CN113403312B - 家蚕微孢子虫milRNAs及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了家蚕微孢子虫milRNAs及其应用，研究发现milRNA‑4、milRNA‑8、milRNA‑10和milRNA‑12对微孢子虫的增殖有促进作用，milRNA‑1、milRNA‑3和milRNA‑11对微孢子虫的增殖有抑制作用，其中milRNA‑8对微孢子虫的增殖促进作用最明显，因此可以用于调控微孢子虫的增殖。研究还发现milRNAs作用靶基因为BmPEX16，过表达家蚕微孢子虫拷贝数和NbPTP2的蛋白表达量均下调，表明在过表达BmPEX16后，抑制了家蚕微孢子虫的增殖；敲除BmPEX16后，促进了家蚕微孢子虫的增殖，因此可以通过调控BmPEX16基因的表达调控家蚕微孢子虫的增殖，为解析家蚕微孢子虫的防控提供了新的思路。

Description

家蚕微孢子虫milRNAs及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及家蚕微孢子虫milRNAs，还涉及milRNAs的应用。

背景技术

miRNA是非编码RNA中研究最为清楚的一类内源性非编码的小RNA，长度大约为22nt，在进化上高度保守。到目前为止，已经有大约3万个miRNAs在动、植物和病毒中被发现。miRNA通过其作用机制能有效的对靶基因进行调控，它是细胞生长、分化以及凋亡等众多生命活动的关键调节剂，且与各种疾病的致病机理有密切关联。但是，仍有许多重要的miRNAs还处于未知，迫切需要对miRNA的表达特征和机制进行深入研究，随着对miRNA的研究，不但有助于对细胞繁殖、分化、凋亡以及代谢等生命过程进行全面的了解，尤其在某些难以攻克的疾病方面也具有重要的意义。

随着科学家们对动植物中miRNA机制的深入研究，2010年，Lee等首次在粗糙脉孢菌中鉴别出一种与动植miRNA共同特征类似的小RNA(microRNA-like，milRNA)。milRNA作为一类非编码单链RNA，其长度约19-25个碱基，主要参与真菌的应激反应、形态调控以及多种生理过程，其不仅可以诱导寄主的某些基因沉默，还可抑制寄主的免疫反应。据目前研究表明，milRNAs在真菌的生长、发育乃至生殖和毒力调控等方面都具有重要的意义。

微孢子虫是一类典型的专性细胞内寄生的真菌类病原微生物。由于其独特的侵染方式，微孢子虫被认为是自然界最成功的寄生虫。微孢子虫的寄主范围非常广泛，它不仅是经济类昆虫(家蚕、蜜蜂)和鱼类等的常见病原，而且还可感染免疫缺陷类的人类。最初，对微孢子虫的调控研究主要集中在蛋白水平上。近些年，随着对微孢子虫基因学和转录组学的深入研究，对微孢子虫的研究也逐渐拓展到核酸层面。但是目前，对家蚕微孢子虫milRNAs的研究还相对薄弱。已有大量的非编码RNA在人、小鼠和果蝇等模式生物中被鉴定出来，但真菌非编码RNA研究相对较为滞后。现发现东方蜜蜂微孢子虫可通过调节milRNA的表达水平对细胞凋亡抑制因子、极管蛋白和孢壁蛋白等毒力因子和己糖激酶、ABC转运蛋白和ATP/ADP移位酶等侵染因子进行调控，维持相关毒力因子的高表达，从而适应宿主细胞并促进自身增殖与侵染，也可通过lncRNA顺式调控上下游基因的表达或作为ceRNA吸附milRNA影响靶基因的表达，从而参与调控微孢子虫的物质和能量代谢。此外，研究表明，微孢子虫非编码RNA可能参与宿主细胞的增殖、凋亡和免疫过程，在病原与宿主的互作过程中发挥着重要作用，但是对微孢子虫的非编码RNA的调控机制还尚不清楚。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种家蚕微孢子虫milRNAs；本发明的目的之二在于提供所述家蚕微孢子虫milRNAs的抑制剂在制备抑制微孢子虫增殖中的应用；本发明的目的之三在于提供过表达所述家蚕微孢子虫milRNAs的试剂在抑制靶基因BmPEX16表达中的应用；本发明的目的之四在于提供过表达BmPEX16靶基因的试剂在制备抑制微孢子虫增殖的药物中的应用；本发明的目的之五在于提供抑制或敲除BmPEX16靶基因的试剂在制备促进微孢子虫增殖的药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、家蚕微孢子虫milRNAs，所述milRNAs的前体序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.22所示中的任一条。

