CN104168898A - 以pak1抑制剂治疗黑色素瘤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用PAK1抑制剂治疗黑色素瘤的方法及组合物。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是过表达的和/或扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。

Description

以PAK1抑制剂治疗黑色素瘤的方法

背景技术

近80％的皮肤癌死亡病例是由恶性黑色素瘤引起的。虽然在早期发现黑色素瘤是外科手术可治愈的，但是这种疾病的局部和全身扩散相当程度地恶化了预后，仅14％的转移性黑色素瘤患者存活了五年(American CancerSociety.Cancer facts&figures,2011)。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路最近被鉴定为某些黑色素瘤亚型的重要生长通路(Lopez-Bergami P.Pigment CellMelanoma Res.2011,24(5):902-921)。例如，从4493例患者的数据汇总分析，在皮肤性黑色素瘤中BRAF(v-Raf小鼠肉瘤病毒致癌基因同源蛋白B1)突变的发生率是41％(Lee JH等人，Br J Dermatol.2011,164(4):776-784)。恶性黑色素瘤中最常见的BRAF体细胞突变是在残基600的缬氨酸取代以赋予组成性催化活性和信号传导(Davies H等人，Nature.2002；417(6892),949-954)。遗传学研究已经证实，在临床前模型系统中BRAF是引发和维持黑色素瘤所必需的(Davies H等人，2002,ibid；Hoeflich KP等人，Cancer Res.2006,66(2):999-1006；Dankort D等人，Genes Dev.2007,21(4):379-3844-6)。这些发现促使药物发现活跃以开发BRAF的小分子抑制剂，包括GDC-0879、PLX-4720、PLX-4032/威罗菲尼(vemurafenib)(Zelboraf^TM)和GSK2118436(Hoeflich KP等人，Cancer Res.2009,69(7):3042-3051；Tsai J等人，Proc Natl Acad SciU.S.A.2008,105(8):3041-3046；Bollag G等人，Nature 2011,467(7315):596-599；Ribas A,&Flaherty KT.,Nature Rev.2011,8(7):426-433)。这些抑制剂选择性地降低BRAF致癌基因诱发的肿瘤细胞的生长并为患有具有BRAF致癌基因的活化突变的黑色素瘤亚型的患者提供了希望(Ribas A,&FlahertyKT.,2011,同上)。但是，观察到现有的BRAF小分子抑制剂对于野生型BRAF黑色素瘤细胞具有显著较弱的抗肿瘤疗效(Hoeflich KP等人，2009,同上:3042-3051；Tsai J等人，同上)，因此导致需要确定其他的黑色素瘤相关的驱动基因以为所有类型的黑色素瘤患者的疾病管理的生物学、致癌信号传导和可能的治疗靶点提供新的见解。

RAF激酶家族由三个成员ARAF、BRAF和CRAF组成，其在从RAS到下游激酶MEK1/2和ERK1/2的典型MAPK信号传导通路的信号传导中发挥关键作用。然而，已经报道其他的激酶也在ERK活化中发挥作用。特别是，几个小组已经报道，组-I p21-活化激酶(PAK)通过磷酸化CRAF的Ser338(活化的关键残基)和MEK1的Ser298(即接近作为RAF激酶底物的活化环残基Ser217/Ser221的位点)而活化MAPK途径(King AJ等人，Nature.1998；396(6707),180-183；Tang Y等人，Mol Cell Biol.1999,19(3):1881-1891；FrostJA等人，EMBO J.1997,16(21):6426-6438)。可以通过各种条件，包括生长因子刺激和细胞粘附到细胞外基质来诱导上皮细胞中PAK与MAPK通路信号传导间的通路交联(Slack-Davis JK等人，J Cell Biol.2003,162(2):281-291；Zang M等人，J Biol Chem.2001,276(27):25157-25165；Beeser A等人，J BiolChem.2005,280(44):36609-36615)。作为Rho家族小GTP酶Cdc42和Rac1的主要下游效应物，PAK1也在连接细胞外信号与肌动蛋白细胞骨架的组织、细胞形态和粘附动力学上的改变中发挥重要作用(Arias-Romero LE,&Chernoff J.,Biology Cell.2008,100(2):97-108；Kumar R等人，Nat Rev Cancer2006,6(6):459-471；Ong CC等人，Oncotarget.2011,2(6):491-496)。PAK1广泛表达于多种正常组织并在乳腺癌和肺癌中的表达显著增加(Holm C等人，J Natl Cancer Inst.2006,98(10):671-680；Arias-Romero LE等人，Oncogene2010,29(43):5839-5849；Ong CC等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.2011,108(17):7177-7182)。功能研究也在细胞转化(Vadlamudi RK等人，J Biol Chem.2000,275(46):36238-36244)和肿瘤生长(Ong CC等人，2011,同上；Yi C等人，Cancer Res.2008,68(19):7932-7937；Chow HY等人，PloS One 2010,5(11):e13791)中涉及PAK1。这些结果表明PAK1可能在某些疾病中有助于肿瘤发生。

发明内容

本发明涉及用于在个体中治疗黑色素瘤的方法，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，与非癌性皮肤细胞相比，PAK1在肿瘤中是过表达的。在一些实施方案中，PAK1在肿瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是突变的BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，本发明提供了用于在个体中治疗黑色素瘤的方法，包括给药所述个体治疗有效量的PAK1抑制剂。

在一些实施方案中，本发明提供了用于在个体中治疗黑色素瘤的方法，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触，其中所述PAK1抑制剂是小分子、核酸或多肽。在一些实施方案中，本发明提供了用于在个体中治疗黑色素瘤的方法，包括给药所述个体治疗有效量的PAK1抑制剂，其中所述PAK1抑制剂是小分子、核酸或多肽。

在一些实施方案中，本发明提供了用于在个体中治疗黑色素瘤的方法，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触，其中所述PAK1抑制剂与治疗剂组合使用。在一些实施方案中，本发明提供用于在个体中治疗黑色素瘤的方法，包括给药所述个体治疗有效量的PAK1抑制剂，其中所述PAK1抑制剂与治疗剂组合使用。

在一些方面中，本发明提供了PAK1抑制剂在个体中治疗黑色素瘤的用途。本发明提供了PAK1抑制剂在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，与非癌性皮肤细胞相比，PAK1在肿瘤中是过表达的。在一些实施方案中，PAK1在肿瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是突变的BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，个体是人。

在一些方面中，本发明提供了用于治疗黑色素瘤的包含PAK1抑制剂的组合物和试剂盒。在本文中描述了关于这些治疗方法的各种实施方案并应用于组合物和试剂盒。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，与非癌性皮肤细胞相比，PAK1在肿瘤中是过表达的。在一些实施方案中，PAK1在肿瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是突变的BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，个体是人。

在一些实施方案中，本发明提供了在个体黑色素瘤中抑制CRAF信号传导和/或MEK信号传导的方法，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，与非癌性皮肤细胞相比，PAK1在肿瘤中是过表达的。在一些实施方案中，PAK1在肿瘤中是扩增的。在一些实施方案中，与非癌性皮肤细胞相比，PAK1在肿瘤中是过表达的。在一些实施方案中，PAK1在肿瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是突变的BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，本发明提供了用于在个体中治疗黑色素瘤的方法，包括给药所述个体治疗有效量的PAK1抑制剂。

在一些方面中，本发明提供了鉴定适合以PAK1抑制剂治疗的人类黑色素瘤患者的方法，包括确定黑色素瘤的BRAF基因型，其中黑色素瘤包含野生型BRAF表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗。在一些方面中，本发明提供了鉴定适合以PAK1抑制剂治疗的人类黑色素瘤患者的方法，包括确定在黑色素瘤中PAK1的表达，其中与非癌性皮肤细胞相比，PAK1在黑色素瘤中是过表达的表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗。在一些方面中，本发明提供了鉴定适合以PAK1抑制剂治疗的人类黑色素瘤患者的方法，包括确定在黑色素瘤中PAK1的拷贝数，其中PAK1在黑色素瘤中是扩增的表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗。在一些方面中，本发明提供了鉴定适合以PAK1抑制剂治疗的人类黑色素瘤患者的方法，包括确定黑色素瘤的BRAF基因型和确定在黑色素瘤中PAK1的表达，其中野生型BRAF基因的存在和/或与非癌性皮肤细胞相比，PAK1在黑色素瘤中的过表达表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗。在一些方面中，本发明提供了鉴定适合以PAK1抑制剂治疗的人类黑色素瘤患者的方法，包括以下的一种或多种：确定黑色素瘤的BRAF基因型、确定在黑色素瘤中PAK1的表达，和确定黑色素瘤中PAK1的拷贝数，其中野生型BRAF基因的存在、与非癌性皮肤细胞相比PAK1在黑色素瘤中的过表达和PAK1在黑色素瘤中的扩增中的一种或多种表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗。

