CN104189026B - 一种从银杏叶提取物中脱除和富集银杏酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从银杏叶提取物中脱除和富集银杏酸的方法，将银杏酸分子印迹聚合物做柱层析填料装柱，然后用银杏叶提取液上柱，再用体积比10：1的环己烷/乙醇混合溶液淋洗，最后层析柱用醇洗脱，流出液为银杏酸，其中所述醇为乙醇、异丙醇、正丙醇或正丁醇。本发明首次将分子印迹技术应用于银杏叶加工过程中的银杏酸脱除，与传统脱除银杏酸方法相比，本发明通过分子印迹‑固相萃取柱的定向富集效果，在脱除银杏酸的同时制备了高纯度的银杏酸，可以为银杏酸的临床药理研究提供原料来源。
Description
技术领域
本发明属于中药制备技术领域，具体涉及一种从银杏叶提取物中脱除和富集银杏酸的方法。
背景技术
银杏是我国特有的珍稀名贵树种，素有“植物界的活化石”之称，原产自我国，被列为国家二级保护植物。我国的银杏叶资源占世界总量的70％，居世界第一位。国内外对银杏叶的有效成分的研究和报道很多，银杏叶制剂是目前世界上应用最为广泛的辅助治疗心脑血管疾病的天然药物之一，疗效独特，被广泛用于药品、膳食补充剂等。
银杏酸(Ginkgolic Acids，简称GAs)是银杏中除银杏黄酮和银杏内酯外的另一具有重要生理活性的组分，存在于银杏的叶、果和外种皮中，其中尤以外种皮中含量最高。银杏酸是一类具有相同的药效基团的长链苯甲酸类化合物，侧链长度为13-19个碳、双键数0-3，常见的5种银杏酸类化合物的结构如下：
国外研究发现银杏酸具有“双重”生物活性，其中“负面”药理活性包括致过敏作用、致癌变作用、胚胎毒性、致突变作用、肾毒性作用等，“正面”药理活性表现为对多种肿瘤细胞有良好的抑制作用和抑菌作用，具有较高的药用价值。
银杏叶提取物在欧盟内使用较长时间，银杏酸作为其中一大类毒副作用成分，欧洲药典的质量标准不断改版并沿续至今。欧盟于2013年严格限定银杏叶提取物中银杏酸水平在5ppm以下，《中国药典》2010年版也限定银杏叶提取物中银杏酸应在10ppm以下。企业在银杏叶制剂生产过程中为使银杏酸含量达到药典的要求，往往采用有机溶剂萃取、柱层析分离、二氧化碳超临界萃取、大孔吸树脂富集等方法。CN03131915.7、CN02113531.2、CN01133794.X、CN200610093940.5、CN200710049086.7和CN201210125732.4涉及了有机溶剂萃取、交换树脂等方法脱除银杏叶提取物中银杏酸的工艺。但这几种方法工艺成本较高，操作比较繁琐，使某些生产银杏叶提取物的企业难以承受。更重要的是，在获得合格银杏叶提取物的过程中，银杏酸无法同时富集制备，这对银杏酸的药理临床研究无疑是巨大的资源浪费。因此，开发一种银杏叶提取物加工过程中同时脱除与富集银杏酸的方法，是一项非常具有创新性和应用性的系统研究工作，具有重要的应用价值。
分子印迹技术是20世纪末出现的一种高选择性分离技术，这种技术的基本思想是源于人们对抗体-抗原专一性的认识，利用具有分子识别能力的聚合材料-分子印迹聚合物来分离、筛选、纯化化合物的一种仿生技术。因为制备的材料有着极高的选择性及卓越的分子识别性能，很快在固相萃取、人工酶学、手性拆分、生物传感器、不对称催化等方面得到了广泛的应用。
分子印迹聚合物是选用与印迹分子产生特定相互作用的功能性单体，通过共价或非共价作用在溶剂中形成印迹分子-功能单体复合物，加入交联剂，在引发剂的引发下与带有特殊官能团的功能单体进行光或热的聚合，形成三维交联的聚合物网络，然后，用合适的溶剂除去印迹分子，在聚合物网络中形成空间与化学功能与印迹分子相匹配的空穴。这种空穴与印迹分子结构完全一样，可对印迹分子或与之结构相似的分子实现特异性的识别。因此，分子印迹技术具有构效预知性、特异识别性和广泛应用性三个特点。
