CN104220586A - 利用超声波提取胶原蛋白的方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明是有关于一种利用超声波机提取胶原蛋白的方法，更详细而言，是有关于一种包含在酸性溶液中进行超声波处理而获取胶原蛋白提取物的第1步骤、及从所述胶原蛋白提取物分离胶原蛋白与经超声波处理的鱼皮的第2步骤，且对所述经超声波处理的鱼皮重复执行第1步骤及第2步骤而提取胶原蛋白的方法。另外，本发明的利用超声波的胶原蛋白分离装置的特征在于包含：试料箱，其收容鱼皮；分离单元，其接收供给自试料箱的鱼皮而分离成胶原蛋白，从而将所分离的胶原蛋白再次供给至试料箱；及超声波产生单元，其连接在分离单元，以便产生用以将鱼皮分离成胶原蛋白的超声波。本发明的胶原蛋白提取方法较现有的方法减少酸性溶液的浓度，以较高的产出率提取胶原蛋白，并可直接以原有基本结构提取高分子量的胶原蛋白而并非胶原蛋白的水解产物形态。

Description

利用超声波提取胶原蛋白的方法及装置
技术领域
本发明是有关于一种利用超声波提取胶原蛋白的方法及其装置。
背景技术
胶原蛋白是一种包含在皮肤、血管、骨骼、内脏等几乎所有组织中，且约占构成身体的蛋白质的30%的主要蛋白质。构成人体的胶原蛋白中的约40%存在于皮肤，20%包含在骨骼及软骨中，除此在外，广泛地分布在血管、内脏等。这种胶原蛋白自古以来一直以明胶等形态食用，这种明胶最近由消化道内的酶来分解而以多肽、氨基酸的形态吸收，这些多肽、氨基酸提高免疫功能，促进细胞的再生作用而使关节强健，且维持皮肤的新陈代谢活化及保湿力，由此对皮肤美容发挥卓越的效果。胶原蛋白主要从家畜的皮、骨骼、关节等提取，但最近因BSE(Bovine Spongiform Encephalopathy，疯牛病)、口蹄疫等的产生而对动物性胶原蛋白的印象较差，因此从鱼类的皮肤、鳞等提取的海洋胶原蛋白的价值逐渐增大。
另一方面，以往使用如酸、碱、盐等的化学物质来提取胶原蛋白，但存在因此产生环境污染及废水处理费用等问题点。
因此，现实情况为要求研究开发如下方法：尽可能不使用化学物质，而可绿色环保地提取胶原蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用通过超声波处理提取胶原蛋白的方法，将化学物质的使用量最小化而使产出率最大地从鱼皮提取胶原蛋白的方法及其装置。
为了达成所述目的，在本发明的一具体例中，提供一种提取胶原蛋白的方法，其包含如下步骤：第1步骤，其是在0.01～0.5M的乙酸溶液中，对鱼皮进行0.1至10小时的超声波处理而获取胶原蛋白提取物；及第2步骤，其是从所述胶原蛋白提取物，分离胶原蛋白与经超声波处理的鱼皮；且对所述经超声波处理的鱼皮重复执行第1步骤及第2步骤。另外，所述超声波处理可在20kHz的频率下实现，所述超声波的振幅可为75～85%，所述超声波处理可在0至10℃下执行，将所述胶原蛋白提取物离心分离而获得上清液，向该上清液添加氯化钠(NaCl)并使沉淀而可提取或分离胶原蛋白，在进行8次所述第1步骤及第2步骤的情况下，超声波的振幅能够以20～40%执行24小时。
在一具体例中，提供利用所述方法而提取的胶原蛋白。
在一具体例中，提供一种提取胶原蛋白的方法，其包含如下步骤：第1步骤，其是在酸性溶液中，对鱼皮进行超声波处理而获取胶原蛋白提取物；及第2步骤，其是从所述胶原蛋白提取物，分离胶原蛋白与经超声波处理的鱼皮；且对所述经超声波处理的鱼皮重复执行第1步骤及第2步骤。
在一具体例中，提供一种利用超声波的胶原蛋白分离装置，其特正在于包含：试料箱，其收容鱼皮；分离单元，其接收供给自所述试料箱的所述鱼皮而分离成胶原蛋白，将所分离的所述胶原蛋白再次供给至所述试料箱；超声波产生单元，其连接在所述分离单元，以便产生用以将所述鱼皮分离成所述胶原蛋白的超声波。
利用所述超声波的胶原蛋白分离装置更包含为了阻隔分离所述胶原蛋白时产生的热，向所述分离单元侧供给冷却水的冷却部，所述分离单元可包含：处理部，其接收供给自所述试料箱的鱼皮而将该鱼皮分离成胶原蛋白；及第1冷却水流入流出部，其从所述处理部的外周面隔开一定间隔而封闭所述处理部的外部，由此提供可使供给自所述冷却部的所述冷却水流入及流出的空间。
所述试料箱可包含：储存部，其储存所述鱼皮；及第2冷却水流入流出部，其从所述储存部的外周面隔开一定间隔而封闭所述储存部的外部，由此提供可使供给自所述冷却部的所述冷却水流入及流出的空间。
所述超声波产生单元可包含：至少一个振动子，其结合在所述处理部的外周面而产生超声波；及振动调节控制器，其调节所述振动子的输出程度。
所述振动子可为如下多个振动子：在5～6㎝的范围内彼此隔离配置，以便相互之间不会受到超声波的影响。
通过所述振动子产生的超声波的频率可为20kHz。
所述振动调节控制器的输出可为0.1～1000W。
