CN113484319A - 一种快速测定水稻柱头活力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速测定水稻柱头活力的方法，该方法包括以下步骤：(1)取待测水稻植株开花后授粉的颖花，从颖花中取出柱头，去除花柱后，置于盛有体积分数1％～10％的过氧化氢水溶液的载玻片上，盖上盖玻片；(2)将载玻片置于光学显微镜4×视野下，开始计时，统计过氧化氢水溶液中的气泡扩大到充满整个光学显微镜4×视野屏幕的时间，获得的时长即是水稻柱头活力指数。本发明方法基于过氧化氢酶活性来检测水稻柱头活力，获得的柱头活力指数与传统结实率法获得的结实率呈极显著正相关，表明本发明方法能够有效反映水稻柱头活力，有望在高柱头活力不育系的培育和研发提高柱头活力的生产技术体系中发挥重要作用。

Description

一种快速测定水稻柱头活力的方法

技术领域

本发明涉及水稻生理技术领域，尤其涉及一种快速测定水稻柱头活力的方法。

背景技术

柱头活力是指开花后柱头接受花粉并能进行正常受精作用的能力。在水稻的生产中，柱头活力决定了颖壳关闭后接受花粉的时间长短和授粉效率，可以与柱头外露率共同影响制种产量的高低。

柱头活力与结实率有着直接关系，田大成等(田大成，黄三奎，段永国等.水稻不育系花时和受粉时间与异交结实率的关系[J].杂交水稻，2004，3：53-57)研究发现，开花后的柱头外露颖花仍能结合花粉，其结实数约占总结实数的二分之一。

在现有研究中，研究者通常采用统计结实率的大小来评估水稻柱头活力(包灵丰，林纲，曾健等.颖花不同剪除方法影响籼稻不育系柱头活力持续时间的研究[J].南京农业大学学报，2007，2：140-142.舒志芬，陈勇，刘钊等.5个水稻光温敏核不育系柱头特性与异交结实率的关系[J].作物研究，2015，29：343-347.)。这一方式具有滞后性且准确度较低，严格来说结实率是柱头与花粉的活力综合作用的结果，以此衡量柱头活力存在一定误差。但是，由于影响柱头活力的因素过多，光照、温度、湿度、二氧化碳含量等都会造成柱头活力的细微变化，而水稻柱头的尺寸小、保存难度大，这给柱头活力的系统性研究带来了诸多困难。

因此，有必要提供一种更加快速、准确的柱头活力判断方法。

发明内容

本发明提供了一种快速测定水稻柱头活力的方法，该方法基于过氧化氢酶活性来检测水稻柱头活力，获得的柱头活力指数与传统结实率法获得的结实率呈极显著正相关，表明本发明方法能够有效反映水稻柱头活力，有望在高柱头活力不育系的培育和研发提高柱头活力的生产技术体系中发挥重要作用。

具体技术方案如下：

一种快速测定水稻柱头活力的方法，包括以下步骤：

(1)取待测水稻植株开花后授粉的颖花，从颖花中取出柱头，去除花柱后，置于盛有体积分数1％～5％的过氧化氢水溶液的载玻片上，盖上盖玻片；

(2)将载玻片置于光学显微镜4×视野下，开始计时，统计过氧化氢水溶液中的气泡扩大到充满整个光学显微镜4×视野屏幕的时间，获得的时长即是水稻柱头活力指数。

进一步地，步骤(1)中，取颖花的时间为水稻植株开花的当天和开花后的1～5天中的至少一天。

本发明中开花后1天是指开花当天的下一天，开花后5天是指从开花当天的下一天算起的第5天。

进一步地，步骤(1)中，每个待测水稻植株所取的颖花数量至少为3朵，最终获得的水稻柱头活力指数为该待测水稻植株所有颖花所对应的水稻柱头活力指数的均值。作为优选，每个待测水稻植株所取的颖花数量为5朵。

