CN104178564B - 高温胁迫下褐飞虱内参基因的筛选方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高温胁迫下褐飞虱内参基因的筛选方法，以未受胁迫的褐飞虱为对照材料，不同高温胁迫后的褐飞虱为实验材料进行荧光定量PCR研究；各候选内参基因定量PCR数据输入geNorm和BestKeeper软件进行分析，从而筛选出在高温胁迫和非胁迫下褐飞虱体内最合适、最稳定表达的内参基因——actin1。在此基础上，发明人以高温胁迫后的褐飞虱为样本，以褐飞虱热激蛋白基因hsp90为目的基因，筛选出的actin1基因为内参基因，研究了在高温胁迫下褐飞虱hsp90基因的表达规律。

Description

高温胁迫下褐飞虱内参基因的筛选方法及应用
技术领域
本发明属于分子生物学中昆虫体内稳定性表达内参基因技术领域，尤其涉及一种高温胁迫下褐飞虱内参基因的筛选方法及应用。
背景技术
随着现代人类工业的发展的影响，全球气候正在逐渐变暖。昆虫是变温动物，温度对昆虫的影响至关重要。过高的环境温度将直接使昆虫的生长发育、繁殖、种群发展及生存等受到严重的改变。以往，人们根据环境气候条件、虫群基数及食物等来预测预报害虫的发生，但是高温条件改变了昆虫的生存状况，导致在昆虫预测报中信息偏差而不准确。不同种类的昆虫对高温胁迫的耐受性表现出高低不同，有些昆虫在高于正常生长温度较多的条件下仍能正常生存，而有些昆虫则对温度的变化极其敏感，较小范围的温度波动就可能对其产生较大的影响甚至死亡。
褐飞虱Brown rice planthopper(Nilaparvata lugens(Stal))，别名：褐稻虱，属同翅目飞虱科(Homoptera:Delphacidae)具远距离迁飞习性，是我国和许多亚洲国家当前水稻上的首要害虫，每年造成的农业损失达数亿元。该害虫的预测预报与综合防治在生产中尤其重要。目前，在全球气候变暖的大背景下，极端高温天气频繁出现，这给农业上预测预报该害虫发生情况造成了很大影响。研究褐飞虱对高温的耐受性及其机理的影响已迫在眉睫。
已有研究结果表明，有机体对外界环境刺激的反应同体内功能基因翻译、转录和表达密切相关，昆虫对高温胁迫反应也不例外。高温对于昆虫的具体影响从表观上观察还无从得知，因此，研究高温对昆虫体内遗传基因的影响是人们了解昆虫应对胁迫机理机制的一个很好的方法。
研究褐飞虱高温胁迫后体内相关响应基因种类及其功能，其中重要的技术方法就是对功能基因进行快速、准确的表达定量分析。与传统的印迹杂交、生物芯片、和半定量RT-PCR等定量分析方法相比，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术具有快速、准确、易操作和低成本等优势，是近年发展起来的研究基因功能的重要方法。然而，实时荧光定量PCR检测的准确性中一个最重要的依赖参数是合适的内参基因选择问题，稳定的内参基因可以对数据进行校正和标准化，从而精确定量目标基因的表达量。内参基因是生物体或者细胞中稳定表达的基因，在不同细胞、组织中表达量几乎不变，没有组织特异性，对外界环境刺激反应不敏感。在昆虫中常用的内参基因有Actin、18S rRNA、28S rRNA、GAPDH、Tublin等，但是没有一种内参基因mRNA表达水平在所有的条件下是一成不变的。在各种因素影响下，如在实验条件下，细胞发育的不同阶段，内参基因的表达水平是不同的。因此，研究不同的环境条件下，某一有机体内基因的表达情况，内参基因的选择至关重要。
近年来，科研工作者们已经发现一些与昆虫热胁迫响应相关的基因，如热激蛋白基因，褐飞虱体内也已经发现了两种hsp70和hsp90(Genebank获取号：JQ782193.1和GU723300.1)，但这些基因在褐飞虱体内对热胁迫的功能和特征还未进行研究，热胁迫下褐飞虱体内最稳定的内参基因的研究更未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高温胁迫下褐飞虱内参基因的筛选方法及应用，为褐飞虱在不同高温胁迫下合适的内参基因选择提供依据。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