在一些方面中，本发明提供了以PAK1抑制剂治疗人类黑色素瘤患者的方法，包括：(a)根据黑色素瘤的BRAF基因型选择患者，其中黑色素瘤包含野生型BRAF表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗；和(b)给药所选患者治疗有效量的PAK1抑制剂。

在一些方面中，本发明提供了以PAK1抑制剂治疗人类黑色素瘤患者的方法，包括：(a)根据黑色素瘤的PAK1表达水平选择患者，其中与非癌性皮肤细胞相比，PAK1在黑色素瘤中的过表达表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗；和(b)给药所选患者治疗有效量的PAK1抑制剂。

在一些方面中，本发明提供了以PAK1抑制剂治疗人类黑色素瘤患者的方法，包括：(a)根据黑色素瘤中PAK1的拷贝数选择患者，其中PAK1在黑色素瘤中的扩增表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗；和(b)给药所选患者治疗有效量的PAK1抑制剂。

在一些方面中，本发明提供了以PAK1抑制剂治疗人类黑色素瘤患者的方法，包括：(a)根据黑色素瘤的BRAF基因型和黑色素瘤的PAK1表达水平选择患者，其中黑色素瘤包含野生型BRAF和/或与非癌性皮肤细胞相比，PAK1在黑色素瘤中的过表达表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗；和(b)给药所选患者治疗有效量的PAK1抑制剂。

在一些方面中，本发明提供了以PAK1抑制剂治疗人类黑色素瘤患者的方法，包括：(a)根据黑色素瘤的BRAF基因型、黑色素瘤的PAK1表达水平和黑色素瘤中PAK1的拷贝数中的一种或多种选择患者，其中包含野生型BRAF基因、与非癌性皮肤细胞相比黑色素瘤中PAK1的过表达和PAK1的扩增中的一种或多种的黑色素瘤，表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗；和(b)给药所选患者治疗有效量的PAK1抑制剂。

在一些方面中，本发明提供了在以PAK1抑制剂进行治疗的患者中调整黑色素瘤治疗的方法，所述方法包括评估在黑色素瘤中的PAK1表达，其中黑色素瘤中PAK1的过表达表明对该个体的治疗进行调整，直到不再检测到PAK1的过表达。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型黑色素瘤和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。

附图说明

图1显示PAK1在人黑色素瘤中大量表达。(A)人黑色素瘤组织的11q13拷贝数分析。红色竖线表示PAK1基因在染色体上的位置。(B)黑色素瘤肿瘤样品相关的PAK1DNA拷贝数和mRNA表达(226507_at Affymetrix MAS5.0signal)。(C)原发人恶性黑色素瘤中PAK1免疫组化的代表性图片。细胞质表达水平评分：0(I)、1(II)、2(III)和3(IV)。色原沉积表明对于苏木精复染的免疫反应性。PAK1表达也见于基质细胞(III)和嵌入表皮中的细胞，所述细胞可能代表朗格罕氏细胞(IV)。

图2证明PAK1在BRAF野生型黑色素瘤细胞的增殖中发挥关键作用。(A)通过Cell TiterGlo ATP消耗测定测量siRNA寡聚核苷酸转染的黑色素瘤细胞的增殖情况。细胞的生长需要PAK1，且数据根据对照进行归一化并以平均值±标准偏差的形式表示。(B)在一组黑色素瘤细胞系中，与带有BRAF(V600E)突变的细胞(n＝9；p＝0.07；624MEL、888MEL、928MEL、RPMI-7951、A375、Colo829、LOX-IMVI、Malme-3M、A375)相比，PAK1的抑制选择性地破坏不带有BRAF(V600E)突变的细胞(n＝5；537MEL、Hs940T、MeWO、SK-MEL2、SK-MEL23、SK-MEL30)的生长。(C)对PAK1/2的抑制降低REK1/2和MEK1/2的磷酸化和细胞周期蛋白D1的积累。(D)通过反相蛋白阵列(RPPA)分析确定，SK-MEL23BRAF野生型黑色素瘤细胞中PAK1/2的抑制降低对细胞骨架、MAPK、增殖及NF-κB途径的信号传导。归一化RPPA结果以平均值±标准偏差的形式表示。siNTC＝非靶向对照siRNA。siNRAS＝NRAS-特异性siRNA。siPAK1＝PAK1-特异性siRNA。ΔPAK1＝PAK1基因的染色体删除。

图3展示一系列免疫印迹分析，其表明在BRAF野生型黑色素瘤细胞中CRAF活化需要PAK1。(A)将PAK1-和PAK2-选择性siRNA或非靶向对照(NTC)siRNA寡核苷酸转染至SK-MEL23和537MEL黑色素瘤细胞。48小时后，免疫沉淀内源性MEK1(A)、MEK2(B)或CRAF(C)蛋白并将复合物进行免疫印迹分析以检测对于催化活性关键的残基的磷酸化。同时测定免疫复合物的总蛋白水平以作为上样对照。(D)以DMSO或5μM PF-4758309处理细胞4小时，并免疫沉淀内源性CRAF，进行免疫印迹分析Ser338的磷酸化。还显示了免疫复合物中CFAF的总体水平。(E)以DMSO、5μMPF-4758309或20μM IPA-3处理SK-MEK23细胞4小时。将CRAF免疫复合物在激酶缓冲液中与无活性MEK1蛋白孵育30分钟。测定磷酸化-MEK1(Ser217/Ser221)的水平，并以MEK1磷酸化水平对比总CRAF蛋白水平的形式报告CRAF的催化活性。

图4包含表明在黑色素瘤细胞迁移中需要PAK的图像。非靶向对照(NTC)siRNA或PAK1/2siRNA寡聚核苷酸转染72小时后，划伤融合的WM-266-4黑色素瘤细胞并在划伤时(暗影)和在培养28小时后(明场)记录图像。相对划伤密度的差异是统计学显著的(p<0.001；n＝3)。

图5展示一系列免疫印迹分析，其表明PAK抑制剂处理的BRAF野生型和BRAF(V600E)黑色素瘤细胞中MAPK信号传导的体外差示灵敏度。(A)以DMSO、5μM PF-3758309或者0.2μM PLX-4720处理SK-MEL23和A375细胞4小时并分析裂解液的MAPK通路组分的磷酸化。显示了p-MEK1/2(S217/S221)免疫印迹分析的较浅和较深的曝光。(B)附加Flag表位的PAK1的异位表达驱动A375细胞中MAPK通路的活化。使用PF-3758309抑制剂处理作为对照证明了特异性。

图6展示一系列图表表明由于自有(in-house)PAK抑制剂处理导致的BRAF野生型黑色素瘤细胞的存活力的下降。使用4天Cell TiterGlo(Promega)存活力测定使用(A)SK-MEL23和(B)537MEL细胞进行体外测试通过I-007、I-054、I-087及PF-3758309处理而对PAK1的催化抑制。

图7显示在BRAF野生型以及BRAF(V600E)黑色素瘤的异种移植物小鼠模型中，由PAK抑制引起的MAPK信号传导的体内差示灵敏度。(A)通过媒介物或35mg/kg PF-3758309给药后的CRAF(Ser338)的磷酸化所测量的BRAF野生型和突变体肿瘤的药效反应。(B)在BRAF野生型黑色素瘤的SK-MEL23临床前肿瘤模型中每日腹腔注射给药10、15和25mg/kgPF-3758309的抗肿瘤效果。

图8展示了一系列图表，其表明对于BRAF野生型黑色素瘤的SK-MEL23临床前肿瘤模型的个体肿瘤数据。显示了对于以10、15和25mg/kg PF-3758309处理的个体动物的(A)肿瘤生长抑制和(B)体重减轻。为分析相同动物随时间的反复测量的肿瘤体积，使用三次回归样条来对每一剂量水平的log₂肿瘤体积随时间过程拟合为非线性曲线。随后，将非线性曲线与混合模型中的剂量关联。使用三次回归样条来对每一剂量水平的log₂肿瘤体积随时间过程拟合为非线性曲线。随后，将非线性曲线与混合模型中的剂量关联。肿瘤生长抑制以媒介物的百分比的形式(％TGI)呈现，其是利用如下公式而计算为每日各个给药组的拟合曲线下面积(AUC)与媒介物的拟合曲线下面积相比的百分比：％TGI＝100×(1-AUC_dose/AUC_veh)。使用R version2.8.1以及Excel version 12.0.1(Microsoft)绘制和制作数据图表。使用Rversion 2.8.1(R Foundation for Statistical Computing；Vienna,Austria)分析数据，使用nlme软件包(version 3.1-89)在R中拟合混合模型。