目前尚未见银杏酸分子印迹技术的报道。主要存在以下的原因:模板“银杏酸”价格昂贵,，考虑成本与收入，利用模板“银杏酸”来大规模制备分子印迹聚合物是不合理的，若是使用一般的物质代替银杏酸，将会出现银杏酸分子印迹聚合物对银杏酸的选择性较差，得到的银杏总酸的纯度非常低，迄今还没有一种价格便宜的物质来代替银杏酸，并且得到的分子印迹聚合物选择性强，可用于定向富集银杏酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种从银杏叶提取物中脱除和富集银杏酸的方法，该方法在脱除银杏酸的同时，将银杏酸进行富集纯化，以实现银杏叶提取物和银杏酸的同时制备。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种从银杏叶提取物中脱除和富集银杏酸的方法，将银杏酸分子印迹聚合物做柱层析填料装柱，然后用银杏叶提取液上柱，再用体积比环己烷/乙醇混合溶液(10：1)淋洗，流出液为脱除银杏酸的银杏叶提取物(小于5ppm)，最后层析柱用醇洗脱，流出液为高纯度银杏酸，其中所述醇为乙醇、异丙醇、正丙醇或正丁醇，优选乙醇。
上述银杏酸分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将假模板、功能单体、交联剂、引发剂、制孔剂按质量比为1～3:2～6:15～30:0.05～0.10:20～70加入到反应釜中混合；
(2)将步骤1)中的混合溶剂，超声脱气(优选10-15分钟)，然后充氮除氧(优选10-20分钟)；
(3)密封后于40～60℃条件下聚合18～24小时，得到带模板分子的聚合物；
(4)将步骤3)得到的聚合物研磨、筛分后除去模板分子；
(5)将除去模板分子的聚合物，干燥后得到银杏酸分子印迹聚合物；
所述假模板为2-羟基-6-烷氧基苯甲酸，结构式如图4所示，其中烷氧基为-O(CH2)nCH3(n＝0～15)，优选为n＝15；功能单体为丙烯酰胺、甲基丙烯酸或4-乙烯基吡啶，优选为4-乙烯基吡啶；所述的交联剂为N,N-二甲基二丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯或二乙烯基苯，优选为二甲基丙烯酸乙二醇酯；所述制孔剂为氯仿；所述引发剂为偶氮二异丁腈或偶氮二异戊腈，优选为偶氮二异丁腈。
优选上述步骤4)得到的聚合物研磨过150～200目筛，除去模板分子用体积分数为10％～20％的乙酸甲醇溶液。
所述步骤5)干燥为真空下50～65℃烘干。
由上述方法制备得到的银杏酸分子印迹聚合物。
本发明的有益效果：
本发明首次将分子印迹技术应用于银杏叶加工过程中的银杏酸脱除，与传统脱除银杏酸方法相比，本发明通过分子印迹-固相萃取柱的定向富集效果，在脱除银杏酸的同时制备了高纯度的银杏酸，可以为银杏酸的临床药理研究提供原料来源。
本发明采用“假模板”分子印迹技术，用简便易得或易于化学合成的2-羟基-6-烷氧基苯甲酸替代价格昂贵的真实模板“银杏酸”，可以为大规模制备分子印迹聚合物提供可靠的原料来源，使成本大大降低。
本发明的分子印迹聚合物选择性强，用于定向富集银杏酸时，只有银杏酸分子能够进入印迹当中，而其它的杂质分子不能进入印迹，使得该分子印迹聚合物主要吸附银杏酸，其它的杂质吸附的很少，使得到的银杏总酸的纯度可达到95％以上。
本发明的用于脱除与富集银杏酸的分子印迹聚合物在应用之后还可再生，且其再生方法简单、可行。
该方法制备得到的分子印迹聚合物，其材料上留有孔穴(或称为印迹)，对银杏酸具有高度的选择性。
附图说明
图1是本发明的分子印迹技术脱除与富集银杏酸的流程图；
图2是实施例1制得的淋洗液高效液相色谱图，即经分子印迹-固相萃取柱脱除银杏酸之后的银杏叶提取物液相色谱图；
图3是实施例1制得的洗脱液高效液相色谱图，即经分子印迹-固相萃取柱富集之后的银杏总酸液相色谱图，其中峰1代表银杏酸C13:0，峰2代表银杏酸C15:1，峰3代表银杏酸C17:2，峰4代表银杏酸C15:0，峰5代表银杏酸C17:1；
图4是本发明中使用的银杏酸结构类似物的分子结构式，即“假模板”2-羟基-6-烷氧基苯甲酸。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
分子印迹技术脱除与富集银杏酸的流程图如图1所示，具体步骤如下：
银杏酸假模板分子印迹聚合物的制备：
(1)备料