高温胁迫下褐飞虱内参基因的筛选方法，以25℃饲养的褐飞虱为对照，设置6个高温梯度对褐飞虱成虫进行胁迫处理，处理后立即提取总RNA，反转录合成cDNA，然后以对照和各处理为材料进行实时荧光定量PCR验证，采用geNorm和BestKeeper软件进行数据分析，从而筛选出褐飞虱成虫体内不同高温胁迫和非胁迫(对照)下最稳定表达的内参基因。
上述高温胁迫下褐飞虱内参基因的筛选方法，包括以下步骤：
<1>采用primer5.0软件设计合成褐飞虱actin1、actin2、actin3、18S、28S和α-2-Tublin候选内参基因及热激蛋白hsp90基因特异性实时荧光定量PCR引物，并利用定量PCR溶解曲线法确定其扩增特异性及按10倍梯度稀释cDNA分别进行定量PCR建立标准曲线，确立每对引物的扩增效率；
<2>分别选取30℃、32℃、34℃、36℃、38℃和40℃高温胁迫1小时和2小时及非胁迫处理的褐飞虱雌、雄成虫为实验材料，提取总RNA，分别反转录合成cDNA进行实时荧光定量PCR分析；
<3>将实时荧光定量PCR实验数据输入到geNorm和BestKeeper软件进行内参基因稳定性分析，最终确立最稳定表达的基因及数目组合。
步骤<1>和<2>中褐飞虱成虫为羽化后3-7天的雌、雄成虫。
步骤<2>中褐飞虱的饲养条件和胁迫处理方法分别为：
饲养条件：从野外采集活体褐飞虱，在实验室25℃恒温，湿度75±5％，光照:黑暗＝14小时:10小时条件下用新鲜水稻饲养；2-3代后，采用成虫进行高温胁迫处理；
胁迫处理方法：设置温照培养箱温度到处理温度，分别把褐飞虱雌、雄成虫引入至放置新鲜水稻苗的玻璃管中(直径:高度＝5cm:25cm)，纱布封口后分别处理1小时和2小时；处理后室温恢复1小时，立即提取总RNA，保存于液氮中或-80℃备用；每个处理均设置3个生物学重复。
步骤<2>中实时荧光定量PCR的条件和程序分别为：
实时荧光定量PCR的条件:PCR所用的cDNA模板是用1μg样品总RNA反转录合成而来，定量PCR反应体积为20μL，包含Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)10μL，F/R引物各0.25μM，模板2μL，添加灭菌蒸馏水至20μL；
实时荧光定量PCR的程序:95℃30S，接下来95℃10S，60℃30S共40个循环，循环结束后绘制溶解曲线：55℃-95℃，每0.5℃收集一次荧光信号；每个样本均设置3个定量PCR重复。
候选内参基因和热激蛋白hsp90基因的引物分别具有以下碱基序列：
actin1：TGTCTCTCACACAGTCCCCATCT/GTCAAGTCACGACCAGCCAAG；
actin2：AGTCGCACCCGAAGAG/AGCCTGGATAGCAACATA；
actin3：TGTGATGGTGGGTATGGG/ATGGCAGGTGAAGCGAAG；
18S：ACCAGGTCCAGACACAATG/CACTCCACCAACTAAGAACG；
28S：ATCAGCGGGGAAAGAAGA/ATCCGAGTAAGTAAGGAAACGA
α-2-Tublin：GGGCTTCCTCATCTTCC/AACGGCTGTTGATACCTG；
hsp90:TGTGAACAACCTGGGAAC/GGACCGTAAACGAACCTC。
上述筛选方法在利用荧光定量PCR技术研究热胁迫相关基因的表达与功能方面的应用。
上述应用是以高温胁迫后的褐飞虱为样本，以褐飞虱热激蛋白基因hsp90为目的基因，筛选出的基因为内参基因探讨hsp90在褐飞虱热胁迫下的表达规律。
高温胁迫褐飞虱各胁迫温度是30℃、32℃、34℃、36℃、38℃和40℃，处理时间均为1小时。
actin1基因用作高温胁迫下褐飞虱实时荧光定量PCR分析中的内参基因。