图9显示免疫印迹分析结果，其表明以G945BRAF抑制剂或PF-3758309处理的BRAF野生型肿瘤的药效反应的差异。腹腔注射35mg/kgPF-3758309或口服10mg/kg G945(BRAF抑制剂)化合物后，检测SK-MEL23异种移植物肿瘤的CRAF(Ser338)的磷酸化。给药1小时后收集肿瘤并快速冷冻。每条泳道代表个体异种移植物小鼠的肿瘤裂解物。

图10是描绘PAK1在BRAF野生型黑色素瘤中的作用机制的图示。(A)在致癌突变的层面上，BRAF强烈驱动MAPK信号传导通路的活化，并且这些肿瘤细胞对该激酶的抑制作用敏感。(B)在其中BRAF未突变的黑色素瘤中，PAK1的升高的表达和基因组扩增是频繁的并导致CRAF-MEK-ERK和潜在的其他效应通路的信号传导的增加。这部分黑色素瘤亚群对BRAF抑制相对不敏感并且其增殖能力依赖于PAK1。

具体实施方式

本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法和组合物，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。本发明也提供了这样的治疗方法，包括给药所述个体治疗有效量的PAK1抑制剂。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，与非癌性细胞相比，黑色素瘤过表达PAK1。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤并且与非癌性细胞相比过表达PAK1。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF的黑色素瘤，与非癌性细胞相比黑色素瘤过表达PAK1和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。

本文引用的所有参考文献，包括专利申请、专利出版物和Genbank登录号通过引用整体并入本文，如同具体且单独指出通过引用并入各单独参考文献。

定义

本文所述或参考的技术和方法通常是充分了解的，并且由本领域技术人员使用常规方法一般应用，如例如，在下述参考文献中所述广泛使用的方法：Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd.edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel,et al.eds.,(2003))；系列METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.):PCR 2:APRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Tayloreds.(1995)),Harlow and Lane,eds.(1988)ANTIBODIES,A LABORATORYMANUAL,and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney,ed.(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney),ed.,1987)；Introduction toCell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Celland Tissue Culture Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of ExperimentalImmunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)；PCR:ThePolymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994)；Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；Short Protocols in MolecularBiology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies:ALaboratory Manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,HarwoodAcademic Publishers,1995)；和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita et al.,eds.,J.B.Lippincott Company,1993)。

除非特别定义，本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域技术人员的一般理解具有相同的意义。Singleton等人,Dictionary of Microbiology andMolecular Biology 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994),和March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.,JohnWiley&Sons(New York,N.Y.1992),为本领域技术人员提供了本申请中使用的术语的一般指引。

本文所用的“PAK”是指非受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STK)家族。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的p21-激活蛋白激酶(PAK)家族在细胞骨架的形成、细胞形态建成、细胞过程以及细胞存活中发挥重要作用(Daniels等人，TrendsBiochem.Sci.1999 24:350-355；Sells等人，Trends Cell.Biol.1997 7:162-167)。PAK家族由6个成员组成，可分为2组：PAK 1-3(I组)和PAK 4-6(II组)，其基于序列同源性和在I组PAK中自身抑制区的存在而相区别。p21-激活蛋白激酶(PAK)在Rac和Cdc42GTP酶的功能和Ras驱动的肿瘤发生所需的通路中充当重要的介质(Manser et al.,Nature 1994 367:40-46；B Dummler etal.,Cancer Metathesis Rev.2009 28:51-63；R.Kumar et al.,Nature Rev.Cancer2006 6:459-473)。

除非另有说明，本文所用的“PAK1”或“p21-激活蛋白(Cdc42/Rac)活化的激酶1”指任何脊椎动物来源的天然PAK1，所述动物包括哺乳动物，例如灵长类(如人类)和啮齿类(如小鼠和大鼠)。这些术语包括基因组位置(如11q13-q14细胞发生区带，染色体11:77033060-77185108，和/或GC11M077033)、“全长”、未被加工的PAK1以及细胞加工产生的任意形式的PAK1。术语也包括天然发生的PAK1变体，例如剪接变体或等位基因变体。实例性人PAK1核酸序列为NC_000011.9。实例性人PAK1氨基酸序列为NP_0011220921或NP_002567.3。实例性小鼠PAK1核酸序列为NC_000073.6或实例性小鼠PAK1氨基酸序列为NP_035165.2。实例性大鼠PAK1核酸序列为NC_005100.2或实例性大鼠PAK1氨基酸序列为NP_058894.1。实例性狗PAK1核酸序列为NC_006603.3或实例性狗PAK1氨基酸序列为XP_849651.1。实例性牛PAK1核酸序列为AC_000186.1或NC_007330.5。实例性牛PAK1氨基酸序列为NP_001070366.1。实例性恒河猴PAK1核酸序列为NC_007871.1。实例性恒河猴PAK1氨基酸序列为XP_001090310.1或NP_001090423.2。实例性鸡PAK1核酸序列为NC_006088.3或实例性鸡PAK1氨基酸序列为NP_001155844.1。

除非另有说明，本文所用的“BRAF”或“丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-Raf”指任何脊椎动物来源的天然BRAF，所述动物包括哺乳动物，例如灵长类(如人类)和啮齿类(如小鼠和大鼠)。这些术语包括基因组位置(如7q34细胞发生区带，染色体7:140433812-140624564，和/或GC07M140424)、“全长”、未被加工的BRAF以及细胞加工产生的任意形式的BRAF。术语也包括天然发生的BRAF变体，例如剪接变体或等位基因变体。实例性人BRAF核酸序列为NC_000007.13或实例性人BRAF氨基酸序列为NP_004324.2。实例性小鼠BRAF核酸序列为NC_000072.6或实例性小鼠BRAF氨基酸序列为NP_647455.3。实例性大鼠BRAF核酸序列为NC_005103.2或实例性大鼠BRAF氨基酸序列为XP_231692.4。实例性狗BRAF核酸序列为NC_006598.3或实例性狗BRAF氨基酸序列为XP_532749.3。实例性鸡BRAF核酸序列为NC_006088.3或实例性鸡BRAF氨基酸序列为NP_990633.1。实例性牛BRAF核酸序列为AC_000161.1或实例性牛BRAF氨基酸序列为XP_002687048.1。实例性马BRAF核酸序列为NC_009147.2或实例性马BRAF氨基酸序列为XP_001496314.2。

“野生型BRAF”本文指不与黑色素瘤相关的天然发生的BRAF(包括天然发生的变体)。GenBank登记号NP_004324.2提供了野生型人BRAF的实例。如本领域公知的，BRAF黑色素瘤可根据BRAF类型分类和归类：野生型BRAF和突变型BRAF。

本文所用的“突变型BRAF”指具有一个或多个与黑色素瘤相关的突变的BRAF蛋白。突变型BRAF的实例是其位置600的缬氨酸被谷氨酸取代(V600E)。如本领域公知的，黑色素瘤可根据BRAF类型分类：野生型BRAF和突变型BRAF。

除非另有说明，本文所用的“CRAF”或“v-raf白血病病毒致癌基因1”指任何脊椎动物来源的天然CRAF，所述动物包括哺乳动物，例如灵长类(如人类)和啮齿类(如小鼠和大鼠)。这些术语包括基因组位置(如3q25细胞发生区带，染色体3:12625100-12705700，和/或GC03M012625)、“全长”、未被加工的CRAF以及细胞加工产生的任意形式的CRAF。术语也包括天然发生的CRAF变体，例如剪接变体或等位基因变体。实例性人CRAF核酸序列为NC_000003.11或实例性人CRAF氨基酸序列为NP_002871.1。

本文所用的“MEK”或“丝裂原活化蛋白激酶激酶”指磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激酶家族。包括7个基因：MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K3(MKK3)、MAP2K4(MKK4)、MAP2K5(MKK5)、MAP2K6(MKK6)和MAP2K7(MKK7)。p38(MKK3和MKK6)、JNK(MKK4和MKK7)和ERK(MEK1和MEK2)的活化因子定义单独的MAP激酶信号转导通路。实例性人MEK1核酸序列为NC_000015.9或实例性人MEK1氨基酸序列为NP_002746.1。实例性人MEK2核酸序列为NC_000019.9或实例性人MEK2氨基酸序列为NP_109587.1。实例性人MEK3核酸序列为NC_000017.10。实例性人MEK3氨基酸序列为NP_002747.2或NP_659731.1。实例性人MEK4核酸序列为NC_000017.10或实例性人MEK4氨基酸序列为NP_003001.1。实例性人MEK5核酸序列为NC_000015.9。实例性人MEK5氨基酸序列为NP_001193733.1、NP_002748.1或NP_660143.1。实例性人MEK6核酸序列为NC_000017.10或实例性人MEK6氨基酸序列为NP_002749.2。实例性人MEK7核酸序列为NC_000019.9或实例性人MEK7氨基酸序列为NP_660186.1。