所述冷却部可包含：冷却本体；第1冷却水流入管，其从所述冷却本体的下侧向所述第1冷却水流入流出部的下侧延长，以便冷却水可从所述冷却本体向所述第1冷却水流入流出部侧流入；第1冷却水流出管，其从所述第1冷却水流入流出部的上侧向所述冷却本体的上侧延长，以便冷却水可从所述第1冷却水流入流出部向所述冷却本体侧流出；第2冷却水流入管，其从所述冷却本体的下侧向所述第2冷却水流入流出部的下侧延长，以便冷却水可从所述冷却本体向所述第2冷却水流入流出部侧流入；及第2冷却水流出管，其从所述第2冷却水流入流出部的上侧向所述冷却本体的上侧延长，以便冷却水可从所述第2冷却水流入流出部向所述冷却本体侧流出。
利用所述超声波的胶原蛋白分离装置可更包含：试料供给管，其将所述储存部的下侧与所述处理部的下侧相互连接，以便可从所述储存部向所述处理部侧供给鱼皮；及试料排出管，其将所述处理部的上侧与所述储存部的上侧相互连接，以便可向所述试料箱侧排出利用所述分离单元而分离的胶原蛋白。
利用所述超声波的胶原蛋白分离装置可更包含：循环泵，其具备在所述试料供给管的延长路径上，以便可强制性地使鱼皮及所述胶原蛋白沿所述试料供给管及所述试料排出管循环；及循环量调节控制器，其调节所述循环泵的驱动程度，以便可调节所述鱼皮及所述胶原蛋白的循环量。
本发明的“鱼皮”是指，包含来自可用性海洋生物的海洋胶原蛋白，已去除鱼类的鳞。该“鱼皮”的特性是在不添加酸性溶媒而仅进行超声波处理时，难以引起胶原蛋白纤维的结构变化，从而为了实现胶原蛋白的分离，必须需要酸性溶媒。在本发明中，在酸性溶媒的存在下并行超声波处理，因此在最小浓度的酸性溶媒中，也能够以较高的产出率溶出胶原蛋白。因此，可明显地减少分离胶原蛋白时使用的酸量。
本发明的“胶原蛋白”作为构成动物的结合组织、骨骼、筋、皮肤、软骨、血管等的纤维状结构蛋白质，基本结构单元为原胶原蛋白(tropocollagen)，且是指具有由分子量约为10万分之3个多肽构成的三重螺旋结构，3个多肽链彼此通过氢键结而稳定化，但若加热则切断这些少数键结而成为无规绕制线圈上的明胶，从而可改变物性。
本发明的“超声波处理”是超声波能量使目标对象的粒子振动而破坏对象或使非活化，在生化学中，主要以破坏细胞膜而排出细胞内容物为目的使用，且并不以此为限，使用高于音频频率区域(约为20kHz以下)的振动数的音波。
[发明的效果]
本发明的胶原蛋白提取方法可通过重复实行超声波处理，而较现有的胶原蛋白提取方法减小酸性溶液的浓度，以较高之产出率提取胶原蛋白。另外，根据本发明的胶原蛋白提取方法，可直接以原有基本结构提取高分子量的胶原蛋白而并非胶原蛋白的水解产物形态。
附图说明
图1至图4是表示利用实施例1至4的方法来分离胶原蛋白的情况下的胶原蛋白的分离产出率。
图5是表示利用比较例1至4的方法进行分离的情况下的胶原蛋白的分离产出率。
图6是表示利用实施例1至4的方法进行分离的情况下的胶原蛋白的最大产出率。
图7是表示利用比较例1至4的方法进行分离的情况下的胶原蛋白的最大产出率。
图8是表示利用实施例1及3的方法来分离胶原蛋白的情况下的所分离的胶原蛋白的SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳)图案。
图9是表示利用比较例2至4的方法来分离胶原蛋白的情况下的所分离的胶原蛋白的SDS-PAGE图案。
图10是表示在酸性溶媒的存在下进行超声波处理，直至表示与以0.5M的乙酸进行24小时处理相同的产出率为止的情况下所需的时间。
图11是在使所分离的胶原蛋白与胶原蛋白明胶化的情况下，评估消化力而证明胶原蛋白的结果。
图12是表示根据超声波处理的重复次数的胶原蛋白的提取产出率的图表。
图13是表示根据超声波处理的重复次数而分离的胶原蛋白的SDS-PAGE图案。
图14是本发明的一实施例的利用超声波的胶原蛋白分离装置的概略模式图。
图15是图14的利用超声波的胶原蛋白分离装置的分离单元的概略模式图。
图16是表示使用图14的利用超声波的胶原蛋白分离装置，分离胶原蛋白的方法的顺序图。
图17是表示使用图14的利用超声波的胶原蛋白分离装置，分离胶原蛋白的情况下的胶原蛋白产出率的图表。
图18是表示通过SDS-电泳法，分析使用图14的利用超声波的胶原蛋白分离装置而分离的胶原蛋白的结果的图表。
[符号的说明]
100   胶原蛋白分离装置
110   试料箱
111   储存部
113   第2冷却水流入流出部
130   分离单元
131   处理部
133   第1冷却水流入流出部
150   超声波产生单元
151   振动子
153   振动调节控制器
170   冷却部
171   冷却本体
180a  试料供给管
180b  试料排出管
191   循环泵
192   循环量调节控制器
具体实施方式
以下，根据下述实施例，详细地说明本发明。然而，下述实施例仅例示本发明，本发明的内容并不限定于下述实施例。
实施例
实施例1.试料的前处理
试料是接收供给自O Sung养鱼场(股)的鲈鱼的冷冻鱼皮而使用。鱼皮是在去除残留于一部分内侧的鲈鱼肌肉与鳞后，利用冰水清洗而去除杂质，从而以1.0cm×1.0cm的大小精切。为了完全地去除附着在鱼皮的盐溶性蛋白质，在相对于鱼皮重量添加20倍的0.5M的NaCl溶液后，均匀地进行搅拌而在6,000rpm下进行10分钟的离心分离，从而去除上清液。重复进行3次如上的操作，且所有操作均在4℃以下进行。再次以保管在4℃以下的精制水清洗通过离心分离获得的沉淀物后，相对于沉淀物添加约20倍重量的冷乙醇而一面在4℃下搅拌24小时一面脱脂，从而将其设为精制试料。精制试料保管在-20℃以下，在需要时取出使用。