作为优选，步骤(1)中，所述过氧化氢水溶液的体积分数为3％。浓度过低的过氧化氢溶液产生气泡速率较慢，浓度过高的过氧化氢溶液中气泡产生速率没有明显提升，但柱头会迅速被氧化，可能会影响实验结果。

作为优选，步骤(1)中，所述载玻片为单凹载玻片，将过氧化氢水溶液加入至单凹载玻片的凹槽内，避免过氧化氢水溶液过度摇晃，同时在凹槽充满溶液时进行实验，操作中不易产生气泡，从而避免操作失误对实验结果准确性的影响。

为了便于建立本发明方法与结实率法之间的相关性，所述水稻柱头活力指数

＝10000/所述时长。所述时长是指柱头在3％过氧化氢溶液中产生充满整个光学显微镜4×视野屏幕的气泡所需的秒数。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明方法基于过氧化氢酶活性来检测水稻柱头活力，获得的柱头活力指数与传统结实率法获得的结实率呈极显著正相关，表明本发明方法能够有效反映水稻柱头活力，有望在高柱头活力不育系的培育和研发提高柱头活力的生产技术体系中发挥重要作用。

附图说明

图1为水稻柱头在过氧化氢溶液中形成气泡的图片；

其中，a为TS849白色柱头浸入过氧化氢溶液30s时产生气泡的情况，b为TS849同一白色柱头浸入过氧化氢溶液200s时产生气泡的情况；c为TS248紫色柱头浸入过氧化氢溶液30s时产生气泡的情况，d为TS248同一紫色柱头浸入过氧化氢溶液200s时产生气泡的情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

下列实施例用到的材料为通过花药培养培育的稳定两系不育系粳稻，包括TS846、TS849、TS948、TS992、TS9211、TS256、TS248、DH9070。其中，TS256和TS248是紫色柱头材料，其他为白色柱头材料用于研究柱头颜色对柱头活力的影响。DR901为籼稻恢复系，本实施例试验中作为人工授粉的优质花粉源。上述材料在江苏无锡基地进行分期种植，时间分别为2020年5月20日、2020年6月5日、2020年6月20日(据品种生育期差异进行微调，保证开花期一致)，每份材料每季种植20个小区，每个小区单本植50株；DR901在2020年5月～6月每隔5天种植一期，每期种植100个单株，确保在各材料开花期有足够花粉用于授粉。

实施例1结实率法测定柱头活力

具体步骤如下：

1.不育系选穗：在授粉前1天进行不育系选穗，选择具有多穗且只开过几朵花的生长状况旺盛而一致的单株，编号挂牌进行标记。

2.不育系整穗：剪去已开颖花及未抽出的穗子，剪去生长适宜的颖花上二分之一颖壳，用牛皮纸袋封好穗子防止外来花粉干扰。

3.授粉：授粉前半小时，在父本田中选取即将开花的主穗，完整取下后短暂浸入水中，再以中等力度均匀击，夹入干燥温暖的报纸中保存，开花后打开牛皮纸袋，将父本穗置于母本上方轻轻摇动，然后上下摇动碰触数次完成授粉，封好育种袋。

4.结实率考察：从开花当天到开花后第五天，连续6天，每天从剩下的主穗中依次选取5个主穗，重复1～4的操作，使得每份母本材料都有开花后连续6天当天授粉的5个主穗。授粉15天后，调查处理对象结实率(结实粒数/总粒数)，以5个主穗的结实率平均值作为柱头活力。

通过人工授粉得到TS948、TS992、TS9211、DH9070、TS256、TS248在开花当天、开花后第一天、开花后第二天、开花后第三天、开花后第四天、开花后第五天授粉时，材料的结实率，这是一直以来水稻研究者测定柱头活力的方法，即柱头活力等于结实率，得到的结果如表1。

表1结实率法测定开花后水稻柱头活力的结果

对以上材料开花当天及以后5天人工授粉后结实的结实率进行统计，以此作为材料的柱头活力，得到以下结果：

1)材料的结实率都在开花当天达到最大值，之后逐天下降：TS948的最大结实率为71.14％，TS992的最大结实率为78.03％，TS9211的最大结实率为54.28％，DH9070的最大结实率为50.02％，TS256的最大结实率为65.64％，TS248的最大结实率为64.23％。