各原料组分按如下用量配比配料：假模板分子2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝15)0.99g，功能单体4-乙烯基吡啶1.66g，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯16.12g，引发剂偶氮二异丁腈0.13g，制孔剂氯仿45.34g；
(2)制备带有模板分子的聚合物
将上述备好的2-羟基-6-烷氧基苯甲酸、4-乙烯基吡啶、二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二异丁腈、氯仿加入到反应釜中混合均匀，超声脱气15min，然后充氮除氧15分钟，密封后于60℃恒温水浴聚合24小时，得到带有模板分子的聚合物；
(3)制备脱去模板分子的分子印迹聚合物
将上述制备的聚合物碾磨过200目筛，即得到带有假模板分子的聚合物颗粒，用乙酸体积分数为10％的甲醇溶液洗脱，于60℃真空干燥后，得到分子印迹聚合物18.4g。
银杏酸假模板分子印迹聚合物在脱除与富集银杏酸中的应用：
取15克本实施例制得的分子印迹聚合物装柱，称取100g银杏叶粉碎，加入500mL丙酮加热回流提取2h后，过滤，滤液上柱。待上柱溶液流尽后，用环己烷/乙醇(10：1，v/v)进行淋洗，得淋洗液。层析柱用乙醇洗脱，得洗脱液。淋洗液与洗脱液高效液相色谱图，如图2和图3所示，按照欧洲药典方法计算，淋洗液中银杏总酸含量为2.5ppm，小于规定的5ppm，洗脱液中银杏总酸纯度为99.6％。结果说明分子印迹-固相萃取对银杏酸有较好的脱除与富集效果。
银杏酸假模板分子印迹聚合物的再生：将上述洗去银杏酸的分子印迹聚合物，用95％乙醇洗脱，即可再生用于下一次提取用。
实施例2
银杏酸假模板分子印迹聚合物的制备：
(1)备料
本实施例各组分按如下用量配比配料：模板分子2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝0)0.91g，功能单丙烯酰胺1.83g，交联剂N,N-二甲基二丙烯酰胺24.00g，引发剂偶氮二异丁腈0.15g，溶剂氯仿50.00g。
(2)制备带有模板分子的聚合物
将步骤(1)中备好的2-羟基-6-烷氧基苯甲酸、丙烯酰胺、N,N-二甲基二丙烯酰胺、偶氮二异丁腈和氯仿加入到反应釜中混合均匀，超声脱气15min，然后充氮除氧15分钟，密封后于60℃恒温水浴聚合24小时，得到带有模板分子的聚合物；
(3)制备脱去模板分子的分子印迹聚合物
将步骤(2)制备的聚合物碾磨过200目筛，即得到带有模板分子银杏酸的聚合物颗粒，用乙酸体积分数为18％甲醇溶液洗脱，于60℃真空干燥后，得到分子印迹聚合物21.1g。
银杏酸假模板分子印迹聚合物在脱除与富集银杏酸中的应用：
取20克本实施例制得的分子印迹聚合物装柱。称取100g银杏叶粉碎，加入500 mL丙酮加热回流提取2h后，过滤，滤液上柱。待上柱溶液流尽后，用环己烷/乙醇(10：1，v/v)溶液300毫升进行淋洗，得淋洗液，层析柱用正丁醇洗脱，得洗脱液，按照欧洲药典方法计算，淋洗液中银杏酸含量为4.5ppm，小于规定的5ppm，洗脱液中银杏总酸纯度为99.1％。结果说明分子印迹-固相萃取对银杏酸有较好的脱除与富集效果。
银杏酸假模板分子印迹聚合物的再生：将上述洗去银杏酸的分子印迹聚合物，用95％乙醇洗脱，即可再生用于下一次提取用。
实施例3
银杏酸假模板分子印迹聚合物的制备：
(1)备料
本实施例各组分按如下用量配比配料：模板分子2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝1)0.85g，功能单体甲基丙烯酸1.66g，交联剂二乙烯基苯21.10g，引发剂(偶氮二异戊腈)0.10g，溶剂氯仿47.00g。
(2)制备带有模板分子的聚合物
将步骤(1)中备好的2-羟基-6-烷氧基苯甲酸、甲基丙烯酸、二乙烯基苯、偶氮二异戊腈、氯仿加入反应釜中混合均匀，超声脱气15min，然后充氮除氧15分钟，密封后于60℃恒温水浴聚合24小时，得到带有模板分子的聚合物；然后将其碾磨过200目筛，即得到带有模板分子银杏酸的分子印迹聚合物颗粒。