“多核苷酸”或“核酸”在本文中互换使用，其指代任何长度的核苷酸的聚合物，其包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或者可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应并入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可在聚合物装配之前或之后进行。核苷酸序列可被非核苷酸组分间断。多核苷酸在合成之后可被进一步修饰，例如通过与标记物接合来进行。修饰的其它类型包括，例如，“封端(caps)”，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，例如具有未带电荷联接物(linkage)(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酰酯、氨基甲酸酯等)和具有带电荷联接物(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有侧基部分例如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚左旋赖氨酸等)的那些，具有插入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些，含有烷化剂(alkylator)的那些，具有经修饰联接物(例如，α差向异构核酸等)以及多核苷酸的未经修饰的形式的那些。此外，通常存在于糖中的任何羟基可被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团替换，被标准保护基团保护，或者被活化以制备与额外核苷酸的额外联接，或者可与固体或半固体支持物接合。5’和3’末端的OH可被磷酸化或被胺或1至20个碳原子的有机封端基团部分取代。其它羟基还可衍生化为标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似物形式，包括，例如，2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-差向异构糖，差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)，吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非环状类似物以及脱碱基核苷类似物，例如甲基肌苷。一种或多种磷酸二酯联接物可被其它联接基团替换。这些其它联接基团包括但不限于下述实施方式，其中，磷酸酯被P(O)S(“硫代膦酸酯”)、P(S)S(“二硫代膦酸酯”)、(O)NR2(“酰胺化基团”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛(formacetal)”)取代，其中，每个R或R’独立代表H，或取代的或未被取代的任选地含有醚键(-O-)的烷基(1-20C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。多核苷酸中并非需要所有联接物是相同的。先前的描述应用于本申请所涉及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

本文所用的“寡核苷酸”一般指短的单链多核苷酸，其在长度上小于约250个核苷酸(但是不是必需的)。寡核苷酸可以是合成的。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述同样地且完全地适用于寡核苷酸。

术语“引物”指能够与核酸杂交且随后进行互补核酸的聚合的单链多核苷酸，一般具有游离的3’-OH基团。

术语“小分子”指具有约或少于2000道尔顿，优选地约或少于500道尔顿的分子量的任何分子。

术语“抗体”在本文中以最广泛含义使用，且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。

术语“检测”包括任意方式的检测，包括直接和间接检测。

本文所用的术语“生物标记物”指可以在样品中检测的指示物，例如预测、诊断和/或预后。生物标志物可以作为特征在于某些分子、病理学、组织学和/或临床症状的疾病或病症(例如癌症)的特定亚型的指示物。例如，黑色素瘤的生物标志物包括但不限于野生型BRAF的存在、PAK1的过表达和PAK1的扩增。

与个体增加的临床益处相关的生物标志物的“量”或“水平”是生物样品中可检测的水平。可以通过本领域技术人员已知的和本文公开的方法检测。评估的生物标志物的表达水平或量可以用于确定对治疗的应答。

术语“表达的水平”或“表达水平”一般可互换使用，并一般指生物样品中生物标志物的量。“表达”一般指将信息(例如，基因编码的和/或外遗传的)转换成在细胞中存在并操作的结构的过程。因此，本发明所用的“表达”指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或进一步指多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。也应该认为表达了转录的多核苷酸、翻译的多肽或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段，无论它们来自通过可变剪接产生的转录物或降解的转录物，还是来自多肽的翻译后加工，例如通过蛋白质水解。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)，然后翻译成多肽的那些基因，并也包括转录成RNA，但不翻译成多肽的那些基因(例如，转运和核糖体RNA)的那些基因。

“升高的表达”、“升高的表达水平”、“升高的水平”和“过表达的”指相对于对照例如未患有疾病或病症(例如癌症)的个体或内部对照(例如管家生物标志物)而言，个体中生物标志物升高的表达或升高的水平。在一些实施方案中，升高的表达或过表达是基因扩增的结果。

“降低的表达”、“降低的表达水平”或“降低的水平”指相对于对照例如未患有疾病或病症(例如癌症)的个体或内部对照(例如管家生物标志物)而言，个体中生物标志物降低的表达或降低的水平。

术语“管家生物标志物”指在全部细胞类型中通常相似存在的一种或一组生物标志物(例如多核苷酸和/或多肽)。在一些实施方案中，管家生物标志物是“管家基因”。本文中“管家基因”指其编码蛋白的活性对于细胞功能的保持是重要的和在全部细胞类型中通常相似存在的一种或一组基因。

本文所用的“扩增”一般指产生多拷贝的所需序列的过程。“多拷贝”指至少两个拷贝。“拷贝”不必然指与模板序列的理想的序列互补性或同一性。例如拷贝可以包括核苷酸类似物例如脱氧肌苷，在扩增过程中发生的有意序列变更(例如，经由包含可与模板杂交而不与模板互补的序列的引物引入的序列变更)和/或序列误差。二倍体细胞通常包含给定基因的两个拷贝，每条染色体上各一个。在本发明的一些方面中，“扩增”或细胞中的染色体基因指在细胞中存在的基因的两个以上拷贝的过程。

术语“多重PCR”指使用一组以上的引物对得自单个来源(例如个体)的核酸进行的单个PCR反应，其用于在单个反应中扩增2个或多个DNA序列的目的。

术语“诊断”在本文中用于指分子或病理学状态、疾病或病症(例如癌症)的鉴定或分类。例如，“诊断”可以指特定类型的癌症的鉴定。“诊断”还可以指特定亚型的癌症的分类，例如通过组织病理学标准，或通过分子特征(例如特征在于一种生物标记物或生物标记物的组合(例如特定基因或由所述基因编码的蛋白)的表达的亚型)。

术语“帮助诊断”在本文中用于指辅助作出有关疾病或障碍(例如癌症)的特定类型的症状或病症的存在或性质的临床决定的方法。例如，帮助诊断疾病或病症(例如癌症)的方法可以包括测量来自个体的生物样品中特定生物标志物。

“关联”意指以任何方式比较第一分析或方案的性能和/或结果与第二分析或方案的性能和/或结果。例如，可以在实施第二方案中使用第一分析或方案的结果和/或可以使用第一分析或方案的结果来确定第二分析或方案是否应当实施。就多核苷酸分析或方案的实施方案而言，可以使用多核苷酸表达分析或方案的结果来确定特定的治疗方案是否应当实施。

“个体应答”或“应答”可以使用指示对个体的益处的任何终末点进行评估，包括但不限于，(1)在一定程度上抑制疾病进展(例如癌症进展)，包括减慢和完全阻止；(2)减小肿瘤尺寸；(3)抑制(即减少、减慢或完全停止)癌细胞浸润到邻近周围器官和/或组织内；(4)抑制(即减少、减慢或完全停止)转移；(5)在一定程度上减轻与疾病或病症(例如癌症)相关的一种或多种症状；(6)增加无疾病进展存活的长度；和/或(9)在治疗后减少给定时间点的死亡率。

术语“预测”在本文中用于指患者将有利地或不利地对特定的抗癌治疗应答的可能性。在一个实施方案中，预测涉及那些应答的程度。在一个实施方案中，预测涉及在一定时间内例如用特定治疗剂治疗后患者是否存活或改善而无疾病复发和/或其可能性。本发明的预测方法可临床上用于通过为任何具体患者选择最合适的治疗方式而做出治疗决定。本发明的预测方法是有价值的工具，用于预测患者是否可能有利地应答治疗方案，例如给定的治疗方案，包括例如，给予给定的治疗剂或组合、手术介入、类固醇治疗等等，或者用于预测在治疗方案后患者是否可能长期存活。

术语“基本上相同”在本文中使用时表示两个数值之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值或表达)所测量的生物学特征背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较值的函数，所述两个数值之间的差异例如小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，和/或小于约10％。

短语“基本上不同”在本文中使用时表示两个数值之间足够高的差异程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特征背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较分子的数值的函数，所述两个数值之间的差异例如大于约10％，大于约20％，大于约30％，大于约40％，和/或大于约50％。