优选的，所述milRNAs的成熟体序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.13、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19和SEQ ID NO.21所示的任一条。

2、所述家蚕微孢子虫milRNAs的抑制剂在制备抑制微孢子虫增殖中的应用；所述milRNAs的前体序列如SEQ ID No.8、SEQ ID No.14、SEQ ID No.18或SEQ ID No.22所示。

优选的，所述milRNAs的抑制剂通过调控BmPEX16靶基因制微孢子虫增殖，所述BmPEX16靶基因的序列如SEQ ID No.23所示。

优选的，所述抑制剂为milRNA-8inhibitor。

3、过表达所述家蚕微孢子虫milRNAs的试剂在抑制靶基因BmPEX16表达中的应用。

4、过表达BmPEX16靶基因的试剂在制备抑制微孢子虫增殖的药物中的应用。

优选的，所述过表达BmPEX16靶基因的试剂为过表达BmPEX16靶基因的表达载体。

5、抑制或敲除BmPEX16靶基因的试剂在制备促进微孢子虫增殖的药物中的应用。

优选的，所述抑制或敲除BmPEX16靶基因的试剂为敲除载体ssgRNA，所述ssgRNA的敲除序列为SEQ ID No.54和SEQ ID No.55互补配对序列。

本发明的有益效果在于：本发明提供了家蚕微孢子虫milRNAs，经研究发现milRNA-4、milRNA-8、milRNA-10和milRNA-12对微孢子虫的增殖有促进作用，milRNA-1、milRNA-3和milRNA-11对微孢子虫的增殖有抑制作用，其中milRNA-8对微孢子虫的增殖促进作用最明显，因此可以将家蚕微孢子虫milRNAs用于调控微孢子虫的增殖。并且研究还发现milRNAs作用靶基因为BmPEX16，过表达家蚕微孢子虫拷贝数和NbPTP2的蛋白表达量均下调，表明在过表达BmPEX16后，抑制了家蚕微孢子虫的增殖；敲除BmPEX16后，促进了家蚕微孢子虫的增殖，因此可以通过调控BmPEX16基因的表达调控家蚕微孢子虫的增殖，为解析家蚕微孢子虫的侵染机制和病害防控提供参考。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为免疫荧光和qPCR对家蚕微孢子虫增殖特征分析(A：免疫荧光对家蚕微孢子虫增殖特征分析；B：qPCR对家蚕微孢子虫增殖特征分析)。

图2为家蚕微孢子虫milRNA的二级结构预测。

图3为家蚕微孢子虫milRNAs表达量分析。

图4为puro-OpIE2^prm-mCherry-U6-milRNA过表达载体的构建(A：puro-OpIE2prm-mCherry-U6-milRNA构建示意图；B：puro-OpIE2prm-mCherry-U6-milRNA测序结果)。

图5为milRNAs过表达载体对家蚕微孢子虫增殖的影响。

图6为milRNA-8荧光原位杂交检测。

图7为milRNA-8inhibitor对家蚕微孢子虫增殖的影响。

图8为milRNA-8靶基因的筛选。

图9为milRNA-8对BmPEX16结合作用分(A：RNA 22预测；B：RNAhybrid预测；C：荧光素酶活性检测析)。

图10为过表达和干涉milRNA-8对BmPEX16表达量的变化分析(A：过表达milRNA-8对BmPEX16的变化分析；B：milRNA-8inhibitor对BmPEX16表达量变化分析)。

图11为过表达BmPEX16对家蚕微孢子虫增殖的影响(A：BmPEX16过表达载体的构建示意图；B：qRT-PCR检测过表达后BmPEX16的表达量)。

图12为Cas13a敲除BmPEX16后对微粒子增殖的影响(A：BmPEX16的敲除载体构建；B：Cas13a敲除BmPEX16后对其表达量的检测；C：Cas13a敲除BmPEX16后对微粒子增殖的影响；D：Cas13a敲除BmPEX16后NbPTP2蛋白表达量的变化)。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。特别需要指出的是，本发明说明书所举实施例只是为了帮助理解本发明，他们不具任何限制作用，即本发明除说明书所举实例外，还可以有其他实施方式。因此，凡是采用等同替换或等效变换形式形成的任何技术方案，均在本发明的保护范围中。

