠叶的乙醇浸膏分散于水中，依次用乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，挥干溶剂，所得正丁醇萃取物即为垂丝海棠叶的正丁醇部位。

将上述垂丝海棠叶提取物用于制备抗氧化剂。

将上述垂丝海棠叶提取物用于制备保肝护肝药物。

实施例3

一种垂丝海棠叶提取物，为垂丝海棠叶正丁醇部位和乙酸乙酯部位的混合物。其中，垂丝海棠叶的乙酸乙酯部位是将垂丝海棠叶的乙醇浸膏分散于水中，用乙酸乙酯进行萃取所得的乙酸乙酯萃取物；正丁醇部位是将垂丝海棠叶的乙醇浸膏分散于水中，用正丁醇进行萃取所得的正丁醇萃取物。

其相应的提取方法包括以下步骤：

（1）垂丝海棠叶经干燥、粉碎后，用70V%的乙醇50℃下浸提2次，每次2h，合并浸液，过滤、浓缩即得乙醇浸膏。

（2）将垂丝海棠叶的乙醇浸膏分散于水中，依次用乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，挥干溶剂，所得乙酸乙酯萃取物即为垂丝海棠叶的乙酸乙酯部位，所得正丁醇萃取物即为垂丝海棠叶的正丁醇部位。将两者混合，即为产品。

将上述垂丝海棠叶提取物用于制备抗氧化剂。

将上述垂丝海棠叶提取物用于制备保肝护肝药物。

实施例4效果实验

4..1样品准备

取垂丝海棠叶，经自然干燥、粉碎后，用70V%的乙醇50℃下浸提2次，每次1h；合并浸液，过滤、浓缩即得乙醇浸膏。将所得垂丝海棠叶的乙醇浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，萃取之后挥干溶剂，得到垂丝海棠叶的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。各提取部位得率见表1。

4..2垂丝海棠叶提取物的体外抗氧化活性实验

4..2..1DPPH方法

原理：DPPH·是一种以氮为中心的稳定自由基，在可见光区515nm附近有强吸收，其乙醇水溶液显深紫色。当有供氢能力的抗氧化剂存在时，DPPH·的孤对电子被配对，其吸收消失或减弱。因而可用分光光度法进行定量分析，通过吸光度变化来检测自由基被消除的程度，进而评价某种物质的抗氧化能力。抗氧化能力可用清除率来表示，清除率越大，则抗氧化能力越强。

仪器：电子天平(美国Mettler-Toledo公司)；旋转蒸发仪(东京理化)；MultiskanMK3酶标仪(美国thermo Electron公司)；MS-H1型混合器(北京博励阳科技公司)。

试剂：二苯代苦味酰基自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·，日本东京化成工业株式会社)；BHT(二丁基羟基甲苯，比利时Acros organic公司)；其他试剂均为分析纯；

检测方法：先将10μL样品溶液和10μL阳性对照药物二丁基羟基甲苯(BHT)溶液依次加入到96微孔板中，再加入175μL200μmol/L的DPPH甲醇溶液，以阴暗处反应20min后，用酶标仪在515nm处测定样品及阳性对照药物BHT的OD值。甲醇溶液做空白对照，每份样品平行操作3次，取平均值，然后按照下式计算清除率：

DPPH·清除率(%)=[(A_control-A_sample)/A_control]×100%，

式中，A_control为DPPH·本身在测定波长的吸收度，A_sample为样品对DPPH作用后的吸收度数值（除去样品自身吸收）。即为样品的初筛抑制率，若样品初筛抑制率>50%，则进行半倍稀释当抑制率<50%时，利用origin6.0软件计算其相应IC₅₀值。

4..2..2ABTS方法

原理：ABTS是一种水溶性的自由基引发剂，经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS^·+。加入待测物质，当待测物质中含有抗氧化物时，该物质会与ABTS^·+发生发应而使反应体系颜色褪去。ABTS⁺在734nm处有最大吸收。

仪器：UV-2000型紫外可见分光光度计(上海尤尼科仪器有限公司)；电子天平(美国Mettler-Toledo公司)；旋转蒸发仪(东京理化)；Multiskan MK3酶标仪(美国thermo Electron公司)；MS-H1型混合器(北京博励阳科技公司)等。

试剂：[2,2′-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐](ABTS，美国Fluka公司)；二丁基羟基甲苯(BHT，比利时Acros organics公司)；其他试剂均为分析纯。

检测方法：将粉末状ABTS溶解于蒸馏水，配制成3.5mL7mmol/L的溶液，与5mL2.45mmol/L的K₂S₂O₈溶液混合，使用前在暗处放置12h以上，使用时用甲醇稀释使吸光度在734nm处为0.78～0.82，得到ABTS自由基工作液，待用。样品用甲醇配制成初始浓度为2.0mg/mL的溶液。取10μL样品加入200μLABTS自由基工作液混匀，测定吸光度。