(3)制备脱去模板分子的分子印迹聚合物
将步骤(2)制备的聚合物碾磨过200目筛，即得到带有模板分子的聚合物颗粒，用乙酸体积分数为12％甲醇溶液洗脱，于60℃真空干燥后，得到分子印迹聚合物19.8g。
银杏酸假模板分子印迹聚合物在脱除与富集银杏酸中的应用：
取15克本实施例制得的分子印迹聚合物装柱。称取100g银杏叶粉碎，加入500mL丙酮加热回流提取2h后，过滤，滤液上柱。待上柱溶液流尽后，用环己烷/乙醇(10：1，v/v)溶液300毫升进行淋洗，得淋洗液，层析柱用异丙醇洗脱，得洗脱液，按照欧洲药典方法计算，淋洗液中银杏酸含量为3.5ppm，小于规定的5ppm，洗脱液中银杏总酸纯度为98.1％。结果说明分子印迹-固相萃取对银杏酸有较好的脱除与富集效果。
银杏酸假模板分子印迹聚合物的再生：将上述洗去银杏酸的分子印迹聚合物，用95％乙醇洗脱，即可再生用于下一次提取用。
实施例4
银杏酸假模板分子印迹聚合物的制备：
(1)备料
本实施例各组分按如下用量配比配料：模板分子2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝15)1.97g，功能单体4-乙烯基吡啶3.63g，交联剂N,N-二甲基二丙烯酰胺31.00g，引发剂偶氮二异丁腈0.10g，制孔剂氯仿54.00g。
(2)制备带有模板分子的聚合物
将步骤(1)中备好的2-羟基-6-烷氧基苯甲酸、4-乙烯基吡啶、N,N-二甲基二丙烯酰胺、偶氮二异丁腈、氯仿加入到反应釜中混合均匀，超声脱气15min，然后充氮除氧15分钟，密封后于60℃恒温水浴聚合24小时，得到带有模板分子的聚合物；
(3)制备脱去模板分子的分子印迹聚合物
将步骤(2)制备的聚合物碾磨过200目筛，即得到带有模板分子的聚合物颗粒，用乙酸体积分数为10％甲醇溶液洗脱由步骤(2)所制得的带有模板分子的分子印迹聚合物颗粒，于60℃真空干燥后，得到分子印迹聚合物28.4g。
银杏酸假模板分子印迹聚合物在脱除与富集银杏酸中的应用：
取13克本实施例制得的分子印迹聚合物装柱。称取100g银杏叶粉碎，加入500mL丙酮加热回流提取2h后，过滤，滤液上柱。待上柱溶液流尽后，用环己烷/乙醇(10：1，v/v)溶液300毫升进行淋洗，得淋洗液，层析柱用异丙醇洗脱，得洗脱液，按照欧洲药典方法计算，淋洗液中银杏酸含量为3.7ppm，小于规定的5ppm，洗脱液中银杏总酸纯度为97.1％。结果说明分子印迹-固相萃取对银杏酸有较好的脱除与富集效果。
银杏酸假模板分子印迹聚合物的再生：将上述洗去银杏酸的分子印迹聚合物，用95％乙醇洗脱，即可再生用于下一次提取用。
实施例5
银杏酸假模板分子印迹聚合物的制备：
(1)备料
本实施例各组分按如下用量配比配料：模板分子2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝7)2.27g，功能单体4-乙烯基吡啶3.63g，交联剂二乙烯基苯34.00g，引发剂偶氮二异丁腈0.12g，制孔剂氯仿54.00g。
(2)制备带有模板分子的分子印迹聚合物
将步骤(1)中备好的模板分子2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝7)、4-乙烯基吡啶、二乙烯基苯、偶氮二异丁腈、氯仿的混合溶剂加入反应釜中混合均匀，超声脱气15min，然后充氮除氧15分钟，密封后于60℃恒温水浴聚合24小时，得到带有模板分子的聚合物；
(3)制备脱去模板分子的分子印迹聚合物
将步骤(2)制备的聚合物碾磨过200目筛，即得到带有模板分子的聚合物颗粒，用乙酸体积分数为10％甲醇溶液洗脱，于60℃真空干燥后，得到分子印迹聚合物25.7g。
银杏酸假模板分子印迹聚合物在脱除与富集银杏酸中的应用：
取20克本实施例制得的分子印迹聚合物装柱。称取100g银杏叶粉碎，加入500mL丙酮回流提取2h后，过滤，滤液上柱。待上柱溶液流尽后，用环己烷/乙醇(10：1，v/v)溶液300毫升进行淋洗，得淋洗液，层析柱用正丁醇洗脱，得洗脱液，按照欧洲药典方法计算，淋洗液中银杏酸含量为2.7ppm，小于规定的5ppm，洗脱液中银杏总酸纯度为99.1％。结果说明分子印迹-固相萃取对银杏酸有较好的脱除与富集效果。