实施例1、家蚕微孢子虫milRNAs的预测和分析

通过免疫荧光及qPCR实验对家蚕微孢子虫的增殖特征进行分析，通过免疫荧光对家蚕微孢子虫的生活史观察发现，在家蚕微孢子虫侵染24h时，少部分孢子已通过弹出极丝将孢原质注入到宿主细胞质内，在宿主细胞内可发现少量的孢原质；在感染48h时，孢子的孢原质变大，通过二分裂或多分裂发育为裂殖体，可在宿主细胞内发现孢原质聚集性扩增的现象；侵染72h后，由裂殖体合二为一形成的母孢子又以二分裂的方式形成孢子母细胞，此时，也可在宿主细胞内观察到孢原质；到侵染96h时，家蚕微孢子虫已完成一个生活周期的扩增，开始进入第二个增殖周期，此时可观察到在宿主细胞内存在大量孢原质。对家蚕微孢子虫NbSsuRNA设计了特异的定量引物，NbssuRNA-F:5’-gtccctgttctttgtac-3’(SEQ IDNo.23)；Nbssu RNA-R:5’-atcctgctaatggttct-3’(SEQ ID No.24)。qPCR的结果也表明，孢子在裂殖增殖期48h时，孢子大量扩增，结果如图1所示。综上所述，家蚕微孢子虫侵染宿主48h裂殖增殖期时，尚未形成完整孢壁，是微孢子虫milRNAs最丰富的时期。因此，选择此时期对家蚕微孢子虫进行高通量测序。

为预测家蚕微孢子虫milRNAs，将家蚕微孢子虫感染组(Nb)及未感染组(Control)的两份细胞样品进行Illumina-Solexa高通量深度测序。

为了分析两组样品中sRNAs在基因组上的分布，将两组长度筛选过后的sRNAs与微孢子虫基因组进行比对。结果表明，Nb组与Control组中匹配到基因组上的sRNAs序列读数分别为435,586和84,423。但是，由于目前对真菌miRNA的研究相对较少，且数据库中未发现家蚕微孢子虫miRNA的相关数据，因此通过探寻miRNA的二级结构以及能量等特征，对家蚕微孢子虫潜在的milRNAs进行预测，共预测到11个新的家蚕微孢子虫milRNAs，结果如图2所示。具体序列如下：

milRNA-1：

mature milRNA：uaagacguccggugcauucg(SEQ ID No.1)；

precursor milRNA：uaagacguccggugcauucguuguugcgaugcaccgguguucgaau(SEQID No.2)；

milRNA-2：

mature milRNA：uauuauuguaguuagaagacgagcc(SEQ ID No.3)；

precursor milRNA：uauuguauucguucucacgagguauuuagugucgcccuaaauauuauuguaguuagaagacgagcc(SEQ ID No.4)；

milRNA-3：

mature milRNA：uaaagauuuucauagagcgguuga(SEQ ID No.5)；

precursor milRNA：ucuacgcuuuuucgaaaucuuugauguuuuuaauccgggguuaaagauuuucauagagcgguuga(SEQ ID No.6)；

milRNA-4：

mature milRNA：uuuagcgucguaaagugcuggacga(SEQ ID No.7)；

precursor milRNA：ucugugcuuucggacgugagagggagaauuauccucugcuacaguuuagcgucguaaagugcuggacga(SEQ ID No.8)；

milRNA-5：

mature milRNA：ucggcguugugguuuacguucaca(SEQ ID No.9)；

precursor milRNA：uugacgucagccacaaugucgacucgagagucauucaauauuuuguuuccauccuugucaaccaucggcguugugguuguucaca(SEQ ID No.10)；

milRNA-6：

mature milRNA：uauuuagaucaaagguuugaagcuu(SEQ ID No.11)；

precursor milRNA：uucuuguugcaagccggaugcuccaauugucauuaaauccaaauauauuuagaucaaagguuugaagcuu(SEQ ID No.12)；

milRNA-8：

mature milRNA：uacauguauugcaaucguaggaca(SEQ ID No.13)；

precursor milRNA：acauguauugcaaucguaggacagguguuaaugugcaaaauucauacuacuaguuuuacgaacucaaaacaaaguggc(SEQ ID No.14)；

