CN106591316B - 烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因BT-β-TUB及其应用 - Google Patents

烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因BT-β-TUB及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因BT‑β‑TUB及其应用，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所获得的烟粉虱BT‑β‑TUB的178bp的核苷酸序列可作为今后研究烟粉虱的功能基因及在响应温度胁迫基因表达的内参基因。

Description

烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因BT-β-TUB及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因BT-β-TUB及其应用。
背景技术
烟粉虱(Bemisia tabaci(Gennadius))属节肢动物门，昆虫纲，半翅目，粉虱科，小粉虱属，又称棉粉虱或甘薯粉虱，是一类刺吸式口器的小型昆虫。烟粉虱主要通过取食植物汁液、诱发煤污病、传播植物病毒等方式危害蔬菜、花卉、棉花、烟草等农作物，并被IUCN列为全球100种最具威胁的入侵种之一。现已几乎遍及我国所有的省份。
烟粉虱的最适发育温度为26～30℃，发育临界温度在10.8～12.5℃之间，致死高温区在37～42℃之间。17℃和35℃是烟粉虱正常生长发育的最低和最高的温度极限。较强的温度逆境适应能力是烟粉虱在世界范围内广泛分布的原因。随着温室效应的增加，全球气温正逐年增高，烟粉虱较强的温度逆境适应能力使其能逐渐扩大保护地面积，这为其抵御温度逆境、延续种群提供给了场所。
内参基因(Endogenous references gene)即内部参照，在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。然而，随着物种及实验条件的改变，一些内参基因的表达并非总是稳定的。因此内参基因的选择应根据具体实验条件和材料方法而定。
现有的烟粉虱内参基因在不同温度处理条件下表达并不稳定，因此需要筛选出合适的内参基因满足相关实验需求。
发明内容
本发明的目的是提供BT-β-TUB基因片段作为烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因的应用，其中，所述BT-β-TUB基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：
TGTCAGGAGTAACGACGTGTTTGAGGTTCCCTGGTCAGTTGAACGCTGATCTGAGGAAACTTGCCGTGAACATGGTACCCTTCCCCAGGTTGCACTTCTTCATGCCTGGATTCGCTCCTCTCACCTCCCGTGGTAGCCAACAATACAGAGCACTTACCGTTCCCGAA。
根据本发明的具体实施方式，在检测上述BT-β-TUB基因片段是否作为内参基因在响应不同温度胁迫表达时，使用：
BT-β-TUBF1：5′-TTCATGGTTGATAACGAAGC-3′；和
BT-β-TUBR1：5′-GCACCAAGTTAGTCTGGAAT-3′。
根据本发明的具体实施方式，烟粉虱BT-β-TUB基因167bp核苷酸片段的克隆方法，包括以下步骤：
(1)从烟粉虱成虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA：
(2)设计引物：
(3)以cDNA为模板，利用(2)所设引物，PCR扩增烟粉虱β-TUB内参基因的核苷酸序列片段；
(4)纯化步骤(3)所得PCR产物，琼脂凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pEASY-T载体上，然后转化到大肠杆菌感受态细胞Transl-T1，37℃平板培养过夜，蓝白斑筛选含β-TUB片段的阳性克隆子；
(5)将(4)所获得的阳性克隆子进行序列测序，测序所得的序列在NCBI上BLAST分析比较，进而确定所得的核苷酸序列为烟粉虱的β-TUB片段序列。
本发明还提供了烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因BT-β-TUB，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明所获得的烟粉虱BT-β-TUB的167bp的核苷酸序列可作为今后研究烟粉虱的功能基因及在不同发育时期基因表达的内参基因。
本发明选取的BT-β-TUB(β-微管蛋白基因)内参基因，通过相对定量PCR技术检测表明其在0℃(1h,3h,5h)，12℃(1h,3h,5h)，35℃(1h,3h,5h)，40℃(1h,3h,5h)，26℃(1h,3h,5h)；17℃(5d,10d,15d,20d,G1),21℃(5d,10d,15d,20d,G1)，32℃(5d,10d,15d,20d,G1),35℃(5d,10d,15d,20d,G1)，26℃(5d,10d,15d,20d,G1)等不同温度条件下均能稳定表达，为研究烟粉虱功能基因及响应不同温度胁迫表达奠定基础。本发明选取的β-微管蛋白基因在多个物种中的不同温度处理条件下均能稳定表达，以BT-β-TUB为内参基因，通过定量RT-PCR技术检测表明其在各种温度处理条件下的烟粉虱成虫内均能稳定表达，为研究烟粉虱功能基因及温度适应性表达奠定基础
附图说明
图1BT-β-TUB内参基因在烟粉虱不同温度胁迫条件表达状况；
图2BT-β-TUB在烟粉虱不同温度胁迫条件的相对表达量。
具体实施方式
实施例1：烟粉虱内参基因BT-β-TUB在不同发育时期的表达分析
1、不同温度胁迫条件下烟粉虱总RNA提取：
分别取不同温度胁迫条件下烟粉虱的RNA沉淀充分溶解，-80℃保存以备用。
2、烟粉虱cDNA合成；
3、烟粉虱内参基因β-TUB引物合成：
BT-β-TUBF1：5′-TGTCAGGAGTAACGACGTGTTTG-3′；
BT-β-TUBR1：5′-TTCGGGAACGGTAAGTGCTC-3′。
由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
4、相对定量PCR扩增反应：
反应体系为20μL：2×TransStartTM Green qPCR 10μL、ROA 0.4μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.3μL、cDNA模板1.0μL、灭菌ddH2O 8.0μL。
5、相对定量PCR扩增程序：
反应条件为：94℃30s；然后进行40个循环：94℃5s，60℃30s。
6、相对定量PCR结果检测分析：
1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，烟粉虱BT-β-TUB基因在不同温度胁迫条件下表达状况如图1；然后利用Image Lab 3.0和SPSS软件分析表明BT-β-TUB内参基因在不同温度胁迫条件下均能稳定表达，差异不显著(P>0.05)如图2，说明该基因能用于今后研究烟粉虱功能基因及温度胁迫响应基因表达的内参基因。
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因BT-β-TUB及其应用
<160>3
<210> 1
<211> 167
<212> DNA
<213> 烟粉虱
<400> 1
tgtcaggagt aacgacgtgt ttgaggttcc ctggtcagtt gaacgctgat ctgaggaaac 60
ttgccgtgaa catggtaccc ttccccaggt tgcacttctt catgcctgga ttcgctcctc 120
tcacctcccg tggtagccaa caatacagag cacttaccgt tcccgaa 167
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcatggttg ataacgaagc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcaccaagtt agtctggaat 20