2)随开花后天数的增加，不同材料的结实率呈现不同下降趋势：异交性好的TS948和TS992在开花后1天内结实率下降速度相对较慢，在开花后2～5天下降速度明显加快；异交性差的TS9211和DH9070在开花后前两天的结实率大幅度下降，后4天的下降速度放缓；紫色柱头的TS256和TS248结实率在开花后1～3天下降速度最快，其他时间下降缓慢。

实施例2过氧化氢法测定柱头活力

具体步骤如下：

1.不育系选穗：在授粉前1天进行不育系选穗，选择具有多穗且只开过几朵花的生长状况旺盛而一致的单株，编号挂牌进行标记。

2.配制体积分数3％的过氧化氢溶液，在4℃冰箱中保存。

3.不育系选花：在每份材料选定的主穗中选出50个生长进程一致、当天开花的柱头外露颖花，用红色记号笔在颖壳上进行标记。

3.授粉：授粉前半小时，在父本田中选取即将开花的主穗，完整取下后短暂浸入水中，再以中等力度均匀击，夹入干燥温暖的报纸中保存，开花后打开牛皮纸袋，将父本穗置于母本上方轻轻摇动，然后上下摇动碰触数次完成授粉，封好育种袋。

4.活力测定：取下当天开花后授粉的颖花，用镊子取出柱头(去除花柱)，放入单凹载玻片的凹槽内，滴入3％过氧化氢溶液直至填满凹槽(约10μL)，盖上盖玻片(避免产生气泡，否则影响实验结果)，放在光学显微镜4×视野下，开始计时，拍照记录。由于柱头中过氧化氢酶催化过氧化氢分解为氧气和水，溶液中会不断产生气泡，最初是柱头绒毛周围产生微小气泡，随着时间的推移，小气泡会汇集成大气泡，逐渐充满整个显微镜的4×视野，在气泡扩大到充满整个4×视野时停止计时，记录所用时间。重复5次取平均值以确保实验数据准确。

5.开花当天到开花后第五天，连续6天，每天同一时间每份材料取5朵颖花进行上述实验，统计过氧化氢酶法下产生同样大小气泡所需时间。为便于比较，以10000除以柱头在3％过氧化氢溶液中产生相同大小气泡所需的秒数，得到柱头活力指数。

为将过氧化氢法与结实率法测得的柱头活力进行比较，以10000除以过氧化氢法测得的柱头在3％过氧化氢溶液中产生相同大小气泡所需的秒数(图1)，得到柱头活力指数(Stigma vitality index)，相同材料在相同时间内的柱头活力指数变化如表2。

表2过氧化氢法测定开花后水稻柱头活力的结果

对以上材料开花当天及以后5天人工授粉后过氧化氢法测得的柱头活力进行分析，得到以下结果：

1.材料的柱头活力指数都在开花当天达到最大值，之后逐天下降：TS948的最大柱头活力指数为33.09，TS992的最大柱头活力指数为34.23，TS9211的最大柱头活力指数为31.00，DH9070的最大柱头活力指数为29.56，TS256的最大柱头活力指数为28.89，TS248的最大柱头活力指数为28.92。

2.柱头活力下降速度不同的材料在开花当天的柱头活力指数很接近：开花当天不同材料的柱头活力变幅仅为28.89～33.09。

实施例3两种方法的相关性分析

为验证两种方法所得数据的相关性，对两组数据进行了CORREL函数相关性分析，结果如表3所示。

表3结实率与柱头活力指数的相关性分析

注：**：0.01显著水平；*：0.05显著水平。

如表3所示，按材料分类：在6种材料中，两组方法测得数据的相关性都大于0.97，极显著正相关；不区分材料，按方法分类：对所有数据进行相关性分析得到的总相关系数为0.918641，极显著正相关。综上可知，过氧化氢法测定柱头活力的结果与传统的结实率法紧密相关，结果可信度高，二者在描述柱头活力上是一致的。