milRNA-9：

mature milRNA：uuccgaaaucgucugcuuguagauu(SEQ ID No.15)；

precursor milRNA：uuuacaagcggauaaugggaaggaauuccgaaaucgucugcuuguagauu(SEQ ID No.16)；

milRNA-10：

mature milRNA：ugacaugcuguuaaaccugacauc(SEQ ID No.17)；

precursor milRNA：ugccggaauuacagcaguaucuuuuugcgguacacuaguugguaccacauuugacaugcuguuaaaccugacauc(SEQ ID No.18)；

milRNA-11：

mature milRNA：uuuccgauauuuugggcguaaacc(SEQ ID No.19)；

precursor milRNA：uuuccgauauuuugggcguaaaccguaguauuaugagggacaaaaaauuguaacuaugauuuacuuaaagauguucaaaaauuggaucuu(SEQ ID No.20)；

milRNA-12：

mature milRNA：ucuuugcuguaauguuucuggcaa(SEQ ID No.21)；

precursor milRNA：gccagaaacgagcacaaggauuuaagauuccuaaggaacgucuuacaguacaucuuugcuguaauguuucuggcaa(SEQ ID No.22)

为对高通量测序预测到的milRNAs进行鉴定，分别提取了感染家蚕微孢子虫48h细胞样品及未感染家蚕微孢子虫细胞样品的总miRNA，通过stem-loop RT-qPCR对预测到的家蚕微孢子虫milRNAs的表达情况进行检测，并采用2^－△△CT法对表达量的相对变化进行数据分析。分别对11个milRNAs设计特异的定量引物。

通用R：5’-ctcaactggtgtcgtgga-3’(SEQ ID No.25)；

milRNA-1-F：5’-acactccagctgggtaagacgtccgg-3’(SEQ ID No.26)；

milRNA-2-F：5’-acactccagctgggtattattgtagttagaa-3’(SEQ ID No.27)；

milRNA-3-F：5’-acactccagctgggtaaagattttcataga-3’(SEQ ID No.28)；

milRNA-4-F：5’-acactccagctgggtttagcgtcgtaaagtg-3’(SEQ ID No.29)；

milRNA-5-F：5’-acactccagctgggtcggcgttgtggttta-3’(SEQ ID No.30)；

milRNA-6-F：5’-acactccagctgggtatttagatcaaaggtt-3’(SEQ ID No.31)；

milRNA-8-F：5’-acactccagctgggtacatgtattgcaatc-3’(SEQ ID No.32)；

milRNA-9-F：5’-acactccagctgggttccgaaatcgtctgct-3’(SEQ ID No.33)；

milRNA-10-F：5’-acactccagctgggtgacatgctgttaaa-3’(SEQ ID No.34)；

milRNA-11-F：5’-acactccagctgggtttccgatattttggg-3’(SEQ ID No.35)；

milRNA-12-F：5’-acactccagctgggtctttgctgtaatgtt-3’(SEQ ID No.36)。

结果表明，与高通量测序预测到的milRNAs表达量相比，在stem-loop qRT-PCR实验验证的11个milRNAs的表达水平中，有10个milRNAs的表达量与其表达趋势一致，且均只在家蚕微孢子虫感染后的宿主细胞内特异性高表达，结果如图3所示。

实施例2、家蚕微孢子虫milRNA-8的鉴定和功能分析

为探究milRNAs对家蚕微孢子虫增殖的影响，本实施例将含有10个milRNAs的目的条带分别插入到puro-OpIE2^prm-mCherry-PA载体中，通过使用限制性内切酶Asc1得到该重组质粒puro-OpIE2^prm-mCherry-U6-milRNA(图4)，经进一步测序结果显示成功构建7个过表达载体，并通过荧光显微镜观察发现均可正常表达，结果如图4所示。

7个过表达载体构建成功后，将其在细胞水平上对BmE-SWU1细胞进行转染，过表达载体稳定表达48h后，再添加家蚕微孢子虫，待家蚕微孢子虫感染宿主细胞48h时，此时家蚕微孢子虫处于裂殖增殖期，将此时的细胞样品提取基因组，进行qPCR检测。结果表明，7个过表达载体中，milRNA-4、milRNA-8、milRNA-10和milRNA-12对微孢子虫的增殖有促进作用，milRNA-1、milRNA-3和milRNA-11对微孢子虫的增殖有抑制作用，其中milRNA-8对微孢子虫的增殖促进作用最明显。由此，推测milRNA-8可能对家蚕微孢子虫本身的增殖发挥着重要作用，故选择milRNA-8作为后续深入研究的对象，结果如图5所示。

