CN101869299A - 栽培菊苣提取物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然植物的提取，特别是栽培菊苣提取物。栽培菊苣(Cichorium endivia L.)经过乙醇提取、石油醚和乙酸乙酯萃取纯化、浓缩干燥而成，最终得到具有很强抗氧化活性的物质，属于天然产物提取领域。该提取物经ORAC抗氧化能力、清除DPPH自由基能力和福淋酚还原能力测试显示，其抗氧化活性比维生素C强，同时也能有效抑制红细胞溶血。本发明采用栽培菊苣为原材料制备强抗氧化活性物质，工艺和设备简单，投资较少，适合大规模生产，适用于医药及食品添加剂、保健品、化妆品等行业。

Description

栽培菊苣提取物及其应用

技术领域

本发明涉及天然植物的提取，特别是栽培菊苣提取物，该提取物具有天然抗氧化活性，可以制成抗氧化剂，用于防止食品氧化，预防疾病，提高机体免疫力，以及为延年益寿的保健品、药品、化妆品的添加剂。

技术背景

氧自由基不仅能破坏富含油脂的食品，还会侵害生物体内许多重要的生物分子，如细胞膜、蛋白质和DNA，造成细胞和组织的损伤。因此清除氧自由基成为保存食物和预防人类疾病的重要防治手段。目前的抗氧化剂多以人工合成为主，因其毒性作用而在使用上受到很大程度的限制。很多蔬菜和水果中都含有许多抗氧化的活性成分，它们能够清除自由基、淬灭单线态氧或者螯合金属离子，这些作用不仅体现了这些蔬菜水果的营养价值，还提示它们可开发成为抗氧化剂的潜力。

栽培菊苣(Cichorium endivia L.)又称苦苣，或苦菊，多作为沙拉辅料或蔬菜食用，我国目前也有了人工引种栽培。苦菊具有抗菌、解热、消炎、明目等功效，但至今未见苦菊有效成分提取工艺及其相关生物学特性检测的研究报道。

发明内容

本研究的目的是提供一种低成本、适合于产业化开发的、从苦菊中提取抗氧化活性物质的方法

本发明是通过以下技术方案来实现的：

(1)将栽培菊苣于阴凉处晾干，粉碎后，加入浓度为50～100％的乙醇溶液进行提取，提取比例1∶5～1∶30，提取时间1～2h，重复浸提4次，过滤。

(2)提取液浓缩后，混悬于30～95％乙醇溶液中，用石油醚萃取4次(石油醚与混悬液的比例是1∶1～1∶5)。

(3)将石油醚萃取后的水层挥干至无醇味，加水混悬，用乙酸乙酯萃取3次(乙酸乙酯与混悬液的比例是1∶1～1∶5)。

(4)萃取后乙酸乙酯部位经浓缩，真空干燥得到提取物。

本发明栽培菊苣提取义物(KJ-E)具有抗氧化活性的特点，可以作为食品抗氧化剂应用于食品的抗氧化作用，也可用于防治疾病，提高机体免疫力，以及作为延年益寿的保健品、药品、化妆品的添加剂。该植物资源丰富，提取简便。

具体实施方式

1栽培菊苣提取物的制备

本发明通过以下实施例子进一步详述，但本实施例子所属的技术内容是说明性的，而不是限定性的，不应以此来局限本发明的保护范围。

本发明所涉及的从栽培菊苣提取抗氧化活性物质的方法步骤如下：

购自北京新发地菜市场的栽培菊苣，将干燥全草5.8kg于95％乙醇回流提取三次(80L×2h、70L×1h、68L×1h)，过滤，合并滤液，减压浓缩，所得浸膏混悬于70％乙醇溶液中(总体积3.5L)，石油醚萃取四次(2L，1.5L，1.5L，1.5L)，醇层减压浓缩至无醇味，加水混悬约2.3L，乙酸乙酯萃取三次(1.5L，1.2L，1.2L)，减压浓缩后挥干溶剂，真空干燥。

2栽培菊苣的抗氧化活性测定结果

将KJ-E用二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成一定浓度的溶液，以Trolox(水溶性的维生素E)和Vc(维生素C)为阳性对照，进行DPPH自由基清除试验、ORAC抗氧化能力测试、福淋酚还原能力测试和红细胞溶血试验。实验方法如下：

(1)DPPH自由基清除试验

清除DPPH自由基能力测试的反应体系在96孔板中进行，每孔加入一定浓度的苦菊提取液或阳性对照药20μl，然后迅速加入终浓度为150μmol·L^-1的DPPH·(溶于无水乙醇)180μl，震荡混匀后采用酶标仪于517nm波长处检测OD值，同时以20μl DMSO代替测试液作为空白对照。经过多个时间点的检测，以测试液的OD值不再发生改变作为最终测量值。抗自由基活性以测试液达到50％DPPH·清除率时的浓度(EC₅₀)进行表达，DPPH·清除率公式为：

