CN104215592A - 一种凤梨柱头可授性的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种凤梨柱头可授性的检测方法，属于植物的杂交育种技术领域。方法包括：(1)反应液的配制；(2)凤梨柱头的准备；(3)柱头吸光值A1与A2的测定；(4)柱头可授性A值的计算等步骤工艺。本发明与传统的联苯胺-过氧化氢法相比，通过表面活性剂加入前后吸光值的变化，可以量化判断出柱头酶活性强弱和柱头分泌物的多少，可更准确地判断出柱头可授性的强弱，较已有技术的目测判断，更客观而准确。

Description

一种凤梨柱头可授性的检测方法

技术领域

本发明涉及植物的杂交育种技术领域，具体涉及一种检测凤梨柱头可授性的方法。

背景技术

植物柱头的可授性检测是植物杂交育种中的一个重要环节，柱头可授性的高低大大影响自交和杂交的成功率。一般在杂交育种前，都需要对植物柱头是否可授、可授持续的时间及可授区域进行检测，以进行母本的选择及授粉时机和授粉区域的判断。

本发明利用植物柱头表面有多种酶及特异蛋白存在,并且这些酶和蛋白的活性及浓度会随着柱头接受花粉能力的变化而改变。这些酶活性的变化可以通过多种方法进行检测,从而反映出植物柱头可授性的改变。目前几种植物柱头可授性的检测方法都是基于对酶活性的检测，其中最常用的方法是联苯胺-过氧化氢法，原理是通过反应液与柱头上的酶接触后，能在溶液中呈现出蓝色并伴有气泡，依据此蓝色的深浅与气泡的多少可作出该柱头可授性强或弱的判断，一般以+、-表示。但该法在实际使用中也出现了如下的问题：1、开花初期可授性低时其溶液变色不明显；2、开花后期其可授性由强变弱时虽气泡已减少，但其溶液呈深蓝色，而少量气泡在深蓝色液中较难观察到；3、由于上述现象的存在容易导致主观性的产生，从而对目测判断结果带来偏差进而影响其准确性。

此外，在新鲜凤梨柱头的表面还包裹着一层含有蛋白质、脂类、多糖和酚类物质的分泌物，此类物质一方面对水溶性药剂表现出不亲和，从而在柱头表面形成一保护层，阻碍了柱头上的酶与反应液的接触而影响检测的结果；另一方面随着柱头逐步老化，上述的分泌物也会逐渐减少直至消失，但与此同时柱头的可授性也逐步自然降低直至消失。因此，使用传统的联苯胺-过氧化氢法测定凤梨柱头的可授性，容易出现对可授性的误判：即在柱头可授性旺盛的时候由于分泌物的隔离导致柱头上的酶与反应液没有充分接触而作出可授性弱的误判；而在柱头老化可授性降低的时期，由于分泌物的减少，导致柱头与反应液的充分接触，反应液颜色变浓而作出可授性增强的误判。设法消除上述的误判也是本发明必须设法解决的任务。

发明内容

本发明目的是，针对已有方法中存在依赖目测容易产生误差和柱头分泌物会在柱头形成保护层，阻止柱头的酶与反应液接触从而影响检测结果的缺陷，提出一种客观、量化的凤梨柱头可授性的检测方法。

本发明目的通过以下技术方案得以实现：

一种凤梨柱头可授性的检测方法，该方法按如下步骤进行：

(1)反应液的配制：将德国产Peroxtesmo KO过氧化物酶试纸和蒸馏水按1片:1ml比例浸渍形成反应液或将1％联苯胺和3％过氧化氢及水按体积4∶11∶22比例配制成联苯胺-过氧化氢反应液；按柱头体积大小将100-200ul的反应液转移到离心管中，备用；

(2)凤梨柱头的准备：将不同开花期的凤梨柱头，在距柱头20-30mm处割断，备用；

(3)柱头吸光值A1与A2的测定：将割断后的凤梨柱头按柱头朝下，倒置插入离心管中，至柱头浸入反应液中而花柱基部切口露于液面上，柱头在反应液中浸渍30s后，柱头的浸液部分和反应液显示出蓝色；对反应液采用紫外分光光度计658nm波长进行检测得吸光值A1；在反应液中加入0.02％-0.05％的表面活性剂后，再次将柱头浸入该混合液中30S后，用同样设备、方法测得吸光值A2；

(4)柱头可授性A值的计算：按公式A＝(A2-A1)×2计算，得出柱头可授性0至5的A值，其中，当柱头可授性很强时，A值趋近或等于5；当柱头可授性很弱或几乎没有时，A值趋近或等于0。