银杏酸假模板分子印迹聚合物的再生：将上述洗去银杏酸的分子印迹聚合物，用95％乙醇洗脱，即可再生用于下一次提取用。
实施例6
银杏酸假模板分子印迹聚合物的制备：
(1)备料
本实施例各组分按如下用量配比配料：模板分子2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝9)2.57g，功能单体丙烯酰胺3.67g，交联剂N,N-二甲基二丙烯酰胺38.00g，引发剂偶氮二异丁腈0.10g，制孔剂氯仿50.00g。
(2)制备带有模板分子的聚合物
将步骤(1)中备好的模板分子2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝9)、丙烯酰胺、N,N-二甲基二丙烯酰胺、偶氮二异丁腈、氯仿的混合溶剂加入反应釜中混合均匀，超声脱气15min，然后充氮除氧15分钟，密封后于60℃恒温水浴聚合24小时，得到带有模板分子的聚合物；
(3)制备脱去模板分子的分子印迹聚合物
将步骤(2)制备的聚合物碾磨过200目筛，即得到带有模板分子的聚合物颗粒，用乙酸体积分数为10％甲醇溶液洗脱，于60℃真空干燥后，得到分子印迹聚合物27.4g。
银杏酸假模板分子印迹聚合物在脱除与富集银杏酸中的应用：
取20克本实施例制得的分子印迹聚合物装柱。称取100g银杏叶粉碎，加入500mL丙酮加热回流提取2h后，过滤，滤液上柱。待上柱溶液流尽后，用环己烷/乙醇(10：1，v/v)溶液300毫升进行淋洗，得淋洗液，层析柱用乙醇洗脱，得洗脱液，按照欧洲药典方法计算，淋洗液中银杏酸含量为2.5ppm，小于规定的5ppm，洗脱液中银杏总酸纯度为99.2％。结果说明分子印迹-固相萃取对银杏酸有较好的脱除与富集效果。
银杏酸假模板分子印迹聚合物的再生：将上述洗去银杏酸的分子印迹聚合物，用95％乙醇洗脱，即可再生用于下一次提取用。
实施例7
银杏酸假模板分子印迹聚合物的制备：
(1)备料
本实施例各组分按如下用量配比配料：模板分子2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝11)3.37g，功能单体4-乙烯基吡啶5.53g，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯37.00g，引发剂偶氮二异戊腈0.10g，制孔剂氯仿60.00g。
(2)制备带有模板分子的聚合物
将步骤(1)中备好的2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝11)、4-乙烯基吡啶、二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二异戊腈、氯仿加入到反应釜中混合均匀，超声脱气15min，然后充氮除氧15分钟，密封后于60℃恒温水浴聚合24小时，得到带有模板分子的聚合物；
(3)制备脱去模板分子的分子印迹聚合物
将步骤(2)制备的聚合物碾磨过200目筛，即得到带有模板分子的聚合物颗粒，用乙酸体积分数为10％甲醇溶液洗脱，于60℃真空干燥后，即得到分子印迹聚合物28.7g。
银杏酸假模板分子印迹聚合物在脱除与富集银杏酸中的应用：
取20克本实施例制得的分子印迹聚合物装柱。称取100g银杏叶粉碎，加入500mL丙酮加热回流提取2h后，过滤，滤液上柱。待上柱溶液流尽后，用环己烷/乙醇(10：1，v/v)溶液300毫升进行淋洗，得淋洗液，层析柱用乙醇洗脱，得洗脱液，按照欧洲药典方法计算，淋洗液中银杏酸含量为2.9ppm，小于规定的5ppm，洗脱液中银杏总酸纯度为98.7％。结果说明分子印迹-固相萃取对银杏酸有较好的脱除与富集效果。
银杏酸假模板分子印迹聚合物的再生：将上述洗去银杏酸的分子印迹聚合物，用95％乙醇洗脱，即可再生用于下一次提取用。
实施例8
银杏酸假模板分子印迹聚合物的制备：