为了对milRNA-8的表达特征进行分析，利用stem-loop RT-qPCR对milRNA-8的时序表达谱进行分析，发现milRNA-8在感染家蚕微孢子虫24h后，表达水平呈上升趋势；与qRT-PCR相比，荧光原位杂交技术能够更直观的展现milRNA的表达水平，根据milRNA-8的核酸序列设计了特异的荧光探针，对家蚕微孢子虫感染48h处于裂殖增殖期的细胞样品进行了milRNA的FISH实验检测。实验结果表明，milRNA-8在家蚕微孢子虫孢原质及宿主的细胞质中均存在表达，结果如图6所示。

为了进一步探究家蚕微孢子虫milRNA-8对家蚕微孢子虫增殖的影响，人工设计了家蚕微孢子虫milRNA-8inhibitor，在细胞水平转染24h后，添加家蚕微孢子虫，待宿主细胞感染家蚕微孢子虫48h时，提取细胞样品的基因组，利用qPCR对家蚕微孢子虫的增殖情况进行探究。实验结果表明，milRNA-8inhibitor对微孢子虫的增殖有抑制作用，结果如图7所示。

实施例3、家蚕微孢子虫milRNA-8靶基因的筛选与鉴定

为了鉴定家蚕微孢子虫milRNA-8的靶基因，本文使用靶基因预测软件miRanda来进行初步预测，将其miRanda阈值设为score≥140。结果显示，milRNA-8在宿主内共预测到569个候选靶基因，选取其中在Control组和Nb组表达量的差异倍数≥2的64个候选靶基因，并对这些基因进行KEGG功能富集分析，发现有8个候选靶基因被富集到新陈代谢类、神经活性受体--配体类通路和过氧化物酶体通路中。对8个候选靶基因设计了相应的定量引物，序列分别为：BGIBMGA002029-F：5’-aagtatactgaaggccgagatg-3’(SEQ ID No.37)；

BGIBMGA002029-R：5’-tccatcaacacgtctcataaca(SEQ ID No.38)；

BGIBMGA009927-F：5’-ctctgcgaagagttcaacaatc(SEQ ID No.39)；

BGIBMGA009927-R：5’-gaacgaactcaggacaggaa(SEQ ID No.40)；

BGIBMGA010023-F：5’-ccaacttccatatcctgtctgt(SEQ ID No.41)；

BGIBMGA010023-R：5’-tcatttcgtatgtcagaaccga(SEQ ID No.42)；

BGIBMGA001569-F：5’-aatggagcaagaggaagaagaa(SEQ ID No.43)；

BGIBMGA001569-R：5’-tcatccaaaggccatgtatctt(SEQ ID No.44)；

BGIBMGA001570-F：5’-cgttagaggtgaggatgtctac(SEQ ID No.45)；

BGIBMGA001570-R：5’-tttcttgtcctgtctcgagtac(SEQ ID No.46)；

BGIBMGA000724-F：5’-gttacggaaattgtttggagct(SEQ ID No.47)；

BGIBMGA000724-R：5’-gttaaccaatcttttgccacct(SEQ ID No.48)；

BGIBMGA000938-F：agaggcgagttgtgtttataca(SEQ ID No.49)；

BGIBMGA000938-R：cttctgcaggaagtacttctga(SEQ ID No.50)；

BGIBMGA012192-F：attcgtgagacaaaagaaaccg(SEQ ID No.51)；

BGIBMGA012192-R：acctttaacatttcctggtcct(SEQ ID No.52)。

此外，为了分析8个候选靶基因的表达水平，在细胞水平过表达milRNA-8，发现BmPEX16(登陆号：BGIBMGA002029)的表达水平显著下降。基于候选靶基因的功能和表达水平，选择了其中涉及过氧化物酶体生物形成的基因BmPEX16(SEQ ID No.53)作为研究对象，进行后续研究，结果如图8所示。