所述的表面活性剂为0.02％-0.05％的十二烷基苯磺酸钠、Tween80或Tween20。

本发明的有益效果是：

1、凤梨柱头表面的分泌物会形成保护层而影响反应液对柱头可授性的检测，本发明在反应液中再加入表面活性剂后，可以解决联苯胺-过氧化氢法中由此引发的误判问题。

2、利用柱头表面酶活性可随着柱头可授性的增强而增强，而柱头外包裹的分泌物会随着柱头可授性的减弱而减少的特性，通过表面活性剂加入前后吸光值的变化，可以判断柱头上酶活性强弱和柱头分泌物的多少，从而准确判断柱头可授性的强弱，较已有技术中用目测溶液颜色和气泡多少作判断，可更客观而准确。

3、柱头可授性通过吸光值的测量和计算公式来确定，表现为具体的数值，可通过图表进行横向比较和时间变化比较。

附图说明

图1凤梨柱头与反应液接触的设备、方式示意图

其中，1-离心管、2-反应液、3-花柱切口、4-花柱、5-柱头

具体实施方式

通过以下实施例并结合附图对本发明作进一步的详细描述，但本发明的内容并不局限于此。

对实施例所涉试剂和仪器的说明：

过氧化物酶试纸Peroxtesmo KO：德国MACHEREY-NAGEL公司生产；

联苯胺(CAS:92-87-5)：上海紫一试剂厂生产；

过氧化氢(CAS:7722-84-1)：又名双氧水，上海紫一试剂厂生产；

十二烷基苯磺酸钠(CAS:25155-30-0)：德国百灵威公司生产；

Tween80(CAS:9005-65-6)、Tween20(CAS:9005-64-5)：美国Sigma公司生产；

离心管：普通500ul；

紫外/可见光分光光度计：型号为GeneQuant100；

立体显微镜：型号为Leica M205C。

实施例1：(过氧化物酶试纸反应液对花后6h凤梨柱头可授性的测定)

按以下步骤进行：

(1)反应液的配制：将德国产Peroxtesmo KO过氧化物酶试纸和蒸馏水按1片:1ml比例浸渍形成反应液；按100ul/每支将反应液转移到500ul的离心管中，备用；

(2)凤梨柱头的准备：将开花后6h的新鲜凤梨花柱，在距柱头20-30mm处割断，备用；

(3)柱头吸光值A1与A2的测定：将割断后的凤梨花柱按柱头朝下，倒置插入离心管中，至柱头浸入反应液中而花柱基部切口露于液面上，柱头在反应液中浸渍30s后，柱头的浸液部分和反应液均显示出蓝色；对反应液采用紫外分光光度计658nm波长进行检测得吸光值A1为0.165；在反应液中加入0.05％十二烷基苯磺酸钠后，再次将柱头浸入该混合液中30S后，用同样设备、方法测得吸光值A2为2.083；

(4)柱头可授性A值的计算：按公式A＝(A2-A1)×2计算，得出柱头可授性A值为3.836。

实施例2：(联苯胺-过氧化氢反应液对莺歌属12个品种柱头可授性的测定)

按以下步骤进行：

(1)反应液的配制：将1％联苯胺和3％过氧化氢及水按体积4∶11∶22比例配制成联苯胺-过氧化氢反应液；按150ul/每支将反应液转移到12支500ul的离心管中，备用；

(2)凤梨柱头的准备：从莺歌属凤梨中选取12个品种，每个品种3朵在当天上午7点开花的花朵，于下午3点(即开花后8h)在距柱头20-30mm处割断花柱，备用；

(3)柱头吸光值A1与A2的测定：将12根割断后的凤梨花柱按柱头朝下，倒置插入12支离心管中，至柱头浸入反应液中而花柱基部切口露于液面上，柱头在反应液中浸渍30s后，柱头的浸液部分和反应液均显示出蓝色；对反应液采用紫外分光光度计658nm波长进行检测得吸光值A1；在反应液中加入0.02％Tween80后，再次将柱头浸入该混合液中30S后，用同样设备、方法测得吸光值A2；

(4)柱头可授性A值的计算：按公式A＝(A2-A1)×2计算，得出12根柱头可授性A值分别为3.097、2.839、2.607、2.424、3.501、1.803、1.229、0.303、1.740、1.933、1.106、1.398(见表1)；从表1可看出同为莺歌属的12个凤梨品种，它们间的柱头可授性也有较大的差别；

表1 莺歌属凤梨不同品种的柱头可授性

实施例3：(过氧化物酶试纸反应液对不同花期凤梨柱头可授性的测定)

按以下步骤进行：

(1)反应液的配制：将德国产Peroxtesmo KO过氧化物酶试纸和蒸馏水按1片:1ml比例浸渍形成反应液；按200ul/每支将反应液转移到500ul的离心管中，备用；