本发明利用荧光定量PCR技术，建立了一种高温胁迫下褐飞虱内参基因的筛选方法，以未受胁迫的褐飞虱为对照材料，不同高温胁迫后的褐飞虱为实验材料进行荧光定量PCR研究；各候选内参基因定量PCR数据输入geNorm和BestKeeper软件进行分析，从而筛选出在高温胁迫和非胁迫下褐飞虱体内最合适、最稳定表达的内参基因——actin1。本发明为下一步利用荧光定量PCR技术研究水稻重要害虫褐飞虱在高温胁迫下相关基因的表达与功能奠定了基础。在此基础上，发明人以高温胁迫后的褐飞虱为样本，以褐飞虱热激蛋白基因hsp90为目的基因，筛选出的actin1基因为内参基因，研究了在高温胁迫下褐飞虱hsp90基因的表达规律。本发明解决了褐飞虱应对不同高温环境下内参基因的筛选问题，应用本发明可建立了褐飞虱成虫体内高温胁迫下不同内参基因的实时荧光定量PCR检测方法。
附图说明
图1是候选内参基因荧光定量PCR溶解曲线图。
图2是候选内参基因扩增曲线和标准曲线图。
图3是geNormer分析候选内参基因表达稳定值及最适合内参基因数目组合图，图中：A雌虫表达稳定值分析结果；B雄虫表达稳定值分析结果；C雌虫最适合内参基因数目组合图；D雄虫最适合内参基因数目组合图。
图4是以actin1为内参基因，不同温度胁迫后褐飞虱hsp90基因相对定量表达图，图中：A雌虫分析结果；B雄虫分析结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步说明，其中涉及分子生物学相关操作的参照Sambrook J,Russell DW编著的《分子克隆实验指南》(科学出版社，第三版，黄培堂译，2002年)进行，引物合成由英潍捷基(广州)公司完成，定量PCR操作按照仪器操作指南和荧光定量试剂使用说明进行。
一、褐飞虱虫源的饲养
从田间采集褐飞虱带回至实验室以25℃恒温，湿度75±5％，光照:黑暗＝14小时:10小时条件下用新鲜水稻饲养。饲养至2-3代后用于实验。
二、实时荧光定量PCR内参基因引物的设计及验证分析
从NCBI数据库Blast褐飞虱候选内参基因actin1、actin2、actin3、18S、28S和α-2-Tublin序列片段，利用Primer5.0软件设计内参基因特异性定量引物(表1)；以实验室饲养的褐飞虱为材料，提取总RNA，反转录合成cDNA。RNA提取过程：取20头褐飞虱活虫放入1.5ml离心管中，加入200μl Trizol试剂，利用手持电动研磨器研磨1min，然后加入800μl Trizol试剂，接下来按照试剂说明书操作完成总RNA提取。总RNA完整性检测：1％琼脂糖凝胶电泳，1×TAE缓冲液，100V，15min；质量和浓度检测：2μl检测样品，NanoDrop-1000微量分光光度计检测OD260/280值和浓度，OD260/280值介于1.9-2.1为合格样品。第一链cDNA反转录合成：1μg总RNA，5×gDNA Eraser Buffer2μl，gDNA Erase1μl，加入无RNA酶灭菌水至20μl，42℃反应2分钟，然后向反应液中加入PrimeScript RT Enzyme Mix I1μl，RT Primer Mix1μl，5×PrimeScript Buffer2(for Real Time)4μl，无RNA酶灭菌水4μl，轻柔混均后37℃反应15min，接下来85℃5秒钟，-20℃保存备用。所用反转录反应操作均在冰上操作进行。反转录试剂盒购自大连Takara公司，Code No.RR047A。
以上述反转录合成的cDNA为模板，利用设计合成的特异引物PCR扩增目的基因，琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段长度是否与目的片段一致，然后切胶纯化回收目的片段，进行克隆和测序，然后采用mega5.0软件进行序列比对分析。PCR扩增体系：20μl反应体系包括：10×PCR Buffer(含15mmol/L Mg2+)2μl，dNTP(各2.5mM)1.6μl，F/R引物各0.8μM，cDNA模板2μl，DNA Taq酶0.5U，加灭菌水至20μl。
三、内参基因特异性定量PCR检测