实施例2.胶原蛋白的提取
2-1.利用超声波处理进行的胶原蛋白的提取
在向所述实施例1中所准备的鱼皮添加约200倍重量的0.01至0.5M的乙酸后，在4℃下以下述表1的条件，进行超声波处理。脉冲的on/off是以20sec/20sec进行。在以6,000rpm对进行超声波处理后获得的粘性溶液进行10分钟的离心分离后，分离上清液，将NaCl以成为5wt%的方式添加至上清液，从而获得白色沉淀。对所述白色沉淀进行离心分离而透析成精制水后，进行冻结干燥而提取胶原蛋白。
表1
2-2.酸可溶性胶原蛋白的提取
以下述表2的条件，相对于试料重量添加200倍的0～0.5M的乙酸，从而一面在4℃下搅拌24小时一面进行提取。在以6,000rpm对所获得的粘性溶液进行10分钟的离心分离后，分离上清液，并将NaCl以成为5wt%的方式添加至上清液，从而获得白色沉淀。在对所述白色沉淀进行离心分离而透析成精制水后，进行冻结干燥而提取胶原蛋白。
表2
区分 乙酸浓度(M)
比较例1 0
比较例2 0.01
比较例3 0.1
比较例4 0.5
2-3.利用重复超声波处理进行的胶原蛋白的提取
在向所述实施例1中所准备的鱼皮添加约200倍重量的0.01M的乙酸后，在4℃下以40%至80%的幅度进行3小时的超声波处理。脉冲的on/off是以20sec/20sec进行。在以6,000rpm对进行超声波处理后所获得的粘性溶液进行10分钟的离心分离后，分离上清液(胶原蛋白)，并在再次向沉淀(残渣)添加200倍重量的0.01M的乙酸后，在4℃下以40%至80%的幅度进行3小时的超声波处理。通过离心分离来分离胶原蛋白，并再次向剩余残渣添加0.01M的乙酸而将重复作业共设为4次至8次，从而分离胶原蛋白。将如上所述般共经过4至8次作业收集的上清液冻结干燥而提取胶原蛋白(参照图12)。
实施例3.胶原蛋白产出率的测定
利用Biuret(双缩脲)法(Gornall,A,G.等，1949)，对上清液测定蛋白质含量，该上清液是在15,000×g下对在所述制造例及比较例中所获得的试料进行20分钟的离心分离而获得。胶原蛋白产出率是在对总蛋白质含量进行超声波处理后，以蛋白质含量的比来根据如下的式而算出。
胶原蛋白产出率(%)＝(上清液中的蛋白质浓度/总蛋白质浓度)×100
将根据处理时间的胶原蛋白产出率示于图1至图5。图1至4表示根据制造例1至4的乙酸浓度的胶原蛋白的产出率，图5表示根据比较例1至5的酸浓度的胶原蛋白的产出率。根据图1至4，表示为由于进行超声波处理，而胶原蛋白的产出率较不进行超声波处理的图5更快地增加。尤其，表现为随着幅度变大而增加的速度变快。根据图5，在不进行超声波处理而仅以0.01M的较低浓度的乙酸进行处理的情况下，胶原蛋白几乎未分离，但根据图1，当在20kHz下以幅度为20%的超声波进行处理时，即便在0.01M的低浓度乙酸中，胶原蛋白的分离量也开始增加。另外，根据图2至4，表现为浓度越高，则胶原蛋白的增幅越大，且表现为在相同的条件下，幅度越大，则其增加速度越快。因此，认为胶原蛋白的分离能力依存于乙酸的浓度及超声波幅度而增加。
另外，将通过超声波重复提取而获得的胶原蛋白的产出率示于图12。以3小时进行8次幅度为40%的超声波处理的胶原蛋白的产出率较通过以往的方法即在0.01M的乙酸中，提取24小时的胶原蛋白的产出率增加3倍以上。而且，以3小时进行4次幅度为80%的超声波处理的胶原蛋白的产出率较以往的方法即0.01M的乙酸中，提取12小时的胶原蛋白的产出率约增加2倍左右。因此，可知在进行超声波重复提取时，胶原蛋白的产出率与超声波的提取次数成正比。
＜胶原蛋白的最大产出率测定＞
利用与所述制造例1相同的方法，测定胶原蛋白的产出率，当产出率增加时，通过下述式算出其速度(ki)。
Ki＝(nt－no)
nt：进行t小时的超声波处理后的溶解度
no:超声波处理前的溶解度
t:超声波处理时间
其结果示于图6及7。图6表示在制造例1至4的酸性溶媒中以超声波进行处理的情况、及仅以比较例1至4的酸性溶媒进行处理的情况下的胶原蛋白最大产出率。在图6中，各记号表示0%(●)、20%(○)、40%(▼)、60%(▽)、及80%(■)的幅度。图7表示胶原蛋白产出率的增加速度。
根据图6，乙酸的浓度越增加即超声波的幅度越增加，则胶原蛋白的最大产出率表现地越高，乙酸浓度为0.1M时的最大产出率与为0.5M时的最大产出率相似，因此可推测如下情况：即使将乙酸浓度增加至0.5M以上，最大产出率的增加也微不足道。另外，在不添加乙酸而进行超声波处理的情况下，也几乎不会引起胶原蛋白的分离。在仅利用酸性溶媒进行处理的比较例的情况下，随着乙酸浓度增加而最大产出率也增加，但增加速度慢于并行超声波处理的情况。另外，在乙酸浓度为0M的情况下，不会引起胶原蛋白的分离，从而可知在胶原蛋白的分离中需要酸。