(2)凤梨柱头的准备：将开花前1h与开花后48h的凤梨花柱，在距柱头20-30mm处各切割一根，备用；

(3)柱头吸光值A1与A2的测定：将割断后的凤梨花柱分别按柱头朝下，倒置插入离心管中，至柱头浸入反应液中而花柱基部切口露于液面上，柱头在反应液中浸渍30s后，柱头的浸液部分和反应液均显示出蓝色；对反应液采用紫外分光光度计658nm波长分别进行检测得吸光值A1；在反应液中加入0.04％Tween20后，再次将柱头浸入该混合液中30S后，用同样设备、方法测得吸光值A2；

(4)柱头可授性A值的计算：按公式A＝(A2-A1)×2计算，分别得出开花前1h与开花后48h柱头的可授性A值均为0；

试验例1：(不同反应液对相同凤梨品种不同花期柱头可授性规律的测定)

一、试验材料：选取莺歌凤梨属金宝剑Vriesea.‘Charlotte’不同开花时间的24个柱头，进行柱头可授性的测定；

二、试验方法：按如下步骤进行，

(1)反应液的配制：将“德国产Peroxtesmo KO过氧化物酶试纸和蒸馏水按1片:1ml比例浸渍形成的反应液”和“1％联苯胺和3％过氧化氢及水按体积4∶11∶22比例配制成的联苯胺-过氧化氢反应液”，将上述两种反应液均按200ul/每支的要求，分别转移到各24支500ul的离心管(共48支)中，备用；另按联苯胺-过氧化氢反应液1ml/份，共8份作对照，备用；

(2)凤梨柱头的准备：将上述的试验材料，分别按开花前1h、开花时、开花后2h、开花后4h、开花后6h、开花后8h、开花后24h、开花后48h，共8个时期，每期3个柱头(共48个)，在距柱头20-30mm处割断；另按同法准备8个柱头作对照，备用；

(3)应用传统联苯胺-过氧化氢法目测柱头的可授性：将上述的联苯胺-过氧化氢反应液滴到准备好的8个不同时期的柱头上，并根据溶液颜色的深浅和气泡的多少，目测判断出柱头可授性的强弱，其中，以溶液颜色蓝色并且气泡多为可授性强，以“+++”表示，以溶液颜色透明或气泡没有为可授性弱，以“-”表示；分别得出8根柱头的8个可授性，分别为：-、-、+、+、++、+++、-、-；

(4)柱头吸光值A1与A2的测定：将割断后的凤梨花柱按柱头朝下，倒置插入离心管中，至柱头浸入反应液中而花柱基部切口保持露于液面上，柱头在反应液中浸渍30s后，柱头的浸液部分和反应液均显示出蓝色；对反应液采用紫外分光光度计658nm波长进行检测得吸光值A1；在反应液中加入0.05％十二烷基苯磺酸钠后，再次将柱头浸入该混合液中30S后，用同样设备、方法测得吸光值A2；

(5)柱头可授性A值的计算：按公式A＝(A2-A1)×2计算，分别得出：过氧化物酶试纸+蒸馏水反应液3柱头的平均A值，分别为0、0.952、2.204、2.47、3.836、3.792、1.064、0(见表1)；联苯胺-过氧化氢反应液的A值为0、0.457、1.224、1.238、3.318、3.349、0.496、0(见表2)；其中，5为柱头可授性的最高值，0为无可授性；

试验结果：从上述两种不同反应液的A值结果和对照的目测结果来看，凤梨柱头在不同的开花期，其柱头的可授性是有较大区别的，即在开花后6～8小时内柱头的可授性最高，而开花前和开花48h后其可授性均为0。上述三种方法测定所得的可授性结果还是比较一致的。

表2 凤梨不同花期柱头可授性的变化

Claims (2)

1.一种凤梨柱头可授性的检测方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)反应液的配制：将德国产Peroxtesmo KO过氧化物酶试纸和蒸馏水按1片:1ml比例浸渍形成反应液或将1％联苯胺和3％过氧化氢及水按体积4∶11∶22比例配制成联苯胺-过氧化氢反应液；按柱头体积大小将100-200ul的反应液转移到离心管中，备用；

(2)凤梨柱头的准备：将不同开花期的凤梨柱头，在距柱头20-30mm处割断，备用；

(3)柱头吸光值A1与A2的测定：将割断后的凤梨柱头按柱头朝下，倒置插入离心管中，至柱头浸入反应液中而花柱基部切口露于液面上，柱头在反应液中浸渍30s后，柱头的浸液部分和反应液显示出蓝色；对反应液采用紫外分光光度计658nm波长进行检测得吸光值A1；在反应液中加入0.02％-0.05％的表面活性剂后，再次将柱头浸入该混合液中30S后，用同样设备、方法测得吸光值A2；

(4)柱头可授性A值的计算：按公式A＝(A2-A1)×2计算，得出柱头可授性0至5的A值，其中，当柱头可授性很强时，A值趋近或等于5；当柱头可授性很弱或几乎没有时，A值趋近或等于0。

2.按权利要求1所述的表面活性剂，其特征在于为0.02％-0.05％的十二烷基苯磺酸钠、Tween80或Tween20。