以上述1.2步骤中的cDNA为模板，对各内参基因进行荧光定量PCR扩增，绘制溶解曲线(图1)，以溶解曲线是否为单峰判断各引物的特异性。实时荧光定量PCR反应体积为20μL，包含：Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)10μL，F/R引物各0.25μM，模板2μL，添加灭菌蒸馏水至20μL。反应程序为：95℃30S，接下来95℃10S，60℃30S共40个循环，循环结束后绘制溶解曲线：55℃-95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。SYBR荧光试剂购自大量Takara公司。定量PCR仪为Chromo4，Bio-rad公司。同时，以10倍梯度稀释cDNA模板，建立内参基因引物扩增标准曲线(图2)，根据标准曲线斜率确立每对引物的扩增效率(E)，E＝10-1/斜率-1，斜率由定量仪器自带软件给出，以扩增效率是否介于80％-110％之间为标准判断引物是否适用。标准曲线荧光定量反应体系及循环程序同前述。SYBR荧光试剂购自大量Takara公司。定量PCR仪为Chromo4，Bio-rad公司。
四、褐飞虱高温胁迫处理
饲养的褐飞虱至2-3代后，进行高温胁迫处理，处理方法为：设置温照培养箱温度至处理温度，分别把褐飞虱雌、雄成虫引入至玻璃管中(直径:高度＝5cm:25cm)，其玻璃管中放置新鲜的水稻苗，纱布封口后分别处理1小时和2小时，处理后室温恢复1小时。立即提取总RNA，保存于液氮中或-80℃备用。高温处理温度分别为30℃、32℃、34℃、36℃、38℃和40℃，雌、雄虫分别处理。未胁迫处理的虫源为对照。
五、总RNA的提取和反转录
所有的处理样和未处理样均采用20头虫源提取总RNA，提取方法利用Trizol(Invitrogen，USA)试剂法，1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，微量紫外分光光度计NanoDrop-1000(Thermo，USA)检测质量和浓度，所用样本均用1μg RNA进行反转录，具体参照步骤二进行。
表1 引物序列表
六、实时荧光定量PCR
以步骤五中反转录得到的各胁迫样本和未胁迫样本的cDNA为模板，对各内参基因进行荧光定量PCR扩增。实时荧光定量PCR反应体积及反应程序参照步骤三进行。
七、荧光定量数据geNorm和BestKeeper软件分析
导出各候选内参基因在各处理样本中的荧光定量PCR循环Ct值，按照数据要求分别输入到geNorm和BestKeeper软件。geNorm通过计算某一基因与其他基因间两两比值的对数转换值的平均变异度M作为基因稳定性的评价指标，M值越小，基因表达越稳定；同时该软件给出配对差异分析Vn/n+1值，建议Vn/n+1<0.15为选择阈值，如V2/3<0.15，表明只需选择2个内参基因作标准化指标，这样结果有助于校正系统偏差以得到更可靠的结果；BestKeeper软件也是一款内参基因选择软件，在每个基因之间产生配对的相关系数和BestKeeper指数，根据其值的大小进行稳定性比较。
最终筛选结果:geNorm分析显示雌、雄虫中最稳定的内参基因均是actin1和actin3(图3A和图3B)，同时在雌虫中V2/3<0.15(图3C)，雄虫中所有Vn/n+1＞0.15(图3D)，表明增加内参基因数并不能校正偏差，在雌雄虫中最合适的内参基因数是actin1和actin3；BestKeepe分析显示最合适的内参基因是actin1(表2)。另外,BestKeeper分析结果中actin3为最不稳定的基因之一，同时荧光定量Ct值分析结果表明actin3基因在所有样本中其循环阈值Ct均较大，从最小到最大的为：27.10-329.15，表明actin3基因为低丰度表达基因，并不适合作为内参基因。综合两款软件分析结果，最终筛选出actin1为在高温胁迫和非胁迫条件下褐飞虱雌、雄虫中最合适的内参基因。
八、内参基因的应用
以高温30℃、32℃、34℃、36℃、38℃和40℃分别胁迫1小时的褐飞虱雌、雄虫为样本，未处理样为对照，actin1为内参基因，实时荧光定量PCR检测褐飞虱hsp90基因在各个胁迫处理下的表达情况。荧光定量体系和反应程序参照步骤三，荧光定量内参基因actin1和目的基因hsp90均设3个重复孔，每个处理均为3个生物学重复，相对定量数据处理采用2–ΔΔCt法，ΔΔCt＝ΔCt处理样本-ΔCt对照样本，ΔCt＝ΔCt目的基因-ΔCt内参基因。各处理间差异采用spss软件进行统计分析。结果如图4所示，高温胁迫处理一小时后，在雌、雄虫体内，hsp90基因均随着温度的增高而表达量增加；在雌虫体内从32℃起表达量同对照相比差异均较显著，最高的为38℃，与对照相比上调表达了3.89倍；在雄虫体内各高温胁迫后hsp90基因相对表达量均显著差异与对照，从最低2.26倍-最高6.84倍。