为了探究milRNA-8与BmPEX16的结合作用，除miRanda靶基因预测之外，又选择了多个靶基因预测软件来进行分析。结果表明，milRNA-8可与BmPEX16 3’UTR区进行碱基互补配对结合。为进一步验证milRNA-8对BmPEX16的结合作用，在细胞水平添加家蚕微孢子虫48h后，分别将milRNA-8的过表达载体、milRNA-8inhibitor(atgtacataacgttagcatcctgt)和pGL3.0-IE1-luc-PEX16进行转染，继续培养48h后，对细胞样品进行双荧光素酶报告基因检测(Dong,ZQ.,Hu,ZG.,Li,HQ.et al.Construction and characterization of asynthetic Baculovirus-inducible 39K promoter.J Biol Eng 12,30(2018).https://doi.org/10.1186/s13036-018-0121-8)。结果显示，与对照组相比，在过表达milRNA-8后，BmPEX16受到milRNA-8的调控，此时双荧光素酶活性降低；在添加milRNA-8inhibitor后，BmPEX16几乎不受milRNA-8的抑制，此时双荧光素酶的活性升高，表明BmPEX16确为milRNA-8的靶基因，受到milRNA-8的调控，结果如图9所示。

上述结果表明过表达milRNA-8后，靶基因BmPEX16的表达水平显著被抑制。为进一步探究milRNA-8对BmPEX16的调控作用，在微孢子虫感染宿主48h时，在细胞水平转染人工合成的milRNA-8inhibitor，48h后收取细胞样品。提取细胞样品的总RNA，反转录为cDNA后，利用qRT-PCR检测BmPEX16的表达水平，发现靶基因的表达水平上调，结果如图10所示。综上所述，说明靶基因BmPEX16受到milRNA-8的调控。

实施例4、BmPEX16对家蚕微孢子虫增殖的影响

为了分析BmPEX16对微孢子虫增殖的影响，构建了BmPEX16的过表达载体pIZ-OpIE2-BmPEX16-pA(Dong,ZQ.,Hu,ZG.,Li,HQ.et al.Construction andcharacterization of a synthetic Baculovirus-inducible 39K promoter.J Biol Eng12,30(2018).https://doi.org/10.1186/s13036-018-0121-8)。在细胞水平上将过表达载体转染，48h后收取细胞样品。提取细胞样品的总RNA，反转录为cDNA后，利用BmPEX16特异的定量引物检测其表达水平，发现与对照组相比，BmPEX16表达量升高。在BmPEX16过表达载体构建成功后，在细胞水平上将过表达载体转染48h，添加家蚕微孢子虫，继续培养48h后收取细胞样品。分别提取细胞样品的基因组与蛋白样品，利用qPCR和Western blotting检测微孢子虫拷贝数和家蚕微孢子虫极管蛋白(NbPTP2)的变化，结果如图11所示。结果表明，过表达靶基因BmPEX16后，家蚕微孢子虫拷贝数和NbPTP2的蛋白表达量均下调，表明在过表达BmPEX16后，抑制了家蚕微孢子虫的增殖。

在验证敲除载体Cas13a对外源基因egfp有敲除效果的基础上，依据Cas13a的编辑特点，对靶基因BmPEX16设计相应的敲除载体ssgRNA。ssgRNA的敲除序列为：ssgRNA-F：5’-aaac cgcagtgtacacttcttgcaacgacaat-3’(SEQ ID No.54)，ssgRNA-R：5’-aaaaattgtcgttgcaagaagtgtacactgcg-3’(SEQ ID No.55)。在细胞水平，将ssgRNA与pSL1180-IE1-Cas13a-SV40(Dong ZQ,Chen TT,Zhang J,et al.Establishment of a highlyefficient virus-inducible CRIS PR/Cas9 system in insect cells,AntiviralResearch,Volume 130,50-57,(2016).https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2016.03.009)共转染，提取相应的细胞总RNA，反转录为cDNA后，利用BmPEX16特异的定量引物检测，发现CRISPR/Cas13a可使BmPEX16表达量降低。为进一步确认敲除BmPEX16对微孢子虫增殖的影响，将Cas13a与ssgRNA共转48h后，添加微孢子虫，再次培养48h后收取细胞样品，分别利用qPCR和Western blotting检测微孢子虫拷贝数和家蚕微孢子虫NbPTP2的变化。结果表明，在Cas13a对靶基因BmPEX16敲除的基础上，家蚕微孢子虫拷贝数和NbPTP2的蛋白表达量均上调，表明在敲除BmPEX16后，促进了家蚕微孢子虫的增殖，结果如图12所示。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 家蚕微孢子虫milRNAs及其应用

