CN104208105B - 蚕虫草在抗呼吸道合胞病毒的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药领域，公开了蚕虫草在制备抗呼吸道合胞病毒药物中的应用。经体内外实验证明，蚕虫草对呼吸道合胞病毒RSV有显著的抑制作用，本发明为蚕虫草临床用于治疗呼吸道合胞病毒RSV感染性疾病提供实验依据，对研制抗呼吸道合胞病毒RSV的药物提供一定的指导意义，具有重要的参考价值。
Description
技术领域
本发明属于中药领域，涉及蚕虫草在制备抗呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytial Virus，RSV)的药物中的应用。
背景技术
当前呼吸道感染的治疗分别施用用于治疗、预防或改善病毒性、细菌性和真菌性呼吸道感染的抗病毒剂、抗细菌剂和抗真菌剂。呼吸道合胞病毒(Respiratory SyncytialVirus，RSV)主要引起呼吸系统感染，在婴幼儿、老年以及免疫缺陷人群引起严重肺炎，是人类上呼吸道感染的重要病原之一。但在抗病毒治疗中，由于病毒的细胞寄生性及细胞内繁殖等特点，其治疗具有一定难度。三氮唑核苷(Ribavirin，又名病毒唑)是目前治疗RSV感染唯一有效的化学药物，动物实验结果发现，若以气雾形式给予适当的剂量，可使肺和鼻中的RSV滴度减少，药物能直接到达细小支气管，而其他方式给药则很难获得治疗浓度。中药由于其直接及间接的抗病毒作用特点，使其在治疗病毒类疾病具有独特优势，其能在抗病毒同时兼有解热、抗炎等作用，还能增强机体免疫功能，阻止病毒进入细胞组织，同时很少伤害正常组织细胞，毒副作用较小，故其临床使用前景广阔。
北冬虫夏草[Cordyc epsmilitaris(Fr.)Link]又名蛹虫草，属于子囊菌纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属真菌，是虫草属的模式种。以家蚕幼虫为寄主栽培北虫草，也简称为蚕虫草，其虫草形态更接近天然虫草。《新华本草纲目》称其“味甘，性平”，具有“益肺肾、补精髓、止血化痰”的功效。现代研究表明北虫草有增强人体免疫力及抗肿瘤的作用，在治疗肺虚咳嗽、支气管炎、哮喘方面以及抗菌、抗血栓、抗氧化等方面也具有显著作用。但关于蚕虫草在呼吸系统的作用未见报道，其对于呼吸道合胞病毒(RSV)抑制活性也没有任何启示的可能。
为了寻求新的治疗药物，需要开发能够从根本上治疗病因并有效地改善疾病症状的天然药物。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供蚕虫草在制药中的新用途：
蚕虫草在制备抗RSV药物中的应用。
经实验证明，蚕虫草对RSV有显著的抑制作用：抑制RSV在HEK293细胞出现CPE效应(Cytopathic Effect，CPE)，其对呼吸道合胞病毒A亚型的抑制率为108.62％，对呼吸道合胞病毒B亚型的抑制率为103.13％；通过肺部病变评分可见其能有效改善RSV肺炎幼大鼠的症状，治疗效果良好。
本发明涉及的蚕虫草在制备治疗呼吸道合胞病毒(RSV)药物中的用途属于首次公开，而且其对于呼吸道合胞病毒(RSV)抑制活性强的意想不到。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明做进一步阐述，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1
蚕虫草制备：采用5龄家蚕，北虫草菌注射接种，正常饲养，将硬化蚕培养至子实体长出。冷冻干燥后，粉碎至120目，备用。
实施例2蚕虫草对呼吸道合胞病毒(RSV)的作用研究
试样配制：自制蚕虫草(方法如实施例1)、蛹虫草(购买)、虫草花(购买)、冬虫夏草(购买)粉碎后，溶解于DMEM液(含2％小牛血清)中备用，配制浓度为100μg/mL。
利巴韦林注射液(湖北潜江制药股份有限公司生产，批号081004，国药准字H19993455)，规格：100mg/1mL(支)，用含2％小牛血清的DMEM培养基配制浓度为200μg/mL。
细胞株与病毒株：人胚肾细胞(HEK293，RSV病毒敏感细胞)购自美国Clontech公司；呼吸道合胞病毒(RSV)A亚型(Long株)、B亚型(R6株)，由中国科学院武汉分院病毒所提供。
细胞的培养及RSV扩增：人胚肾细胞(HEK293)，镜下观察细胞呈三角形或多角形，生长状态良好的细胞每2-3天传代，0.25％胰酶消化1-2min，镜下观察细胞回缩变圆时停止消化，每次分3-4瓶，于37℃、5％C02培养箱饱和湿度下培养。HEK293细胞以1*105/mL接种24孔板，待细胞长成单层时弃培养液，接种病毒液200μL/孔，置37℃、5％C02培养箱中吸附1.5h后，补充含2％胎牛血清的维持液至1mL/孔，继续培养3-5d。逐日观察细胞病变(cytopathic effect，CPE)，典型病变是融合的大泡，病变达75％以上时，置-70℃(至少2h)和37℃反复冻融3次。收集病毒液，2500r/min离心10min。弃沉淀，收集病毒上清液，分装后于-70℃保存备用。