词语“标记物”在本文中使用时指可检出的化合物或组合物。标记物通常与试剂诸如多核苷酸探针或抗体直接或间接缀合或融合，而且便于与其缀合或融合的试剂检测。标记物自身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记物或荧光标记物)或在酶标记物的情况中，可以催化产生可检测的产物的底物化合物或组合物的化学变化。

试剂的“有效量”意指以剂量和在所需的时间段内有效实现期望的治疗或预防结果的量。

本发明的物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可以根据诸如以下因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引起期望的应答的能力。治疗有效量也是治疗有益效果超过所述物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或不良影响的量。

“预防有效量”意指以剂量和在所需的时间段内有效地实现期望的预防结果的量。通常但非必须的，由于在疾病的较早阶段之前或较早阶段时在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量小于治疗有效量。

在黑色素瘤的情况下，PAK1抑制剂的治疗有效量可以减少癌细胞的数目；减少原发肿瘤的大小；抑制(即一定程度地减缓，并优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度地减缓，并优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制或延迟肿瘤生长或肿瘤进展；和/或一定程度上减轻一种或多种与病症相关的症状。在药物可预防生长和/或杀死现有的癌细胞的程度上，它可能是细胞生长抑制和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，例如，可以通过评估生存时间、疾病进展时间(TTP)、响应率(RR)、响应时间，和/或生活质量来测量体内疗效。

“减少”或“抑制”是与参考相比减少或降低活性、功能和/或量。在某些实施方案中，“减少”或“抑制”意为导致20％或更大的整体下降的能力。在另一个实施方案中，“减少”或“抑制”意为导致50％或更大的整体下降的能力。在又一实施方案中，“减少”或“抑制”意为导致75％、85％、90％、95％或更大的整体下降的能力。减少或抑制可以指治疗的病症的症状、转移的存在或大小、原发肿瘤的大小或血管生成病症中血管的大小或数量。

术语“药物制剂”意指具有使得活性成分的生物活性有效的形式的制剂，且其不含有对给予制剂的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。这类制剂可以是无菌的。

“无菌”制剂是消毒的或不含全部活微生物及其孢子。

“药学上可接受的载体”指除了活性成分外，对于受试者无毒的药物制剂中的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

本文所用的“治疗”是为获得有益的或所需的临床结果的方法。对本发明的目的而言，有益的或所需的临床结果包括但不限于以下的一种或多种：一种或多种症状的减轻、疾病程度的降低、疾病扩散的预防或延迟(例如，转移，例如转移到肺或淋巴结)、疾病复发的预防或延迟、疾病进程的延迟或减慢、疾病状态的缓和和减轻(无论是部分还是总体)。“治疗”也包括增殖性疾病病理结果的减少。本发明的方法考虑任意一种或多种治疗的这些方面。

术语“黑色素瘤”指一种在正常皮肤或痣的黑色素细胞开始并快速和广泛转移的高度恶性肿瘤。术语“黑色素瘤”可以与术语“恶性黑色素瘤”、“黑色素癌”、“黑色素上皮癌”和“黑色素肉瘤”互换使用。

本文所用的“肿瘤”意指无论是恶性还是良性的，全部赘生细胞生长和增殖，以及全部癌前和癌细胞和组织。本文所引的术语“癌症”、“癌”、“细胞增殖病症”、“增殖病症”和“肿瘤”不是互斥的。

术语“癌症”和“癌”意指或描述哺乳动物的生理状况，通常其特征为不受调控的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴组织恶性肿瘤(lymphoid malignancies)。这些癌症更具体的实例包括但不限于鳞状细胞癌(squamous cell cancer)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)(包括胃肠癌和胃肠间质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿系统癌症、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和癌、阴茎癌、黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、结节性黑色素瘤、多发性骨髓瘤及B细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中度/滤泡性NHL；中度弥散性NHL；高度免疫母细胞NHL；高度成淋巴细胞性NHL；高度小无核裂细胞性(small non-cleaved cell)NHL；贮积病(bulky disease)NHL；套细胞淋巴瘤、AIDS相关的淋巴瘤；以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性粒细胞白血病和移植后淋巴组织增殖性病症(PTLD)以及与瘢痣病(phakomatoses)有关的异常血管增殖、水肿(例如，与脑瘤有关的水肿)、梅格斯综合征、脑癌以及头和颈癌以及相关的转移。在某些实施方案中，可适于通过本发明的抗体治疗的癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤、类癌肿瘤、头和颈癌、卵巢癌、间皮瘤以及多发性骨髓瘤。在某些实施方案中，癌症选自小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌(CRC)和肝细胞癌。仍然，在某些实施方案中，癌症选自非小细胞肺癌、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌，并且包括那些癌症的转移形式。

术语“抗癌疗法”是指在癌症治疗中有用的疗法。抗癌治疗剂的实例包括但不限于，例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放射疗法的药物、抗血管生成药物、细胞凋亡剂、抗微管蛋白剂、以及治疗癌症的其他药物，抗CD20抗体、血小板衍生生长因子抑制剂(例如Gleevec^TM(甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如塞来考昔)、干扰素、细胞因子，与下述靶标的一种或多种结合的拮抗剂(例如中和抗体)：PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA受体、TRAIL/Apo2；以及其他生物活性和有机化学药物等。本发明还包括上述药物的组合。

本文所用的术语“细胞毒性剂”意指抑制或防止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素)；化疗剂(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)；多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他插入剂；酶及其片段诸如溶核酶，抗生素，和毒素诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；以及下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。下文公开了其他细胞毒性剂。杀肿瘤剂导致肿瘤细胞的破坏。

“毒素”是对细胞的生长或增殖能够具有有害效果的任何物质。

“化学治疗剂”指用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的例子包括烷化剂，诸如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺磺酸烷基酯诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶诸如苯佐替派、卡波醌(carboquone)、美妥替派和乌瑞替派；乙撑亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；番荔枝内酯类(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙素；桦木酸；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康CPT-11(依立替康(irinotecan)，)、乙酰基喜树碱、东莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bzelesin)合成的类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成的类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀(prednmustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝脲类诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素诸如烯二炔抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γI和加利车霉素ωI1(参见，例如，Nicolaou等人，Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；CDP323，口服的α-4整联蛋白抑制剂；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括蒽环类抗生素A、埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉子基-多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂多柔比星脂质体TLC D-99、聚乙二醇化的多柔比星脂质体和脱氧多柔比星)，表柔比星(epirubcin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streotizocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicn)；抗代谢物诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)替加氟(tegafur)卡培他滨(capecitabine)埃博霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨(anctabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类诸如氨鲁米特(aminoglutethmide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trlostane)；叶酸补充剂诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubcin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2′,2′-三氯三乙胺；单端孢霉素类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine) 达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；噻替派(thotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如，紫杉醇白蛋白-工程化的紫杉醇纳米颗粒制剂(ABRAXANETM)，和多西他赛苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂剂诸如顺铂、奥沙利铂(例如，)和卡铂；长春胺类，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱长春新碱长春地辛和长春瑞滨(vinorelbine)依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；甲酰四氢叶酸；米托蒽醌(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)诸如视黄酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)二膦酸盐类诸如氯膦酸盐(例如，或)、依替膦酸盐(etidronate)NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐阿伦膦酸盐氨羟二磷酸二钠替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)曲沙他滨(troxactabine)(1,3-二氧戊环核苷酸胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其是抑制参与异常细胞增殖的信号传导通路中的基因表达的那些，诸如，例如，PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗诸如疫苗和基因治疗疫苗，例如，疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，)；rmRH(例如，)；BAY439006(索拉非尼，；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼(sunitinib)，Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，COX-2抑制剂(例如，塞来考昔或依托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑制剂(例如，PS341)；硼替佐米(bortezomib)CCI-779；替吡法尼(tipifarnib)(R11577)；索拉非尼(orafenib)，ABT510；Bcl-2抑制剂诸如奥利默森钠(oblimersen sodium)匹杉琼(pixantrone)；EGFR抑制剂(参见以下定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见以下定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂诸如雷帕霉素(西罗莫司，)；法呢酰基转移酶抑制剂诸如洛那法尼(lonafarnib)(SCH6636，SARASARTM)；和以上的任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及以上的两种或多种的组合诸如CHOP，即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙(prednisolone)的组合疗法的缩写；和FOLFOX，即利用与5-FU和甲酰四氢叶酸组合的奥沙利铂(ELOXATINTM)的治疗方案的缩写。