根据图7，详细地观察对胶原蛋白产出率的增加速度波及影响的超声波的幅度与乙酸浓度的关系，结果无论于何种条件下，均表现直线关系，且各个直线关系的关系式如下。即，0.01M下的乙酸与幅度的关系式为y＝0.0198x＋0.2296，在0.1M下，y＝0.0418x＋0.6832，在0.5M下，y＝0.044x＋1.2633。根据该式，倾斜度是根据乙酸浓度而不同，相比0.01M的乙酸，倾斜度在0.1M以上增加，从而在0.1M以上的乙酸的存在下，快速地引起胶原蛋白的分离。另外，对0.1M与0.5M的乙酸进行比较，倾斜度几乎相同，从而在0.5M以上的乙酸浓度下，乙酸浓度不会对胶原蛋白的产出率增加速度造成较大的影响。
实施例4.所分离的胶原蛋白的SDS-PAGE pattern
利用SDS电泳(SDS-PAGE)，研究根据所述制造例及比较例而获得的胶原蛋白的子单元(subunit)组成。SDS-PAGE是通过Lammli法(Lammli,V.K.等，1970)，利用7.5%的slab gel(平板凝胶)而执行。向在所述制造例及比较例中分离的胶原蛋白试料添加8M的尿素(urea)、2%的巯基乙醇(mercaptoethanol)、2%的SDS、及20mM的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)(pH值为8.0)并溶解，从而在100℃下加热2分钟。Fixing(一定)与staining(染色)是通过Neuhoff(Neuhoff V.等，1988)的方法，利用考马斯亮蓝(Coomassiebrillant blue)而实施。利用幅度为40%的超声波处理的制造例的结果示于图8，使乙酸浓度不同而处理的比较例2至4的结果示于图9。
根据图8，在0.01M的乙酸的存在下，利用幅度为40%的超声波进行处理时，在4小时后开始观察到相当于胶原蛋白的成分，随着超声波处理时间变长而切实地观察到α1、α2、β、及γ链(chain)。这种倾向是在凝胶的最上端也观察到推测为胶原蛋白的多聚体的成分。在以60%的幅度进行处理的情况下，整体倾向与以20%的幅度进行处理的情况相同。然而，随着超声波处理时间变长而开始观察到推测为胶原蛋白的分解产物的成分。特别是，在0.5M的乙酸下进行24小时的超声波处理时，发现如下情况：胶原蛋白的主要子单元即α1及β链减少，与此同时，生成凝胶的background(基底)被染色的不特定的多肽。
根据图9，对仅以酸性溶媒进行处理而分离的胶原蛋白的子单元组成进行研究，结果在0.01M的乙酸下，在反应6小时后开始发现相当于胶原蛋白的α1及β链，在24小时后，与该α1及β链一同发现α2及γ链。这种现象是随着乙酸浓度变高而更明显地显现，随着反应小时推移而α1、α2、β、及γ链也在量上增加。
结果，在酸性溶媒下进行超声波处理时，相当于胶原蛋白的α1、α2、β、及γ链更快速地增加，从而在酸性溶媒下进行超声波处理时，在短时间内引起胶原蛋白的分离。
另外，根据图13，可确认如下情况：重复执行超声波处理而提取的胶原蛋白也具有典型的胶原蛋白结构。
实施例6.胶原蛋白的确认
为了确认在制造例中，在酸性溶媒下并行超声波处理而分离的胶原蛋白是以胶原蛋白的形态分离、还是以明胶的形态分离，研究因胃蛋白酶(1:10,000.Yakuri purechem.,co..ltd.,Japan)产生的胶原蛋白的消化力。胶原蛋白的特性如下：其结构非常坚固，不会由消化酶发生分解，而由胶原酶(Collagenase)发生分解。然而，若胶原蛋白因热而明胶化，则由消化酶发生分解。因此，利用这种特性，可判断为若对根据超声波分离的胶原蛋白进行胃蛋白酶处理而引起消化，则为以明胶的形态分离，若不引起消化，则以胶原蛋白的形态分离。
将胶原蛋白浓度调节为1mg/ml后，在100℃下加热5分钟而明胶化。相对于胶原蛋白及明胶的浓度而添加0.5%的胃蛋白酶，从而在10℃下进行0～30分钟的处理后，向各试料添加8M的SDS、2%的巯基乙醇(mercaptoethanol)、20mM的Tris-HCl(pH值为8.0)而在100℃下加热2分钟，从而使酶活性停止。此后，根据SDS-PAGE(Lammli法)而分析消化图案。这时，胶原蛋白标准物质使用Acid soluble Collagen(酸溶性胶原蛋白)(TypeII，from white rabbit skin.,Sigma,USA.)。其结果如图11。在图11中，No.1为成为基准的TYPE I的胶原蛋白，No.2为在0.01M的乙酸下，以80%的amplitude(幅度)进行12小时的超声波处理而分离的胶原蛋白，No.3、4、5为将该胶原蛋白处理成胃蛋白酶的结果。No.6是以100℃热处理No.2的胶原蛋白而明胶化，No.7、8、9是分析将所述明胶处理成胃蛋白酶的结果。
在图11中，各No.的含义如下。
S：molecular weight marker
No.1：I type collagen(acid soluble)
No.2：Collagen of fish skin Isolated by sonication with acetic acid.