(1)备料
本实施例各组分按如下用量配比配料：模板分子2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝12)3.57g，功能单体甲基丙烯酸5.97g，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯38.00g，引发剂偶氮二异戊腈0.10g，制孔剂氯仿61.00g。
(2)制备带有模板分子的聚合物
将步骤(1)中备好的2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝12)、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二异戊腈、氯仿加入到反应釜中混合均匀，超声脱气15min，然后充氮除氧15分钟，密封后于60℃恒温水浴聚合24小时，得到带有模板分子的聚合物；
(3)制备脱去模板分子的分子印迹聚合物
将步骤(2)制备的聚合物碾磨过200目筛，即得到带有模板分子的聚合物颗粒，用乙酸体积分数为10％甲醇溶液洗脱，于60℃真空干燥后，即得到分子印迹聚合物30.4g。
银杏酸假模板分子印迹聚合物在脱除与富集银杏酸中的应用：
取20克本实施例制得的分子印迹聚合物装柱。称取100g银杏叶粉碎，加入500mL丙酮加热回流提取2h后，过滤，滤液上柱。待上柱溶液流尽后，用环己烷/乙醇(10：1，v/v)溶液300毫升进行淋洗，得淋洗液，层析柱用异丙醇洗脱，得洗脱液，按照欧洲药典方法计算，淋洗液中银杏酸含量为3.1ppm，小于规定的5ppm，洗脱液中银杏总酸纯度为98.8％。结果说明分子印迹-固相萃取对银杏酸有较好的脱除与富集效果。
银杏酸假模板分子印迹聚合物的再生：将上述洗去银杏酸的分子印迹聚合物，用95％乙醇洗脱，即可再生用于下一次提取用。
实施例9
银杏酸假模板分子印迹聚合物的制备：
(1)备料
本实施例各组分按如下用量配比配料：模板分子2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝13)3.21g，功能单体4-乙烯基吡啶6.63g，交联剂二乙烯基苯35.76g，引发剂偶氮二异丁腈0.10g，制孔剂氯仿55.00g。
(2)制备带有模板分子的聚合物
将步骤(1)中备好的2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝13)、4-乙烯基吡啶、二乙烯基苯、偶氮二异丁腈、氯仿的混合溶剂加入反应釜中混合均匀，超声脱气15min，然后充氮除氧15分钟，密封后于60℃恒温水浴聚合24小时，得到带有模板分子的聚合物；
(3)制备脱去模板分子的分子印迹聚合物
将步骤(2)制备的聚合物碾磨过200目筛，即得到带有模板分子的聚合物颗粒，用乙酸体积分数为10％甲醇溶液洗脱，于60℃真空干燥后，即得到分子印迹聚合物30.1g。
银杏酸假模板分子印迹聚合物在脱除与富集银杏酸中的应用：
取20克本实施例制得的分子印迹聚合物装柱。称取100g银杏叶粉碎，加入500mL丙酮加热回流提取2h后，过滤，滤液上柱。待上柱溶液流尽后，用环己烷/乙醇(10：1，v/v)溶液300毫升进行淋洗，得淋洗液，层析柱用异丙醇洗脱，得洗脱液，按照欧洲药典方法计算，淋洗液中银杏酸含量为4.1ppm，小于规定的5ppm，洗脱液中银杏总酸纯度为98.5％。结果说明分子印迹-固相萃取对银杏酸有较好的脱除与富集效果。
银杏酸假模板分子印迹聚合物的再生：将上述洗去银杏酸的分子印迹聚合物，用95％乙醇洗脱，即可再生用于下一次提取用。
实施例10
本实施例所使用的假模板为2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝15)，功能单体为4-乙烯基吡啶，交联剂为二乙烯基苯，溶剂为氯仿，引发剂为偶氮二异丁腈，其它均与实施例1相同，收集洗脱液。按照欧洲药典方法计算，淋洗液中银杏酸含量为3.8ppm，小于规定的5ppm，洗脱液中银杏总酸纯度为98.7％。结果说明分子印迹-固相萃取对银杏酸有较好的脱除与富集效果。