<160> 55

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 1

uaagacgucc ggugcauucg 20

<210> 2

<211> 46

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 2

uaagacgucc ggugcauucg uuguugcgau gcaccggugu ucgaau 46

<210> 3

<211> 25

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 3

uauuauugua guuagaagac gagcc 25

<210> 4

<211> 66

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 4

uauuguauuc guucucacga gguauuuagu gucgcccuaa auauuauugu aguuagaaga 60

cgagcc 66

<210> 5

<211> 24

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 5

uaaagauuuu cauagagcgg uuga 24

<210> 6

<211> 65

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 6

ucuacgcuuu uucgaaaucu uugauguuuu uaauccgggg uuaaagauuu ucauagagcg 60

guuga 65

<210> 7

<211> 25

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 7

uuuagcgucg uaaagugcug gacga 25

<210> 8

<211> 69

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 8

ucugugcuuu cggacgugag agggagaauu auccucugcu acaguuuagc gucguaaagu 60

gcuggacga 69

<210> 9

<211> 24

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 9

ucggcguugu gguuuacguu caca 24

<210> 10

<211> 85

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 10

uugacgucag ccacaauguc gacucgagag ucauucaaua uuuuguuucc auccuuguca 60

accaucggcg uugugguugu ucaca 85

<210> 11

<211> 25

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 11

uauuuagauc aaagguuuga agcuu 25

<210> 12

<211> 70

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 12

uucuuguugc aagccggaug cuccaauugu cauuaaaucc aaauauauuu agaucaaagg 60

uuugaagcuu 70

<210> 13

<211> 24

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 13

uacauguauu gcaaucguag gaca 24

<210> 14

<211> 78

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 14

acauguauug caaucguagg acagguguua augugcaaaa uucauacuac uaguuuuacg 60

aacucaaaac aaaguggc 78

<210> 15

<211> 25

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 15

uuccgaaauc gucugcuugu agauu 25

<210> 16

<211> 50

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 16

uuuacaagcg gauaauggga aggaauuccg aaaucgucug cuuguagauu 50

<210> 17

<211> 24

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 17

ugacaugcug uuaaaccuga cauc 24

<210> 18

<211> 75

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 18

ugccggaauu acagcaguau cuuuuugcgg uacacuaguu gguaccacau uugacaugcu 60

guuaaaccug acauc 75

<210> 19

<211> 24

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 19

uuuccgauau uuugggcgua aacc 24

<210> 20

<211> 90

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 20

uuuccgauau uuugggcgua aaccguagua uuaugaggga caaaaaauug uaacuaugau 60

uuacuuaaag auguucaaaa auuggaucuu 90

<210> 21

<211> 24

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 21

ucuuugcugu aauguuucug gcaa 24

<210> 22

<211> 76

<212> RNA

<213> 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)