每个样品进行3次平行检测，取平均值，按照下式计算ABTS清除率：

ABTS清除率(%)=[(A_control-A_sample)/A_control]×100%，

式中，A_control为ABTS自由基本身在测定波长的吸收度，A_sample为样品对ABTS自由基作用后的吸收度数值(除去样品自身吸收)。初筛抑制率即为ABTS自由基在样品质量浓度为2mg/mL时的清除率。图1即为ABTS自由基清除率与抗氧化质量浓度的关系。

4..2..3FRAP法

原理：在低pH值的溶液中，Fe³⁺-三吡啶三哑嗪（tripyridyl-triazine，TPTZ）可被抗氧化剂还原为二价铁形式，呈现出明显的蓝色，并在593nm处有最大吸收。因此可以根据吸光度的大小计算出抗氧化活性的强弱，结果以Fe²⁺当量或相对于标准抗氧化剂的能力来表示。一般采用Trolox来表示样品的抗氧化活性。

仪器：Multiskan MK3酶标仪(美国thermo Electron公司)；电子天平(美国Mettler-Toledo公司)；UV-2000型紫外可见分光光度计(上海尤尼科仪器有限公司)；旋转蒸发仪(东京理化)；MS-H1型混合器(北京博励阳科技公司)等。

试剂：Trolox(6-hydroloxy-2,.5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid,Aldrich)；Fe³⁺-三吡啶三哑嗪(2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ;比利时Acrossorganics公司)；BHT(二丁基羟基甲苯，比利时Acros organic公司)；其他试剂均为分析纯；

检测方法：将样品用甲醇配制成初始浓度为2.0mg/mL的溶液，取10μL样品加入到96微孔板中，加入200μL新鲜配制的TPTZ工作液，混匀，37℃反应30min后，用酶标仪在593nm测定吸光度。每份样品平行操作3次，取平均值。图2为Trolox标准曲线，以593nm处的吸光度值根据图2中公式换算成Trolox当量浓度，结果以Trolox当量(即每克样品的自由基清除能力相当于Trolox的自由基清除能力的微摩尔数)表示，若所测定样品吸光度值超过线性范围，则需要进一步稀释样品。

4..2..4结果分析

表1垂丝海棠叶各提取部位得率及抗氧化活性

注：BHT为阳性对照品。

(1)由表1可以看出，垂丝海棠叶的正丁醇部位和乙酸乙酯部位都具有很强的抗氧化活性，其中，垂丝海棠叶的乙酸乙酯部位清除ABTS自由基的能力(IC₅₀=3.5μg/mL)强于其他提取部位，垂丝海棠叶的正丁醇部位清除DPPH自由基的能力(IC₅₀=35.8μg/mL)和还原Fe³⁺的能力(TEAC=869.7μmol/g)较强。

(2)由图1和表1所示，垂丝海棠叶乙酸乙酯部位和正丁醇部位的初筛抑制率均>50%，则需要讲样品质量浓度进行半倍稀释，质量浓度依次稀释为2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL和0.0625mg/mL。垂丝海棠叶乙酸乙酯部位和正丁醇部位分别对应的清除率为99.32%、99.11%、97.29%、84.82%、62.03%、48.64%和98.2%、98.1%、98.08%、80.1%、56.05%、30.29%。当质量浓度为0.0625mg/mL时，垂丝海棠叶的正丁醇部位和乙酸乙酯部位清除率分别为30.29%和48.64%，随着质量浓度的增加，清除率也增大。当质量浓度为0.5mg/mL时，垂丝海棠叶正丁醇部位和乙酸乙酯部位的清除率达到98.09%和97.29%。当质量浓度>0.5mg/mL时，清除率几乎不变，说明抗氧化作用已经接近饱和。可得出垂丝海棠叶提取物清除ABTS自由基的能力与质量浓度呈正量效关系。

综上所述，垂丝海棠叶的乙酸乙酯部位和正丁醇部位均具有明显的抗氧化作用，可用于制备抗氧化剂。

4..3垂丝海棠叶提取物的体内保肝实验

4..3..1动物材料：成年昆明小鼠，雄性，体重20±2g。

4..3..2主要试剂与仪器：四氯化碳为分析纯，由天津市红岩化学试剂厂生产；橄榄油为上海卫辉化学试剂厂产品；谷草转氨酶(GOT，20130302)、谷丙转氨酶(GPT，20130306)、丙二醛(MDA，20130305)、超氧化物歧化酶(SOD，20121119)测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。联苯双酯滴丸由浙江万邦药业有限公司生产，批号为120314；考马斯亮蓝G250由上海化学试剂公司分装厂生产，批号为20050115；牛清蛋白由北京奥博星生物技术有限责任公司生产，其他试剂均为分析纯；Multiskan MK3酶标仪(美国Thermo Electron公司)；UV-2000型紫外可见分光光度计(上海尤尼科仪器有限公司)；LRH-150恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)。

4..3..3实验方法

取健康昆明种系小鼠90只，雄性，4-6周龄，体重20±2g。将小鼠随机分为9组，每组10只，分别标记为试验组1-6、阳性对照组、模型组和空白组。参照表2的给药类型和给药剂量给小鼠连续灌胃8d，最后一次给药2h后开始造模：配制0.4V%的CCl₄橄榄油溶液，并按照0.1mL/10g体重的剂量为试验组1-6、阳性对照组以及模型组小鼠进行腹腔注射，建立小鼠急性肝损伤模型。各组禁食不禁水，12h后摘除小鼠眼球取血，血浆室温静置30min，待血清分离后离心，将得到的血清置于0-3℃冰箱中保存,待测定血清中GOT、GPT酶的活力，测定结果见表2。