No.3、4、5：Collagen treated with pepsin for10,20and30mim.
No.6：Gelatin obtained from collagen(No.2)by heating at100℃.
No.7、8、9：Gelatin(No.6)treated with pepsin for10,20and30mim.
根据图11，在酸性溶媒下，通过超声波而分离的胶原蛋白(No.2)即使进行胃蛋白酶处理，也不会引起胶原蛋白的主要成分即α及βchain的变化(No.3、4及5)。然而，若对胶原蛋白进行热处理而使明胶化(No.6)后，进行胃蛋白酶处理，则发现如下情况：胶原蛋白的主要成分即α及βchain完全消失、低分子成分增加(No.7、8及9)。因此，根据以上结果，确认出如下情形：通过超声波而分离的成分为胶原蛋白，而并非明胶或胶原蛋白的水解产物。
以下，参照随附图式，详细地说明本发明的较佳的实施例的内容如下。然而，在本发明的说明中，为了明确本发明的主旨，省略对于公知的功能或构成的说明。
图14是本发明的一实施例的利用超声波的胶原蛋白分离装置的概略模式图，图15是图14的利用超声波的胶原蛋白分离装置的分离单元的概略模式图。
参照这些图，利用超声波的胶原蛋白分离装置(100，以下称为胶原蛋白分离装置100)包含：试料箱110，其收容鱼皮；分离单元130，其接收供给自试料箱110的鱼皮并分离成胶原蛋白，从而将所分离的胶原蛋白再次供给至试料箱110；超声波产生单元150，其连接在分离单元130，以便产生用以将鱼皮分离成胶原蛋白的超声波；冷却部170，其以阻隔分离胶原蛋白时产生的热的方式具备；试料供给管180a，其从试料箱110向分离单元130侧供给鱼皮；试料排出管180b，其将通过分离单元130所分离的胶原蛋白再次供给至试料箱110侧；循环泵191，其具备在试料供给管180a的延长路径上，以便可强制性地使鱼皮及胶原蛋白沿试料供给管180a及试料排出管180b循环；及循环量调节控制器192，其调节循环泵191的驱动程度。
试料箱110是收容供给至分离单元130侧而分离成胶原蛋白的鱼皮(试料)的构成，包含：储存部111，其储存鱼皮；及第2冷却水流入流出部113，其完全封闭储存部111的外部，由此提供可使供给自冷却部170的冷却水流入及流出的空间。
储存部111是提供用以储存用作试料的鱼皮的空间的中空圆筒状的构成。当然，本发明的权利要求不因储存部111形状而受限，根据本发明的其他实施例，储存部111也能够以四边形等来具备。
在储存部111，不仅储存有鱼皮，而且也一同储存有将鱼皮分离成胶原蛋白时所需的酸性溶液，这种酸性溶液为了将胶原蛋白从鱼皮分离而从以前一直使用，因此省略详细的说明。
储存部111的下侧是通过下文叙述的试料供给管180a连接在分离单元130的下侧(更明确而言，为处理部131的下侧)，从而可将鱼皮供给至分离单元130侧，所述储存部111的上侧是通过试料排出管180b连接在分离单元130的上侧(更明确而言，为处理部131的上侧)，从而可再次向储存部111侧排出所分离的胶原蛋白。
第2冷却水流入流出部113是提供如下空间的构成：用以使冷却水沿第2冷却水流入管175a从冷却本体171流入、或使冷却水沿第2冷却水流出管175b向冷却本体171侧流出。
为此，第2冷却水流入流出部113是以从储存部111的外周面隔开一定间隔而可完全封闭储存部111的外部的方式具备，正是通过这种具备在储存部111及第2冷却水流入流出部113之间的空间，使冷却水可流入流出。当然，与所述储存部111相同地，本发明的权利要求不因第2冷却水流入流出部113的形状而受限。
另一方面，分离单元130是如下构成：接收供给自试料箱110的鱼皮而将该鱼皮分离成胶原蛋白，从而将所分离的胶原蛋白再次供给至试料箱110侧。
分离单元130包含：处理部131，其将鱼皮分离成胶原蛋白；及第1冷却水流入流出部133，其通过完全封闭处理部131的外部，提供可使供给自冷却部170的冷却水流入及流出的空间。
处理部131是如下的中空圆筒状的构成：连接在下文叙述的超声波产生单元150，接收供给自试料箱110的鱼皮而将该鱼皮分离成胶原蛋白、或将所分离的胶原蛋白再次供给至试料箱110侧。当然，本发明的权利要求不因处理部131的形状而受限。
如上所述，处理部131的下侧及储存部111的下侧、与处理部131的上侧及储存部111的上侧分别通过试料供给管180a及试料排出管180b连接。