表2 候选内参基因稳定性BesterKeeper分析结果表

Claims (4)

1.一种高温胁迫下褐飞虱内参基因的筛选方法，其特征在于：以25℃饲养的褐飞虱为对照，设置6个高温梯度对褐飞虱成虫进行胁迫处理，处理后立即提取总RNA，反转录合成cDNA，然后以对照和各处理为材料进行实时荧光定量PCR验证，采用geNorm和BestKeeper软件进行数据分析，从而筛选出褐飞虱成虫体内不同高温胁迫和非胁迫下最稳定表达的内参基因；具体包括以下步骤：
<1>采用primer5.0软件设计合成褐飞虱actin1、actin2、actin3、18S、28S和α-2-Tublin候选内参基因及热激蛋白hsp90基因特异性实时荧光定量PCR引物，并利用定量PCR溶解曲线法确定其扩增特异性及按10倍梯度稀释cDNA分别进行定量PCR建立标准曲线，确立每对引物的扩增效率；
<2>分别选取30℃、32℃、34℃、36℃、38℃和40℃高温胁迫1小时和2小时及非胁迫处理的褐飞虱雌、雄成虫为实验材料，提取总RNA，分别反转录合成cDNA进行实时荧光定量PCR分析；
<3>将实时荧光定量PCR实验数据输入到geNorm和BestKeeper软件进行内参基因稳定性分析；
步骤<2>中褐飞虱成虫为羽化后3-7天的雌、雄成虫；
步骤<2>中褐飞虱的饲养条件和胁迫处理方法分别为：
饲养条件：从野外采集活体褐飞虱，在实验室25℃恒温，湿度75±5％，光照:黑暗＝14小时:10小时条件下用新鲜水稻饲养；2-3代后，采用成虫进行高温胁迫处理；
胁迫处理方法：设置温照培养箱温度到处理温度，分别把褐飞虱雌、雄成虫引入至放置新鲜水稻苗的玻璃管中，纱布封口后分别处理1小时和2小时；处理后室温恢复1小时，立即提取总RNA，保存于液氮中或-80℃备用；每个处理均设置3个生物学重复；
步骤<2>中实时荧光定量PCR的条件和程序分别为：
实时荧光定量PCR的条件:PCR所用的cDNA模板是用1μg样品总RNA反转录合成而来，定量PCR反应体积为20μL，包含Premix Ex Taq II 10μL，F/R引物各0.25μM，模板2μL，添加灭菌蒸馏水至20μL；
实时荧光定量PCR的程序:95℃30S，接下来95℃10S，60℃30S共40个循环，循环结束后绘制溶解曲线：55℃-95℃，每0.5℃收集一次荧光信号；每个样本均设置3个定量PCR重复；
所述候选内参基因和热激蛋白hsp90基因的引物分别为以下碱基序列：
actin1：TGTCTCTCACACAGTCCCCATCT/GTCAAGTCACGACCAGCCAAG；
actin2：AGTCGCACCCGAAGAG/AGCCTGGATAGCAACATA；
actin3：TGTGATGGTGGGTATGGG/ATGGCAGGTGAAGCGAAG；
18S：ACCAGGTCCAGACACAATG/CACTCCACCAACTAAGAACG；
28S：ATCAGCGGGGAAAGAAGA/ATCCGAGTAAGTAAGGAAACGA
α-2-Tublin：GGGCTTCCTCATCTTCC/AACGGCTGTTGATACCTG；
hsp90:TGTGAACAACCTGGGAAC/GGACCGTAAACGAACCTC。
2.权利要求1所述筛选方法在利用荧光定量PCR技术研究热胁迫相关基因的表达与功能方面的应用，其特征在于：以高温胁迫后的褐飞虱为样本，以褐飞虱热激蛋白基因hsp90为目的基因，筛选出的基因为内参基因，用来探讨hsp90在褐飞虱热胁迫下的表达规律。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述高温胁迫褐飞虱各胁迫温度是30℃、32℃、34℃、36℃、38℃和40℃，处理时间均为1小时。
4.actin1基因用作高温胁迫下褐飞虱实时荧光定量PCR分析中的内参基因。
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