如本文所定义的化学治疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，其发挥调节、降低、阻断或抑制可促进癌症的生长的激素的作用。它们可以是激素本身，包括但不限于，具有混合的激动剂/拮抗剂分布的抗雌激素，包括他莫昔芬(tamoxifen)4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛西芬(keoxifene)和选择性雌激素受体调节剂(SERM)诸如SERM3；不具有激动剂性质的纯抗雌激素，诸如氟维司群(fulvestrant)和EM800(这样的药物可阻断雌激素受体(ER)二聚化，抑制DNA结合，提高ER转换和/或抑制ER水平)；芳香酶抑制剂，包括甾族芳香酶抑制剂诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)和非甾族芳香酶抑制剂诸如阿那曲唑(anastrazole)来曲唑(letrozole)和氨鲁米特(aminoglutethimide)，和其他芳香酶抑制剂包括伏氯唑(vorozole)醋酸甲地孕酮法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；促黄体素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(leuprolide)(和)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(tripterelin)；性甾体，包括孕酮诸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮，雌激素类诸如乙烯雌酚和马雌激素(premarin)，和雄激素类/类视黄醇类诸如氟羟甲睾酮，所有反式视黄酸和芬维A胺；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮；雌激素受体向下调节剂(ERD)；抗雄激素类诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；和以上任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及以上的两种或多种的组合。

本申请中所用的术语“前药”指药物活性物质的前体或衍生形式，其与母体药物相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小，并且能够被酶促活化或转化成更有活性的母体形式。参见，例如Wilman“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”Biochemical Society Transactions,14,pp.375-382,615th Meeting Belfast(1986)和Stella等人(1985).“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted DrugDelivery,”Directed Drug Delivery,Borchardt et al.,(ed.),pp.247-267,HumanaPress(1985)。本发明的前药包括但不限于含磷酸酯的前药、含硫代磷酸酯的前药、含硫酸酯的前药、含肽的前药、D-氨基酸-修饰的前药、糖基化的前药、含β-内酰胺的前药、含任选地被取代的苯氧基乙酰胺的前药或含任选地被取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其他5-氟脲嘧啶的前药，这些前药能够被转换为更具活性的无细胞毒性的药物。可以被衍生为用于本发明的前药形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于上述的那些化疗剂。

本文所用的“生长抑制剂”意指抑制细胞(例如黑色素瘤细胞)生长的化合物或组合物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进程(处于除了S期以外的位置)的药物，例如诱导G1停滞和M期停滞的药物。经典的M期阻断剂包括长春胺(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷(taxanes)和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。阻滞G1的那些药物还溢出进入S期停滞，诸如DNA烷化剂，如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶和ara-C。其他信息可以在下述参考文献中找到：The Molecular Basis ofCancer,Mendelsohn和Israel编辑的第一章，Murakami等人的题为“Cell cycleregulation，oncogenes，andantineoplastic drugs”(W.B.Saunders，Philadelphia，1995)中，如第13页。紫杉烷(紫杉醇和多西他赛(docetaxel))都是源自紫杉树的抗癌药。源自欧洲紫杉的多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进微管蛋白二聚体的微管的组装并通过防止解聚来稳定微管，这抑制了细胞的有丝分裂。

“放射疗法”指使用定向γ射线或β射线来诱发对细胞的足够损伤，以限制细胞正常发挥功能的能力或完全破坏细胞。应当认识到本领域已知许多方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予，而典型的剂量范围为每天10-200个单位(Grays)。

“个体(individual)”或“受试者(subject)”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如牛、羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，如猴)、兔和啮齿类动物(如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

与一种或多种其他治疗剂“组合”给药包括同时(共同)给药和以任何次序连续或先后给药。

本文所用的术语“共同”意指两种或更多种治疗剂的给药，其中至少部分给药在时间上是重叠的。因此，当一种或多种药物的给药在一种或多种其他药物的给药停止后继续时，共同给药包括剂量方案。

“降低或抑制”是指引起20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更大的总体降低的能力。降低或抑制可以指待治疗的病症的症状、转移的存在或尺寸、或原发肿瘤的尺寸。

术语“包装说明书(package insert)”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、组合治疗、与此治疗产品的使用相关的禁忌症和/或注意事项的信息。在一些实施方案中，本发明的包装说明书包括以PAK1抑制剂治疗黑色素瘤的说明。

“制品”是任何制造品(例如，包装或容器)或试剂盒，其包含至少一种药物，例如，用于治疗疾病或病症(如癌症)的药物，或者用于特异性检测本文所描述的生物标记物的探针。在某些实施方案中，作为用于执行本文所述方法的单元，宣传、分发或出售所述制造品或试剂盒。

“目标群众”是，如通过销售或广告，特别是对于特定用途、治疗或适应症，特定药物所要宣传或旨在宣传的人群或机构，例如个体、群体，报纸、医学文献和杂志的读者，电视或因特网观众，收音机或因特网的听众，医生，药物公司等。

如本领域技术人员理解的，在本文中提及“约”的值或参数包括(并且描述了)涉及该数值或参数本身的实施方案。例如，描述涉及“约X”包括“X”的描述。

应当理解本文描述的本发明的方面和实施方案包括“由这些方面和实施方案组成”和/或“基本上由这些方面和实施方案组成”。除非另有说明，如本文所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括对复数的提及。

“个体”、“受试者”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于农场动物(例如牛)、运动动物、宠物(例如猫、犬和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物是人。

本文所用的术语“样品”或“测试样品”指自感兴趣的受试者获得或衍生的组合物，其含有例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征进行表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，短语“疾病样品”及其各种变化形式指自感兴趣的受试者获得的任何样品，预期或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。在一个实施方案中，该定义涵盖生物来源的血液和其它液体样品和组织样品诸如活组织检查标本或组织培养物或由其衍生的细胞。组织样品的来源可以是固体组织，如来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活组织检查或吸出物；血液或任何血液成分；体液；和来自受试者妊娠或发育中的任何时间的细胞或血浆。样品包括但不限于原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清液、细胞溶胞物、血小板、血清、血浆、玻璃状液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳、全血、血液衍生细胞、尿液、脑脊液、唾液、痰、泪液、汗液、粘液、肿瘤溶胞物、和组织培养介质及组织提取物诸如均质化组织、肿瘤组织、细胞提取物及其组合。

术语“样品”或“测试样品”包括在获得它们后已经以任何方式进行处理的生物学样品，所述方式如通过用试剂处理，溶解，或富集某些成分，如蛋白或多核苷酸，或包埋在半固体或固体基质中用于切片目的。针对本文的目的，组织样品的“切片”指组织样品的单一部分或块，例如自组织样品切下的组织或细胞的薄切片。在一个实施方案中，所述样品是临床样品。在另一个实施方案中，所述样品用于诊断测定中。在一些实施方案中，所述样品获自原代或转移肿瘤。组织活组织检查通常用于获得肿瘤组织的代表块。可选择地，肿瘤细胞可以以已知或被认为包含待研究的肿瘤细胞的组织或流体形式间接获得，例如，皮肤样品。

“组织样品”或“细胞样品”指获得自受试者或个体的组织的相似细胞集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织如来自新鲜、冷冻和/或保存的器官、组织样品、活检组织和/或吸引物；血液或任何血液组成成分例如血浆；体液例如脑脊髓液、羊膜液、腹膜液或间质液；来自受试者的妊娠或发育中的任何时间的细胞。组织样品还可以是原代或培养的细胞或细胞系。任选地，组织或细胞样品获得自疾病组织/器官。组织样品可以含有本质上不与组织天然地混合的化合物，例如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等。

如本文所用的“参照样品”、“参照细胞”、“参照组织”、“对照样品”、“对照细胞”或“对照组织”是指用于比较目的的样品、细胞、组织、标准或水平。在一个实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织获得自相同受试者或个体的身体(例如组织或细胞)的健康的和/或非疾病部分。例如，健康和/或非疾病细胞或组织临近疾病细胞或组织(例如临近肿瘤的细胞或组织)。在一些实施方案中，参照样品是非癌性皮肤细胞。在另一实施方案中，参照样品获得自相同受试者或个体的身体的未治疗组织和/或细胞。在另一实施方案中，参照样品是相同受试者或个体的身体的非癌性皮肤细胞。在另一实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织获得自非受试者或患者的个体的身体(例如组织或细胞)的健康和/或非疾病部分。在一些实施方案中，参照样品是非受试者或患者的个体的非癌性皮肤细胞。在另一实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织获得自非受试者或患者的个体的身体的未治疗组织和/或细胞。

在某些实施方案中，参照样品是在与获得测试样品的时间点不同的一个或多个时间点获得的来自相同受试者或患者的单一样品或组合的多个样品。例如，参照样品在比获得测试样品时更早的时间点从相同的受试者或患者获得。如果参照样品在开始诊断癌症的过程中获得，并且测试样品随后在癌症已经转移时获得，所述参照样品可以是有用的。