另一方面，第1冷却水流入流出部133是提供如下空间的构成：使冷却水沿第1冷却水流入管173a从冷却本体171流入、或使冷却水沿第1冷却水流出管173b向冷却本体171侧流出。
为此，第1冷却水流入流出部133是以从处理部131的外周面隔开一定间隔而可完全封闭处理部131的外部的方式具备，正是通过这种具备在处理部131及第1冷却水流入流出部133之间的空间，可使冷却水流入流出。当然，本发明的权利要求不因第1冷却水流入流出部133的形状而受限。
另一方面，超声波产生单元150是如下的构成：连接在分离单元130，以便产生用以将鱼皮分离成胶原蛋白的超声波。
超声波产生单元150包含：多个振动子151，其结合在处理部131的外周面；及振动调节控制器153，其调节振动子151的输出程度。
振动子151是如下构成：根据振动调节控制器153的控制，产生一定的振动，由此向处理部131的内部产生超声波。
多个振动子151在5～6㎝的范围内彼此隔离，以便彼此间不会受到超声波的影响(干扰)，沿处理部131的外周面附着。在本实施例中，通过振动子151产生的超声波的频率为20kHz左右，其原因在于，在该频率下，能够以最高效果将鱼皮分离成胶原蛋白。
然而，超声波的频率也可以根据处理部131的容量、储存在处理部131的鱼皮的储存量等来变更成其他数值。
振动调节控制器153是以如下方式具备的构成：可控制振动子151的输出程度、即通过振动子151产生的超声波的频率。
振动调节控制器153及振动子151连接至RF Wire(Radio Frequency Wire)，从而通过振动调节控制器153控制的信号提供至振动子151。
在本实施例中，振动调节控制器153的输出为0.1～1000W，但振动调节控制器153的输出也可以与所述振动子151的频率可变更的范围对应而不同。
另一方面，冷却部170是如下构成：向第1冷却水流入流出部133侧供给冷却水，以便可阻隔分离胶原蛋白时产生的热。另外，冷却部170也向第2冷却水流入流出部113侧供给冷却水，由此一并发挥有效地阻隔分离胶原蛋白时产生的热的作用。
冷却部170包含：冷却本体171，其使冷却水流入或流出；第1冷却水流入管173a及第1冷却水流出管173b，其等将冷却本体171与第1冷却水流入流出部133相互连接；第2冷却水流入管175a及第2冷却水流出管175b，其等将冷却本体171与第2冷却水流入流出部113相互连接。
冷却本体171是如下构成：储存供给至第1冷却水流入流出部133或第2冷却水流入流出部113的冷却水。
在冷却本体171的一侧，具备用以调节供给至第1冷却水流入流出部133或第2冷却水流入流出部113的冷却水的循环量的控制器171a，作业人员考虑分离胶原蛋白时产生的热来调节控制器171a，由此可决定冷却水的循环量。
第1冷却水流入管173a是如下构成：通过将冷却本体171的下侧及第1冷却水流入流出部133的下侧相互连接，可使冷却水从冷却本体171向第1冷却水流入流出部133侧供给；第1冷却水流出管173b是如下构成：通过将冷却本体171的上侧及第1冷却水流入流出部133的上侧相互连接，可使冷却水从第1冷却水流入流出部133向冷却本体171侧流出。
即，冷却水可通过第1冷却水流入管173a及第1冷却水流出管173b而持续在冷却本体171与第1冷却水流入流出部133之间循环，在通过冷却水的循环将鱼皮分离成胶原蛋白的情况下，可有效地阻隔在处理部131产生的热。
第2冷却水流入管175a是如下构成：通过将冷却本体171的下侧及第2冷却水流入流出部113的下侧相互连接，可使冷却水从冷却本体171向第2冷却水流入流出部113侧供给；第2冷却水流出管175b是如下构成：通过将冷却本体171的上侧及第2冷却水流入流出部113的上侧相互连接，可使冷却水从第2冷却水流入流出部113向冷却本体171侧流出。
即，冷却水可通过第2冷却水流入管175a及第2冷却水流出管175b而持续在冷却本体171与第2冷却水流入流出部113之间循环，在通过冷却水的循环将鱼皮分离成胶原蛋白的情况下，可有效地阻隔在处理部131产生的热。
另一方面，也向并非为处理部131的外部的试料箱110外部供给格外的冷却水的原因在于，在处理部131分离的胶原蛋白再次向试料箱110的储存部111侧供给。
即，收容在处理部131的鱼皮并非一次全部通过超声波而分离成胶原蛋白，因此如下所述，只有经过长时间对鱼皮施加超声波，才能获得一定量的胶原蛋白。