DPPH·清除率＝(1-ODi/ODf)×100％

其中ODi指加入测试液时DPPH·溶液的OD值，ODf为空白对照的DPPH·溶液的OD值；根据测试液不同浓度的清除率作曲线算出EC₅₀。

(2)ORAC抗氧化能力测试

配制75mM磷酸钾缓冲液，调pH值至7.4。使用磷酸钾缓冲液配制荧光素钠溶液(终浓度为61.2nM)和2，2-偶氮-双-(2-脒基丙烷)氯化二氢(AAPH)溶液(终浓度为19.1mM)，并用磷酸钾缓冲液稀释样品和阳性对照药成一定浓度。反应体系在荧光酶标板中进行。具体操作步骤参照表1：

表1  ORAC抗氧化能力测试操作步骤(单位：μL)

实验所得的各个微孔的荧光强度数据通过软件输出到Excel表格中，进行下一步的处理。各个微孔不同时间点的绝对荧光强度数据与其初始时间的荧光强度相比，折算成相对荧光强度f，以相对荧光强度采用近似积分法计算荧光衰退曲线下面积(AUC)，其公式为

AUC＝0.5×[2×(f₀+f₁+…+f_n-1+f_n)-f₀-f_n]×Δt

其中f_n表示第n个测定点的相对荧光强度，Δt是相邻两个时间点之间的时间间隔。

通过时间-相对荧光强度作图，抗氧化剂作用下的荧光衰退曲线下面积与无抗氧化剂存在时自由基作用的荧光衰退曲线下面积之差，即抗氧化剂的氧化自由基消除能力ORAC值，义称为抗氧化剂的抗氧化能力指数，是通过荧光衰退曲线下的保护面积与标准抗氧化物质(Trolox)的保护面积相比得出。ORAC值以trolox当量(μmol Trolox当量/mg)表达。

(3)福淋酚还原能力测试

反应体系在96孔板和酶标仪进行检测。方法如下：溶于DMSO的药物组分、单体和阳性药分别稀释为2g/L。以上试剂溶液分别取10μL溶于600μL的蒸馏水，混匀，在96孔板中每孔加150μL，然后依次加入福淋酚试剂12.5μL，蒸馏水50μL和1M的Na₂CO₃37.5μL。置于37℃烘箱中2h，使用酶标仪于波长725nm处，测定OD值。结果以没食子酸当量(μmol没食子酸当量/mg)表达。

操作步骤参照表2：

表2  福淋酚还原能力实验操作步骤

(4)红细胞溶血试验

从家兔耳中央动脉取血约5～10ml，放入有玻璃珠的三角瓶中振摇10分钟，再加PBS，摇匀后将混悬液以2500rpm离心5min，弃上清，反复洗红L细胞3～4次，直至上清液无色透明。将所得红细胞按其容积用PBS配成2％红细胞混悬液，供试验用。制备2％红细胞悬液，加入样品37℃孵育30min，然后加入50mM的自由基引发剂2，2-偶氮-双-(2-脒基丙烷)氯化二氢(AAPH)，37℃孵育4h。AAPH能引起红细胞膜磷脂发生过氧化反应，导致红细胞破裂，释放出血红蛋白。对红细胞悬液行4000rpm离心，取上清，使用酶标仪于545nm波长下测定OD值。

红细胞溶血率(％)＝A/B×100％，A：试样体系的OD值，B：完全溶血OD值

以上实验结果参照表3和4。

表3  样品的清除DPPH自由基、ORAC抗氧化试验和福淋酚还原能力测试

表4  样品抑制红细胞溶血试验

以上结果显示，栽培菊苣提取物KJ-E具有一定的清除自由基、抗氧化和还原能力，活性比维生素C强，红细胞溶血试验提示KJ-E在细胞水平上也具有一定的抗氧化能力。

Claims (2)

1.一种栽培菊苣提取物在食品、药品、化妆品及保健品中的应用，其特征在于：其提取方法的步骤如下：

(1)将栽培菊苣于阴凉处晾干，粉碎后，加入浓度为20～100％的乙醇溶液进行提取，提取比例1∶5～1∶30，提取1～4h，重复浸提4次，过滤。

(2)提取液浓缩后，混悬于30～95％乙醇溶液中，用石油醚萃取1～6次(石油醚与混悬液的比例是1∶1～1∶10)。

(3)将石油醚萃取后的水层挥干至无醇味，加水混悬，用乙酸乙酯萃取1～4次(乙酸乙酯与混悬液的比例是1∶1～1∶10)。

(4)萃取后乙酸乙酯部位经浓缩，真空干燥，得到提取物。

2.权利要求1所述的栽培菊苣提取物作为天然食品抗氧化剂在制备食品、药品、化妆品及保健品中的应用，以及经作为清除人体自由基、抗衰老的食品、药品、化妆品及保健品中的应用。