过氧化氢法测定柱头活力，其耗时短、准确性高，可在水稻花期就得知柱头活力，大大提高了柱头活力测定的效率，对于解决水稻花期相遇、适时授粉等工作的开展有直接的促进作用。通过水稻柱头在过氧化氢溶液中最终产生气泡的大小来进行柱头活力测量，虽然花费时间延长，但可以摆脱显微镜的限制。

实施例4过氧化氢水溶液浓度的筛选

本实施例对过氧化氢水溶液的体积浓度进行试验，分别设置：0.5％，1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％的浓度梯度，其他步骤与实施例2相同。

试验结果：当过氧化氢水溶液的浓度低于3％时，气泡的产生速度较为缓慢，不利于大规模测定时统计时间；浓度高于3％时，气泡的产生速度只略微加快，没有明显变化，但是柱头的氧化速度加快，柱头颜色迅速变深，可能对过氧化氢酶活性产生影响，所述优选3％。

对比例1

我们对其他酶类也做了尝试，以联苯胺酶为例，具体步骤为：

1.不育系选穗：在授粉前1天进行不育系选穗，选择具有多穗且只开过几朵花的生长状况旺盛而一致的单株，编号挂牌进行标记。

2.配制体积分数为3％的联苯胺溶液，以无水乙醇作为溶剂，在4℃冰箱中保存。

3.不育系选花：在每份材料选定的主穗中选出50个生长进程一致、当天开花的柱头外露颖花，用红色记号笔在颖壳上进行标记。

3.授粉：授粉前半小时，在父本田中选取即将开花的主穗，完整取下后短暂浸入水中，再以中等力度均匀击，夹入干燥温暖的报纸中保存，开花后打开牛皮纸袋，将父本穗置于母本上方轻轻摇动，然后上下摇动碰触数次完成授粉，封好育种袋。

4.活力测定：取下当天开花后授粉的颖花，用镊子取出柱头(去除花柱)，放入单凹载玻片的凹槽内，滴入3％联苯胺溶液直至填满凹槽(约10μL)，盖上盖玻片(避免产生气泡，否则影响实验结果)，放在光学显微镜4×视野下，开始计时，拍照记录。如果柱头中含有联苯胺酶，联苯胺溶液将会逐渐产生蓝色物质，颜色越深、产生速度越快，则说明联苯胺酶活性越高。但进行了0.5％～5％浓度梯度的联苯胺酶溶液实验，都未观察到蓝色物质的出现，说明水稻柱头中不含有联苯胺酶或者联苯胺酶活性过低无法引起变色反应，因此此方法不成立。

Claims (6)

1.一种快速测定水稻柱头活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取待测水稻植株开花后授粉的颖花，从颖花中取出柱头，去除花柱后，置于盛有体积分数1％～5％的过氧化氢水溶液的载玻片上，盖上盖玻片；

(2)将载玻片置于光学显微镜4×视野下，开始计时，统计过氧化氢水溶液中的气泡扩大到充满整个光学显微镜4×视野屏幕的时间，获得的时长即是水稻柱头活力指数。

2.如权利要求1所述的快速测定水稻柱头活力的方法，其特征在于，步骤(1)中，取颖花的时间为水稻植株开花的当天和开花后的1～5天中的至少一天。

3.如权利要求1所述的快速测定水稻柱头活力的方法，其特征在于，步骤(1)中，每个待测水稻植株所取的颖花数量至少为3朵，最终获得的水稻柱头活力指数为该待测水稻植株所有颖花所对应的水稻柱头活力指数的均值。

4.如权利要求1所述的快速测定水稻柱头活力的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述过氧化氢水溶液的体积分数为3％。

5.如权利要求1所述的快速测定水稻柱头活力的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述载玻片为单凹载玻片，将过氧化氢水溶液加入至单凹载玻片的凹槽内。

6.如权利要求1所述的快速测定水稻柱头活力的方法，其特征在于，所述水稻柱头活力指数＝10000/所述时长。

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