在这个期间，鱼皮一面持续地分离成胶原蛋白，一面在处理部131及储存部111之间循环，因此从处理部131向储存部111侧流入的鱼皮及胶原蛋白的混合状态物质成为具有某种程度的热的状态，因此需要立即阻隔这种热。由此，在本实施例中，通过分别在处理部131的外部及储存部111的外部具备第1冷却水流入流出部133及第2冷却水流入流出部113，可有效地阻隔鱼皮分离成胶原蛋白时产生的热。
另外，以将冷却本体171的下侧与第1冷却水流入流出部133的下侧连接的方式，配置第1冷却水流入管173a，且以将冷却本体171的下侧与第2冷却水流入流出部113的下侧连接的方式，配置第2冷却水流入管175a是为了有效地阻隔将鱼皮分离成胶原蛋白时产生的热。
即，储存在储存部111的鱼皮(当然，因使用本胶原蛋白分离装置100而也混有胶原蛋白)与供给在处理部131的鱼皮并非分别完全填满储存部111及处理部131，因此储存在冷却本体171的冰冷的冷却水从这种储存部111及处理部131的下侧供给而冷却储存部111及处理部131的热，从而向上侧流出，由此可提高冷却水的冷却效果。
另一方面，试料供给管180a是为了可从储存部111向处理部131侧供给鱼皮而具备的构成，试料排出管180b是为了可向储存部111侧排出通过处理部131分离的胶原蛋白而具备的构成。当然，如上所述，在这里，鱼皮及胶原蛋白是指因使用本胶原蛋白分离装置100而彼此按照一定量混合的状态的物质。
另外，在试料供给管180a的延长路径上，具备循环泵191，这种循环泵191是通过循环量调节控制器192而控制其驱动程度。
作业人员通过调节循环量调节控制器192来调节循环泵191的驱动程度，根据循环泵191的驱动程度，从储存部111向处理部131侧供给一定量的鱼皮，与此同时，储存在处理部131的胶原蛋白也向储存部111侧排出，从而鱼皮及胶原蛋白可持续地循环。
另外，使循环泵191具备在试料供给管180a侧而并非试料排出管180b侧是因为考虑到供给在处理部131的鱼皮并非分别完全填满储存部111及处理部131。
本实施例的胶原蛋白分离装置100并非像以前一样仅利用酸性溶液获得胶原蛋白，而是一同使用超声波而获得胶原蛋白，因此减少分离胶原蛋白时使用的酸(acid)的使用量，由此具有如下优点：不仅可以通过环保的方法分离胶原蛋白，而且还可以一并提高胶原蛋白的产出率。
与此同时，本实施例的胶原蛋白分离装置100是以将鱼皮分离成胶原蛋白时使用的情况为限而进行了说明，但还可以用于将明胶分离成胶原蛋白多肽。即，本发明的权利要求不仅包含将鱼皮分离成胶原蛋白的情况，而且还包含以明胶取代鱼皮，而获得胶原蛋白多肽来取代胶原蛋白的情况。
图16是表示使用图14的利用超声波的胶原蛋白分离装置，分离胶原蛋白的方法的顺序图，图17是表示使用图14的利用超声波的胶原蛋白分离装置来分离胶原蛋白时的胶原蛋白产出率的图表，图18是表示通过SDS-电泳法，对使用图14的利用超声波的胶原蛋白分离装置而分离的胶原蛋白进行分析的结果的图表。
参照这些图，为了使用本实施例的胶原蛋白分离装置100，将鱼皮分离成胶原蛋白，应经过如下过程：首先，将鱼皮及酸性溶液储存在试料箱(S1步骤)；使用连接在接收供给自试料箱的鱼皮及酸性溶液的分离单元与分离单元，且在一定时间内产生超声波的超声波产生单元，将鱼皮分离成胶原蛋白(S2步骤)；将所分离的胶原蛋白与未分离的鱼皮从分离单元再次传送至试料箱侧(S3步骤)；重复S2步骤及S3步骤直至达到一定的产出率(S4步骤)。
通过所述胶原蛋白分离方法，在一定的处理条件(酸性溶液：0.01M的乙酸；冷却水的温度：4℃；试料供给速度：0.5L/分；超声波的频率：20kHz)下，将鱼皮分离成胶原蛋白时的胶原蛋白产出率如图17所示。
即，在进行2小时的处理后，大致15%左右的鱼皮分离成胶原蛋白，在4小时后，大致33%左右的鱼皮分离成胶原蛋白，在12小时后，大致53%左右的鱼皮分离成胶原蛋白。另外，在15小时后，即使持续地对鱼皮施加超声波，也不会对胶原蛋白的产出率造成较大的影响。
另一方面，通过SDS-电泳法，对利用如上方法而分离的胶原蛋白进行分析，结果如图18一样维持典型的胶原蛋白结构，即使利用除胶原酶以外的酶来处理所分离的胶原蛋白，也不会引起分解，由此可确认所分离的成分为胶原蛋白。
以上，说明并图示了本发明的特定的实施例，但本发明并不限定于所记载的实施例，本技术领域的技术人员应了解，可以不脱离本发明的思想及范围而进行各种修正及变形。因此，这些修正例或变形例不可根据本发明的技术思想或观点来单独理解，所变形的实施例应从属于本发明的权利要求范围内。

Claims (18)