<400> 22

gccagaaacg agcacaagga uuuaagauuc cuaaggaacg ucuuacagua caucuuugcu 60

guaauguuuc uggcaa 76

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtccctgttc tttgtac 17

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atcctgctaa tggttct 17

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ctcaactggt gtcgtgga 18

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

acactccagc tgggtaagac gtccgg 26

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

acactccagc tgggtattat tgtagttaga a 31

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

acactccagc tgggtaaaga ttttcataga 30

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

acactccagc tgggtttagc gtcgtaaagt g 31

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

acactccagc tgggtcggcg ttgtggttta 30

<210> 31

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

acactccagc tgggtattta gatcaaaggt t 31

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

acactccagc tgggtacatg tattgcaatc 30

<210> 33

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

acactccagc tgggttccga aatcgtctgc t 31

<210> 34

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

acactccagc tgggtgacat gctgttaaa 29

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

acactccagc tgggtttccg atattttggg 30

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

acactccagc tgggtctttg ctgtaatgtt 30

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

aagtatactg aaggccgaga tg 22

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tccatcaaca cgtctcataa ca 22

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ctctgcgaag agttcaacaa tc 22

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gaacgaactc aggacaggaa 20

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ccaacttcca tatcctgtct gt 22

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tcatttcgta tgtcagaacc ga 22

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

aatggagcaa gaggaagaag aa 22

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tcatccaaag gccatgtatc tt 22

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

cgttagaggt gaggatgtct ac 22

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tttcttgtcc tgtctcgagt ac 22

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

gttacggaaa ttgtttggag ct 22

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gttaaccaat cttttgccac ct 22

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

agaggcgagt tgtgtttata ca 22

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

cttctgcagg aagtacttct ga 22

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

attcgtgaga caaaagaaac cg 22

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

acctttaaca tttcctggtc ct 22

<210> 53

<211> 813

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori L.)

<400> 53

atgagtagca aattgtcgtt gcaagaagtg tacactgcgt acaagcgatg ggtgatcagc 60

aatccgagcg tggtgacaga cgtcgagacc gttgctacat ggacgtcgta tttcgtggcc 120

gaactcattg ccaaagacag atggggacaa cgaggcaagt ggaccgttgc aactttattg 180

cagctcttca aagcatcgtc cggattaatt cttctgtatc gattcaaaga acttcccata 240

tcacaccccc ctgttgcttt cttacaaaga aagaagtata ctgaaggccg agatgttgaa 300

gagcatgaga attcattttt taagcttcgc aggtctggcc gtgttatgag acgtgttgat 360

ggagcacctc caattgcttt tcgagattgg acgccagtga aaataaaaga tgatagacct 420

gtgcctggca ttgaggttaa ggacttattg tatgctgagt cattacatgt tttgaagcca 480

ttacttcatc ttgctgcaat gaggttcttt ggaaataaag cctggaagca gtggtttgtg 540

gctctcagta ttgatattgc cagtctcaaa gtatacaata ggtatatgaa agagttatca 600

tatgaacaaa ggctggaaat aagtcgaaga aaattaggct tagtcctata tttattacgc 660

agtcctatgt acaataaata ttctaacact gtaatagaaa atgttcttaa ttctgcttca 720

aagaaaatac ctatgatgtc attgatctgt ggcccaataa tccaatactt aaatcactgg 780

caagacattt acttctatat gtgggcatca taa 813

<210> 54

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

aaaccgcagt gtacacttct tgcaacgaca at 32

<210> 55

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

aaaaattgtc gttgcaagaa gtgtacactg cg 32

Claims (7)

1.家蚕微孢子虫milRNAs，其特征在于：所述milRNAs的前体序列为SEQ ID NO.2、SEQID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.22所示中的任一条。

2.根据权利要求1所述家蚕微孢子虫milRNAs，其特征在于：所述milRNAs的成熟体序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.13、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19和SEQ ID NO.21所示的任一条。

3.权利要求1或2所述家蚕微孢子虫milRNAs的抑制剂在抑制家蚕微孢子虫增殖中的应用；其特征在于：所述milRNAs的抑制剂为milRNA-8inhibitor，所述milRNA-8inhibitor的核苷酸序列为atgtacataacgttagcatcctgt。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述milRNAs的抑制剂通过调控BmPEX16靶基因来抑制家蚕微孢子虫增殖，所述BmPEX16靶基因的序列如SEQ ID No.53所示；所述milRNAs为milRNA-8，所述milRNA-8的前体序列如SEQ ID No.14所示。

5.权利要求1或2所述家蚕微孢子虫milRNAs在抑制靶基因BmPEX16表达中的应用，所述milRNAs为milRNA-8，所述milRNA-8的前体序列如SEQ ID No.14所示；所述BmPEX16靶基因的序列如SEQ ID No.53所示。

6.过表达BmPEX16靶基因的试剂在制备抑制家蚕微孢子虫增殖的药物中的应用，所述BmPEX16靶基因的序列如SEQ ID No.53所示，所述过表达BmPEX16靶基因的试剂为过表达BmPEX16靶基因的表达载体。

7.抑制或敲除BmPEX16靶基因的试剂在制备促进家蚕微孢子虫增殖的药物中的应用，其特征在于：所述抑制或敲除BmPEX16靶基因的试剂为敲除载体ssgRNA，所述ssgRNA的敲除序列为SEQ ID No.54和SEQ ID No.55互补配对序列，所述BmPEX16靶基因的序列如SEQ IDNo.53所示。

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