在某些实施方案中，参照样品包括获自非受试者或患者的一个或多个个体的在上述术语“样品”下定义的所有类型的生物学样品。在某些实施方案中，参照样品获自非-受试者或患者的患有血管生成病症(例如癌症)的一个或多个个体。

在某些实施方案中，参照样品是来自非受试者或患者的一个或多个健康个体的合并的多个样品。在某些实施方案中，参照样品是来自非受试者或患者的一个或多个患有疾病或病症(例如血管生成病症，例如癌症)的个体的合并的多个样品。在某些实施方案中，参照样品是来自非-受试者或患者的一个或多个个体的正常组织的合并的RNA样品或合并的血浆或血清样品。在某些实施方案中，参照样品是来自非-受试者或患者的一个或多个患有疾病或病症(例如血管生成病症，例如癌症)的个体的肿瘤组织的合并的RNA样品或合并的血浆或血清样品。

针对本文的目的，组织样品的“切片”意指组织样品的单个部分或小片，例如由组织样品切出的组织或细胞的薄片。应当理解可以采集组织样品的多个切片，对其进行分析，条件是应当理解对组织样品的相同切片在形态和分子水平两者上进行分析，或就多肽和多核苷酸两者进行分析。

基因或生物标记物的表达水平/量可以基于本领域已知的任何适合的标准定性和/或定量地确定，包括但不限于mRNA、cDNA、蛋白、蛋白片段和/或基因拷贝数。在某些实施方案中，与在第二样品中的表达/量相比，在第一样品中的基因或生物标记物的表达/量增加。在某些实施方案中，与在第二样品中的表达/量相比，在第一样品中的基因或生物标记物的表达/量减少。在某些实施方案中，所述第二样品是参照样品。

在某些实施方案中，术语“增加”或“过表达”指与参照样品相比，通过标准领域已知的方法如本文提及的那些方法检测的在蛋白水平或核酸水平上的约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大中任意的总的增加。在某些实施方案中，术语“增加”或“过表达”指基因或生物标记物的表达水平/量在样品中的增加，其中增加是参照样品中各个基因或生物标记物的表达水平/量的至少约1.5×、1.75×、2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、25×、50×、75×、或100×中任意的增加。

在某些实施方案中，术语“减少”在本文指与参照样品相比，通过标准领域已知的方法如本文所述的那些方法检测的在蛋白或核酸水平上的约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大中任意的总的减少。在某些实施方案中，术语减少指样品中基因或生物标记物的表达水平/量的减少，其中减少是参照样品中各个基因或生物标记物的表达水平/量的至少约0.9×、0.8×、0.7×、0.6×、0.5×、0.4×、0.3×、0.2×、0.1×、0.05×、或0.01×中任意的减少。

“检测”包括任何检测方式，包括直接或间接检测。

在某些实施方案中，所谓“关联”是指以任何方式比较第一分析或方案的性能和/或结果与第二分析或方案的性能和/或结果。例如，可以使用第一分析或方案的结果进行第二方案和/或可以使用第一分析或方案的结果来确定是否应该进行第二分析或方案。关于基因表达分析或方案的实施方案，可以使用基因表达分析或方案的结果来确定是否应该进行具体的治疗方案。

术语“标记物”当用于本文时，指直接或间接与试剂如核酸探针或抗体缀合或融合并且有利于检测与其缀合或融合的试剂的化合物或组合物。所述标记物本身可以是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶促标记的情形中，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。

术语“多肽”是指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是直链或支链，其可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸间隔。该术语还包括已被天然地或通过介入修饰的氨基酸聚合物，例如通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰如与标记组分缀合。在该定义内还包括例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域中已知的其它修饰。如本文使用的术语“多肽”明确涵盖了“蛋白”。如本文使用的术语“多肽”和“蛋白”明确涵盖了抗体。

“分离的”核酸分子是一种已经鉴定的并从通常与该多肽核酸的天然来源相关的至少一种污染性核酸分子中分离的核酸分子。分离的核酸分子不同于其天然发现的形式或背景。因此分离的核酸分子可与存在于天然细胞中时的该核酸分子区别出来。然而，分离的核酸分子包括包含于通常表达该多肽的细胞中的核酸分子，例如在该细胞中核酸分子位于与天然细胞不同的染色体位置。

如本文所用的“基因”、“靶基因”、“目标生物标记物”、“靶序列”、“靶核酸”或“靶蛋白”，是需要检测的感兴趣的多核苷酸或蛋白。通常，如本文所用的“模板”是包含靶核苷酸序列的多核苷酸。在一些实例中，术语“靶序列”、“模板DNA”、“模板多核苷酸”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”及其变体可以互换使用。

“天然序列”多肽包括与天然来源的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。如此，天然序列多肽可具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽的氨基酸序列。此类天然序列多肽可以天然分离，或者可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列”多肽明确涵盖该多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外域序列)、天然存在的变异形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。

“分离的”多肽或“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一些实施方案中，将多肽纯化至(1)根据Lowry法测定的多肽的大于95％重量，或超过99％重量，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或银染色，达到同质。既然多肽天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

多肽“变体”意指与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如在多肽的N-末端或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，变体与天然序列多肽将具有至少约80％的氨基酸序列同一性，更优选的是，至少约90％的氨基酸序列同一性，和进一步更优选的是，至少约95％的氨基酸序列同一性。

术语“益处”以最广义使用，且指任何期望的效果，并且明确包括如本文中限定的临床益处。

临床益处可以通过评估各种终末点来测量，例如在一定程度上抑制疾病进展，包括延缓和完全阻滞；减少疾病事件和/或症状的数量；减少损伤大小；抑制(即减少、减缓或彻底阻止)疾病细胞浸润到邻近的周围器官和/或组织中；抑制(即减少、延缓或完全阻止)疾病传播；减少自身免疫应答，其可以，但不必需导致疾病损伤的退化或消除；在一定程度上减轻与病症相关的一种或多种症状；增加治疗后没有疾病表现的长度，例如无疾病进展存活期；增加的总存活时间；更高的反应速率；和/或在治疗后的给定时间点减少的死亡率。

本发明的方法

本发明提供了用于在个体中治疗黑色素瘤的方法，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。在一些实施方案中，所述方法包括给药个体治疗有效量的PAK1抑制剂。

黑色素瘤是黑色素细胞，如产生黑色素(一种负责皮肤颜色的深色色素)的细胞的恶性肿瘤。黑色素瘤主要发生在皮肤，但也在身体的其他部位，包括肠和眼睛(如葡萄膜黑色素瘤)上发现。黑色素瘤可起源于包含黑色素细胞的身体任何部位。黑色素瘤的实例包括但不限于浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、和肢端雀斑样痣黑色素瘤。黑色素瘤可根据众多标准，包括大小、溃疡、扩散到淋巴结和/或扩散到其他组织或器官来分期。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗I期黑色素瘤的方法，其通过将黑色素瘤与PAK1抑制剂接触。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗II期黑色素瘤的方法，其通过将黑色素瘤与PAK1抑制剂接触。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗III期黑色素瘤的方法，其通过将黑色素瘤与PAK1抑制剂接触。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗IV期黑色素瘤的方法，其通过将黑色素瘤与PAK1抑制剂接触。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗转移性黑色素瘤的方法，其通过将黑色素瘤与PAK1抑制剂接触。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗复发性黑色素瘤的方法，其通过将黑色素瘤与PAK1抑制剂接触。在一些实施方案中，所述方法包括对个体给药治疗有效量的PAK1抑制剂。在一些实施方案中，PAK1抑制剂是PAK1的小分子抑制剂。在一些实施方案中，个体是哺乳动物。在一些实施方案中，个体是人。