细胞最大无毒浓度的测定：参照文献(汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒抑制作用的实验研究，南京中医药大学学报，2008；24(1)：25-27)的方法，将虫草样品和利巴韦林接种于96孔板中的HEK293上，每孔100μL，并设正常细胞对照组。置37℃、5％C02培养箱中培养，观察细胞病变至72h。弃去上清液，用移液器每孔加入MTT(1mg/mL)100μL。置培养箱中孵育4h。吸弃孔内上清液，每孔加入100μL DMSO，振荡，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值。确定药物的最大无毒浓度。结果可见在HEK293细胞中，蚕虫草、蛹虫草、虫草花和利巴韦林的最大无毒浓度为500μg/mL。
呼吸道合胞病毒A、B亚型组织培养半数感染量(50percent Tissue CultureInfective Dose，TClD50)的测定：HEK293细胞接种96孔细胞板，每孔100μL。病毒悬液用不完全培养基(不含新生牛血清的培养基)10倍稀释8个浓度。接种细胞，长成单层时吸弃培养液，PBS洗细胞面，接种各稀释度的病毒液。并设正常细胞对照组。置37℃、5％C02培养箱中吸附2h。吸弃病毒液，培养箱中培养，逐日观察病变程度并记录。以最高稀释度不再出现新病变时为终点，细胞病变程度用-～++++表示：无细胞病变时为“-”，25％以下细胞出现病变为“+”，25％～50％为“++”，50％～75％为“+++”，75％～100％为“++++”。用Reed-Muench公式计算TCID50。结果可见在HEK293中，RsvA亚型TCID50为10-3.98，RSVB亚型TCID50为10-3.64。
不同虫草样品对RSV的抑制作用：将1*105浓度的HEK293细胞接种到96孔培养板上，置37℃、5％C02箱培养。待细胞长成单层，在18～36h内，吸弃培养液，PBS洗细胞面，每孔接种100TCID50RSVA或B亚型，置37℃、5％C02培养箱吸附2h。吸弃病毒液，分别加入不同虫草样品，并设利巴韦林药物对照、病毒对照、空白对照和正常细胞对照，每组5个复孔，每孔100μL。利巴韦林用维持液稀释成200μg/mL，正常细胞和病毒对照只加维持液，置37℃、5％C02培养箱。每日在倒置显微镜下观察细胞病变。72h后加入MTT(1mg/mL)，每孔100μL，置37℃、5％％CO2培养箱，4h后，小心吸弃孔内上清液，每孔加入100μLDMSO，振荡，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值。
结果见表1。病毒对照组48h开始出现病变，72h病变最明显，细胞融合成团，部分漂浮。细胞对照组始终未出现病变。空白对照组和各样品组在48h后相继出现病变，但从结果可见对RSV的抑制作用分别是蚕虫草≈冬虫夏草>蛹虫草>虫草花(虫草花基本无效)，可见蚕虫草具有显著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，可以用来制备抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV药物。
表1 蚕虫草不同溶媒提取物对RSV的抑制作用
实施例3
清洁级wistar大鼠，雌雄各半，周龄4-6周，体质量80-100g，清洁级，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(沪)2008-0016。随机分为六个组，每组10只，各组大鼠除正常对照组外，其余用乙醚浅麻醉后鼻腔滴注RSV100TCID50100μL进行病毒接种，连续病毒滴鼻2d。A组：蚕虫草高剂量组(1.2g/kg)，B组：蚕虫草中剂量组(0.6g/kg)，c组：蚕虫草低剂量组(0.3g/kg)，D组：利巴韦林组((50mg/kg))，E组：正常对照组，F组：感染模型组。A、B、c、D、F组大鼠在首次滴鼻感染后24h，开始灌胃给药，共给药3d，正常对照组和感染模型组灌胃同样体积的生理盐水。实验结束后处死，取各组大鼠肺组织，福尔马林固定后进行肺组织病理切片研究。实验结束时，感染模型组大鼠随实验进行而变得不喜动，感染24h大鼠开始出现行动迟缓，呼吸急促，体温稍有升高，偶有咳嗽。消瘦，厌食，多饮，寒颤，气促，耸毛，毛发无光泽等现象。观察病理切片发现肺组织的炎性病灶、各级支气管上皮炎性细胞浸润，或有渗出物、肺大泡、肺泡间隔病变等，提示造模成功。
肺部病变评分标准：肺泡病变分为瘀血、间质炎症和气肿，肺内支气管病变分为上皮变性、腔内渗出和管周炎，根据炎症等由轻到重的程度分别标记为1，2，3，4分，无明显病变为0分，极轻度病变为0.5分，累计所有分数，计算出每组动物的均分。结果如表2所示，可见蚕虫草能有效改善病毒性肺炎症状，治疗效果良好。
表2 蚕虫草样品对RSV肺炎大鼠模型病理评分
| 组别 | n | 组内动物综合评分 |
| A | 10 | 3.08±1.12** |
| B | 10 | 3.44±1.25** |
| C | 10 | 3.60±0.86* |
| D | 10 | 2.92±1.03 |
| E | 10 | 2.29±0.98** |
| F | 10 | 4.40±1.02 |
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| 虫草素的研究进展;杜平中;《2002全国生物资源与生物技术药物学术研讨会会议论文》;20020701;45-51 * |
| 蛹虫草化学成分及药理作用研究进展;樊慧婷;《中国中药杂志》;20130831;第38卷(第15期);2549-2551 * |
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