1. 一种提取胶原蛋白的方法，其特征在于，包含如下步骤：第1步骤，其是在0.01～0.5 M的乙酸溶液中，对鱼皮进行0.1至10小时的超声波处理而获取胶原蛋白提取物；及第2步骤，其是从所述胶原蛋白提取物，分离胶原蛋白与经超声波处理的鱼皮；且对所述经超声波处理的鱼皮重复执行第1步骤及第2步骤。
2.根据权利要求1所述的提取胶原蛋白的方法，其特征在于：所述超声波处理是在20 kHz的频率下实现。
3.根据权利要求1所述的提取胶原蛋白的方法，其特征在于：进行所述超声波处理时，超声波的振幅为75～85%。
4.根据权利要求1所述的提取胶原蛋白的方法，其特征在于：所述超声波处理是在0至10℃下执行。
5.根据权利要求1所述的提取胶原蛋白的方法，其特征在于：在执行8次第1步骤及第2步骤的情况下，超声波的振幅为20～40%。
6. 根据权利要求5所述的提取胶原蛋白的方法，其特征在于：超声波处理执行24小时。
7.一种胶原蛋白，其特征在于，通过根据权利要求1至6中任一项所述的方法而提取。
8.一种提取胶原蛋白的方法，其特征在于，包含如下步骤：第1步骤，其是在酸性溶液中，对鱼皮进行超声波处理而获取胶原蛋白提取物；第2步骤，其是从所述胶原蛋白提取物，分离胶原蛋白与经超声波处理的鱼皮；且对所述经超声波处理的鱼皮重复执行第1步骤及第2步骤。
9.一种利用超声波的胶原蛋白分离装置，其特征在于包含：
试料箱，其收容鱼皮；
分离单元，其接收供给自所述试料箱的所述鱼皮而分离成胶原蛋白，从而将所分离的所述胶原蛋白再次供给至所述试料箱；及
超声波产生单元，其连接在所述分离单元，以便产生用以将所述鱼皮分离成所述胶原蛋白的超声波。
10.根据权利要求9所述的利用超声波的胶原蛋白分离装置，其特征在于，更包含冷却部，其向所述分离单元侧供给冷却水，以便可以阻隔分离所述胶原蛋白时产生的热；
所述分离单元包含：
处理部，其接收供给自所述试料箱的鱼皮而将该鱼皮分离成胶原蛋白；及
第1冷却水流入流出部，其从所述处理部的外周面隔开一定间隔而封闭所述处理部的外部，由此提供使供给自所述冷却部的所述冷却水流入及流出的空间。
11.根据权利要求10所述的利用超声波的胶原蛋白分离装置，其特征在于，所述试料箱包含：
储存部，其储存所述鱼皮；及
第2冷却水流入流出部，其从所述储存部的外周面隔开一定间隔而封闭所述储存部的外部，由此提供使供给自所述冷却部的所述冷却水流入及流出的空间。
12. 根据权利要求10所述的利用超声波的胶原蛋白分离装置，其特征在于，所述超声波产生单元包含：
至少一个振动子，其结合在所述处理部的外周面而产生超声波；及
振动调节控制器，其调节所述振动子的输出程度。
13. 根据权利要求12所述的利用超声波的胶原蛋白分离装置，其特征在于：所述振动子是在5～6 ㎝的范围内彼此隔离，以便相互间不会受到超声波的影响的多个振动子。
14.根据权利要求12所述的利用超声波的胶原蛋白分离装置，其特征在于：通过所述振动子产生的超声波的频率为20 kHz。
15. 根据权利要求12所述的利用超声波的胶原蛋白分离装置，其特征在于：所述振动调节控制器的输出为0.1～1000 W。
16. 根据权利要求11所述的利用超声波的胶原蛋白分离装置，其特征在于，所述冷却部包含：
冷却本体；
第1冷却水流入管，其从所述冷却本体的下侧向所述第1冷却水流入流出部的下侧延长，以便冷却水从所述冷却本体向所述第1冷却水流入流出部侧流入；
第1冷却水流出管，其从所述第1冷却水流入流出部的上侧向所述冷却本体的上侧延长，以便冷却水从所述第1冷却水流入流出部向所述冷却本体侧流出；
第2冷却水流入管，其从所述冷却本体的下侧向所述第2冷却水流入流出部的下侧延长，以便冷却水从所述冷却本体向所述第2冷却水流入流出部侧流入；及
第2冷却水流出管，其从所述第2冷却水流入流出部的上侧向所述冷却本体的上侧延长，以便冷却水从所述第2冷却水流入流出部向所述冷却本体侧流出。
17. 根据权利要求16所述的利用超声波的胶原蛋白分离装置，其特征在于更包含：
试料供给管，其将所述储存部的下侧与所述处理部的下侧相互连接，以便可从所述储存部向所述处理部侧供给鱼皮；及
试料排出管，其将所述处理部的上侧与所述储存部的上侧相互连接，以便可向所述试料箱侧排出通过所述分离单元分离的胶原蛋白。
18. 根据权利要求17所述的利用超声波的胶原蛋白分离装置，其特征在于更包含：
循环泵，其具备在所述试料供给管的延长路径上，以便可强制性地使所述鱼皮及所述胶原蛋白沿所述试料供给管及所述试料排出管循环；及
循环量调节控制器，其调节所述循环泵的驱动程度，以便可调节所述鱼皮及所述胶原蛋白的循环量。
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