Claims (3)

1.BT-β-TUB基因片段作为烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因的应用，其中，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的烟粉虱BT-β-TUB基因片段作为在响应不同温度胁迫表达的内参基因的应用，其特征在于，在检测上述BT-β-TUB基因片段是否作为内参基因稳定表达时，使用引物：
BT-β-TUBF1：5′-TGTCAGGAGTAACGACGTGTTTG-3′；和
BT-β-TUBR1：5′-TTCGGGAACGGTAAGTGCTC-3′。
3.一种烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因BT-β-TUB，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107142314B (zh) * 2017-05-27 2021-01-15 中国农业科学院植物保护研究所 烟粉虱med隐种高温耐受相关基因特异性探针及其应用
CN107287206B (zh) * 2017-08-08 2020-06-16 河南省农业科学院植物保护研究所 一种检测麦红吸浆虫在不同温度胁迫下基因转录表达的内参基因及其应用
CN110734959A (zh) * 2019-07-08 2020-01-31 中国农业科学院植物保护研究所 麦长管蚜不同温度下稳定表达的内参基因的筛选方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104178564A (zh) * 2014-06-11 2014-12-03 广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所 高温胁迫下褐飞虱内参基因的筛选方法及应用
CN104962643A (zh) * 2015-07-17 2015-10-07 中国农业科学院植物保护研究所 白背飞虱不同组织部位稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104178564A (zh) * 2014-06-11 2014-12-03 广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所 高温胁迫下褐飞虱内参基因的筛选方法及应用
CN104962643A (zh) * 2015-07-17 2015-10-07 中国农业科学院植物保护研究所 白背飞虱不同组织部位稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Accession NO：JO657744;Su Y.L. et al.;《EMBL》;20120813;全文 *
Expression Profiling in Bemisia tabaci under Insecticide Treatment: Indicating the Necessity for Custom Reference Gene Selection;Pei Liang et al.;《PLOS ONE》;20140131;第9卷(第1期);e87514 *
Identification and evaluation of suitable reference genes for gene expression studies in the whitefly Bemisia tabaci (Asia I) by reverse transcription quantitative real-time PCR;Carl Collins et al.;《Journal of Insect Science》;20140502;第14卷(第63期);第1页摘要、第4页左栏第1段和第13左栏第3段至14页左栏第3段 *
Identification of reference genes and expression analysis of heat shock protein genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens ( Hemiptera: Delphacidae) after exposure to heat stress;JIANG Jian-Jun et al.;《昆虫学报》;20150531;第58卷(第5期);第479-486页 *
PREDICTED:Bemisia tabaci tubulin beta-1 chain(LOC109034143),mRNA;Accession NO:XM_019047137.1;《GenBank》;20161109;全文 *
内参基因在昆虫实时荧光定量PCR中的研究进展;史彩华等;《应用昆虫学报》;20160331;第53卷(第2期);第237页摘要、第238页表1、第239页右栏第1段、第241页第2段至第242页第5段 *
基于RNA干扰的灰飞虱干扰致死基因及抗水稻条纹病毒基因的筛选与验证;陈爱玲;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20140415(第4期);D046-47 *

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