实施例11
本实施例所使用的假模板为2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝5)，功能单体为4-乙烯基吡啶，交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯，溶剂为氯仿，引发剂为偶氮二异丁腈，其它均与实施例1相同，收集洗脱液。按照欧洲药典方法计算，淋洗液中银杏酸含量为4.8ppm，小于规定的5ppm，洗脱液中银杏总酸纯度为98.9％。结果说明分子印迹-固相萃取对银杏酸有较好的脱除与富集效果。
实施例12
本实施例所使用的假模板为2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝5)，功能单体为丙烯酰胺，交联剂为二乙烯基苯，溶剂为氯仿，引发剂为偶氮二异丁腈，其它均与实施例1相同，收集洗脱液。按照欧洲药典方法计算，淋洗液中银杏酸含量为3.8ppm，小于规定的5ppm，洗脱液中银杏总酸纯度为97.9％。结果说明分子印迹-固相萃取对银杏酸有较好的脱除与富集效果。
实施例13
本实施例所使用的假模板为2-羟基-6-烷氧基苯甲酸(n＝7)，功能单体为4-乙烯基吡啶，交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯，溶剂为氯仿，引发剂为偶氮二异丁腈，其它均与实施例1相同，收集洗脱液。按照欧洲药典方法计算，淋洗液中银杏酸含量为2.8ppm，小于规定的5ppm，洗脱液中银杏总酸纯度为98.9％。结果说明分子印迹-固相萃取对银杏酸有较好的脱除与富集效果。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (6)
1.一种从银杏叶提取物中脱除和富集银杏酸的方法，其特征在于，将银杏酸分子印迹聚合物做柱层析填料装柱，然后用银杏叶提取液上柱，再用体积比10：1的环己烷/乙醇混合溶液淋洗，最后层析柱用醇洗脱，流出液为银杏酸；
所述银杏酸分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将假模板、功能单体、交联剂、引发剂、制孔剂按质量比为1～3:2～6:15～30:0.05～0.10:20～70加入到反应釜中混合；
(2)将步骤1)中的混合溶剂，超声脱气，然后充氮除氧；
(3)密封后于40～60℃条件下聚合18～24小时，得到带模板分子的聚合物；
(4)将步骤3)得到的聚合物研磨、筛分后除去模板分子；
(5)将除去模板分子的聚合物，干燥后得到银杏酸分子印迹聚合物；
所述假模板为2-羟基-6-烷氧基苯甲酸，其中烷氧基为-O(CH2)nCH3(n＝0～15)；功能单体为丙烯酰胺、甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶三者中的一种；所述的交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯或二乙烯基苯；所述制孔剂为氯仿；所述引发剂为偶氮二异丁腈或偶氮二异戊腈。
2.如权利要求1所述的从银杏叶提取物中脱除和富集银杏酸的方法，其特征在于，所述醇为乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇四者中的一种。
3.如权利要求1所述的从银杏叶提取物中脱除和富集银杏酸的方法，其特征在于，所述步骤2)超声脱气10-15分钟，然后充氮除氧10-20分钟。
4.如权利要求1所述的从银杏叶提取物中脱除和富集银杏酸的方法，其特征在于，所述步骤4)得到的聚合物研磨过150～200目筛，除去模板分子用体积分数为10％～20％的乙酸甲醇溶液。
5.如权利要求1所述的从银杏叶提取物中脱除和富集银杏酸的方法，其特征在于，所述步骤5)干燥为真空下50～65℃烘干。
6.如权利要求1所述的从银杏叶提取物中脱除和富集银杏酸的方法，其特征在于，所述n为15。
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