快速分离小鼠肝脏，制备质量分数为10%和1%的肝脏组织匀浆液，考马斯亮蓝法测定二者的蛋白含量。按照试剂盒说明分别测定肝脏匀浆液中MDA的含量和SOD的活力，测定结果见表3。

SOD含量计算公式：SOD(U/mL)=[(A_对照管-A_测定管)/A_对照管]/50%*反应体系稀释倍数/组织蛋白含量(mgprot/mL)；

MDA含量计算公式：MDA(nmol/mgprot)=(测定管吸收度-测定空白管吸收度)/(标准管吸收度-标准空白管吸收度)*标准品浓度(10nmol/mL)*样本测定前稀释倍数/组织蛋白含量(mgprot/mL)。

利用酶标仪测定数据，结果处理：采用SPSS17.0软件进行统计学处理，所有数据采用表示，以One-way ANOVA分析各组别之间的差异，两组均数比较采用t检验。

4..3..4结果分析

表2垂丝海棠叶提取物对肝损伤小鼠GOT和GPT的影响(n=10)

注：与阳性对照组比较：^＃P<0.05^＃＃P<0.01^＃＃＃P<0.001；与模型组比较：^*P<0.05^**P<0.01^***P<0.001；与空白组比较：^ΔP<0.05^ΔΔP<0.01^ΔΔΔP<0.001。

表3垂丝海棠叶提取物对肝损伤小鼠SOD和MDA的影响(n=10)

注：与阳性对照组比较：^＃P<0.05^＃＃P<0.01^＃＃＃P<0.001；与模型组比较：^*P<0.05^**P<0.01^***P<0.001；与空白组比较：^ΔP<0.05^ΔΔP<0.01^ΔΔΔP<0.001。

四氯化碳肝损伤模型是现在国际上常用的化学性肝损伤模型。目前，公认CCl₄引起肝损伤的机制是CCl₄在肝微粒体细胞色素P-450酶激活下产生活性自由基CCl₃·和Cl·，这些自由基与肝细胞内大分子发生共价结合，攻击肝细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，损伤肝细胞膜的结构和功能，使肝细胞膜的通透性升高，细胞质内GOT和GPT渗入血液，使血清中GOT和GPT活性升高，肝脏匀浆液中SOD的活力及MDA含量常可反映体内脂质过氧化反应程度，间接反映机体组织、细胞损伤的程度。通过检测小鼠肝匀浆中的SOD活力及MDA含量可反映出药物对肝细胞的保护作用。

(1)从表2可以看出，模型组与空白组比较，四氯化碳急性肝损伤小鼠血清中GOT含量升高，GPT的含量升高具有显著性(P<0.001)，证明造模成功。与模型组比较，试验组1-6小鼠血清中GOT水平和GPT水平均有明显降低，其中试验组2（正丁醇部位中剂量组）、试验组5（乙酸乙酯部位中剂量组）小鼠血清中GOT水平降低显著(P<0.05)，试验组3（垂丝海棠叶正丁醇低剂量）和试验组5、6（乙酸乙酯部位中、低剂量组）小鼠血清中GPT水平降低显著(P<0.01)。上述结果表明，垂丝海棠叶乙酸乙酯部位和正丁醇部位均对化学性肝损伤均有保护作用。

(2)表3显示，模型组较空白组MDA含量升高，SOD活力明显降低(P<0.001)，表明造模成功。与模型组比较，试验组1-6小鼠肝均浆中SOD活力均有所升高，MDA含量均有大幅降低，其中试验组1（垂丝海棠叶正丁醇部位高剂量组）(P<0.001)和试验组4（垂丝海棠叶乙酸乙酯高剂量）MDA含量降低显著(P<0.01)。

Claims (2)

1.垂丝海棠叶提取物用于制备抗氧化剂的用途，其特征在于，所述垂丝海棠叶提取物为垂丝海棠叶的正丁醇部位或/和乙酸乙酯部位；具体经下述步骤提取获得：

取垂丝海棠叶，经自然干燥、粉碎后，用70V%的乙醇50℃下浸提2次，每次1h；合并浸液，过滤、浓缩即得乙醇浸膏；将所得垂丝海棠叶的乙醇浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，萃取之后挥干溶剂，得到垂丝海棠叶的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

2.垂丝海棠叶提取物用于制备保肝护肝药物的用途，其特征在于，所述垂丝海棠叶提取物为垂丝海棠叶的正丁醇部位或/和乙酸乙酯部位；具体经下述步骤提取获得：

取垂丝海棠叶，经自然干燥、粉碎后，用70V%的乙醇50℃下浸提2次，每次1h；合并浸液，过滤、浓缩即得乙醇浸膏；将所得垂丝海棠叶的乙醇浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，萃取之后挥干溶剂，得到垂丝海棠叶的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。