在一些方面中，本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法，其中黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，本发明提供了治疗野生型BRAF黑色素瘤的方法，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。在一些实施方案中，本发明提供了治疗野生型BRAF黑色素瘤的方法，包括对所述个体给药治疗有效量的PAK1抑制剂。BRAF是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶的Raf激酶家族的成员。BRAF在调节MAP激酶/ERK信号传导通路(RAF-MEK-ERK途径)中发挥功能，从而影响细胞分裂、分化和分泌。在癌症中RAF-MEK-ERK信号传导经常是失调的。已经确定与人类癌症相关的大于30种的BRAF基因突变。BRAF突变的频率在人类癌症中广泛变化，从在黑色素瘤的80％以上，到在其他肿瘤中少至0-18％，如在肺癌中的1-3％和结肠直肠癌中的5％。在癌症，特别是黑色素瘤中发现的一个常见的突变是在密码子600用谷氨酸替代缬氨酸(即V600E)。例如，在核苷酸1799胸腺嘧啶被腺嘌呤取代，导致V600E突变。BRAF的V600突变导致组成性BRAF激酶活性。确定黑色素瘤中BRAF基因型的方法是本领域技术人员已知的；例如，可以使用标准的测序方法或通过使用KASP SNP基因分型系统(KBioscience)来确定黑色素瘤的BRAF基因的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法，其中所述黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法，其中所述黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤且与非癌性细胞相比，黑色素瘤过表达PAK1。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法，其中所述黑色素瘤包含野生型BRAF且PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中与非癌性细胞相比PAK1在黑色素瘤中是过表达的并且PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法，其中所述黑色素瘤是突变型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法，其中所述黑色素瘤是突变型BRAF黑色素瘤，并且与非癌性细胞相比黑色素瘤过表达PAK1。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法，其中所述黑色素瘤包含突变型BRAF并且PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法，其中所述黑色素瘤包含突变的BRAF，其中所述突变的BRAF不是V600E突变的BRAF。在一些实施方案中，个体是哺乳动物。在一些实施方案中，个体是人。

在一些方面中，本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法，通过将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。在一些方面中，本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法，通过给药个体治疗有效量的PAK1抑制剂。PAK参与了一些在人癌细胞中通常失调的途径。PAK1是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Jun N-末端激酶(JNK)、类固醇激素受体和核因子(NF)信号传导途径的组分，而这一切都与肿瘤生成有关。PAK分别通过磷酸化丝氨酸298和丝氨酸338上的MEK和RAF1来激活所述MEK和RAF1。由PAK1导致的Ras诱导的转化的增加与其对通过细胞外信号调节激酶(ERK)-MAPK途径的信号传导的效应相关，而与对JNK或p38-MAPK途径的效应无关(R.Kumar等人，Nature Rev.Cancer 2006 6:459)。ERK/MEK途径的组成性激活涉及肿瘤的形成、进展和存活，进而与特征在于不受控制的增殖、凋亡的失控和不良预后的侵略性表型相关(J.A.Spicer，Expert Opin.Drug Discov.20083:7)。

肿瘤形成和进展需要癌细胞中促凋亡信号的失活。已经证实PAK活性下调几个重要的促凋亡途径。RAF1的PAK1磷酸化诱导RAF1易位到线粒体，其使促凋亡蛋白BCL2-细胞死亡拮抗剂(BAD)磷酸化。也有报道在所选的细胞类型，例如CV-1(猿猴)来源且携带SV40(COS)的肾脏细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人胚肾(HEK)293T细胞中PAK1、PAK2、PAK4和PAK5直接磷酸化BAD并使其失活(R.Kumar等人，同上)。然而，仍然仅部分理解了在人肿瘤细胞中PAK1的相关途径下游。

PAK1广泛表达于多种正常组织中；然而，在卵巢癌、乳腺癌和膀胱癌中表达显著增加(S.Balasenthil等人，J.Biol.Chem.2004 279:4743；M.Ito等人，J.Urol.2007 178:1073；P.Schraml等人，Am.J.Pathol.2003 163:985)。在管腔乳腺癌中，PAK1的基因组扩增与对他莫昔芬治疗的抗性相关，这可能是作为PAK1的直接磷酸化和雌激素受体的配体非依赖性转录活化的结果发生(S.K.Rayala等人，Cancer Res.2006.66:1694-1701)。

在一些方面中，本发明提供在个体中治疗黑色素瘤的方法，其通过将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。在一些方面中，本发明提供在个体中治疗黑色素瘤的方法，其通过给药个体治疗有效量的PAK1抑制剂。在一些实施方案中，PAK1基因在黑色素瘤是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤中PAK1的拷贝数是约2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0或大于5.0中任何一种。确定黑色素瘤中PAK1基因的拷贝数的方法是本领域已知的。例如，可以通过使用SNP阵列，例如Affymetrix 500K SNP阵列分析来确定PAK1基因的拷贝数。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法，其中黑色素瘤中的PAK1拷贝数是大于约2.5。在一些实施方案中，本发明提供确定在用PAK1抑制剂治疗之后的黑色素瘤的PAK1拷贝数的方法。在一些实施方案中，将黑色素瘤中PAK1的拷贝数与非癌性细胞(例如，非癌性皮肤细胞)中PAK1的拷贝数进行比较。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是扩增的和黑色素瘤过表达PAK1。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是扩增的和黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，个体是哺乳动物。在一些实施方案中，个体是人。

在一些方面中，本发明提供在个体中治疗黑色素瘤的方法，通过将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触，其中PAK1在黑色素瘤中过表达。在一些方面中，本发明提供在个体中治疗黑色素瘤的方法，通过给药个体治疗有效量的PAK1抑制剂，其中PAK1在黑色素瘤中过表达。确定PAK1表达的方法是本领域已知的。确定黑色素瘤中PAK1表达水平的方法的实例包括但不限于免疫组化、反相蛋白质阵列(RPPA)、定量PCR、免疫分析等。可以通过使用基因表达综合性数据库(GEO)将PAK1的表达水平与其他肿瘤和细胞进行比较。

在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法，通过将黑色素瘤与PAK1抑制剂接触，其中与非癌性细胞相比，PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些方面中，本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法，通过给药个体治疗有效量的PAK1抑制剂，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，在黑色素瘤中PAK1的表达是在非癌细胞中表达的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％中的任何一种。在一些实施方案中，与非癌性细胞中PAK1的表达相比，在黑色素瘤中PAK1的表达是约1.5倍、2.0倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10倍，或大于10倍中任何一种。在一些实施方案中，与非癌性细胞相比，黑色素瘤过表达PAK1和黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，与非癌性细胞相比，黑色素瘤过表达PAK1和PAK1在黑色素瘤是扩增的。在一些实施方案中，与非癌性细胞相比，黑色素瘤过表达PAK1和黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤和PAK1在黑色素瘤是扩增的。在一些实施方案中，个体是哺乳动物。在一些实施方案中，个体是人。

在一些方面中，本发明提供了在个体中抑制黑色素瘤中CRAF信号传导的方法，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。在一些方面中，本发明提供了在个体中抑制黑色素瘤中CRAF信号传导的方法，包括给药所述个体治疗有效量的PAK1抑制剂。测量CRAF信号传导的方法是本领域已知的。例如，可以通过分离自PAK1抑制剂治疗之前和/或之后个体的黑色素瘤的CRAF的免疫印迹来确定CRAF的活化。可以使用磷酸-CRAF(Ser338)抗体测量CRAF的活化。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，个体是哺乳动物。在一些实施方案中，个体是人。

在一些方面中，本发明提供了在个体中抑制黑色素瘤中MEK信号传导的方法，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。在一些方面中，本发明提供了在个体中抑制黑色素瘤中MEK信号传导的方法，包括给药所述个体治疗有效量的PAK1抑制剂。测量MEK信号传导的方法是本领域已知的。例如，可以通过分离自PAK1抑制剂治疗之前和/或之后个体的黑色素瘤的MEK的免疫印迹来确定CRAF的活化。可以使用磷酸-MEK1/1(Ser217/Ser221)抗体测量MEK的活化。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，个体是哺乳动物。在一些实施方案中，个体是人。

PAK1抑制剂

本文提供的是在本文描述的方法中有用的PAK1抑制剂(如PAK1拮抗剂)。在一些实施方案中，PAK1抑制剂是小分子、核酸、多肽或抗体。在WO 2007/072153和WO2010/07184中提供了PAK抑制剂的实例，将这两者以整体引用的方式并入本文。

小分子

本文提供的是用作用于黑色素瘤治疗的PAK1抑制剂的小分子。

小分子优选地是除了如本文所描述的结合PAK1或干扰PAK1信号传导的如本文所定义的结合多肽或抗体以外的有机分子。可以使用已知的方法鉴定和化学合成结合有机小分子(参见，例如，PCT公开WO 00/00823和WO00/39585)。结合有机小分子的大小通常小于约2000道尔顿，或者大小小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中可以无需过多实验而使用熟知的技术来鉴定所述能够结合优选特异性地结合本文描述的多肽的有机小分子。在这方面，值得注意的是用于筛选有机小分子文库以获得能够结合靶多肽的分子的技术是本领域熟知的(参见，例如，PCT公开WO 00/00823和WO 00/39585)。结合有机小分子可以是，例如，醛、酮、肟、腙、缩氨基脲、卡巴肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、硫缩酮、缩醛、硫缩醛、芳基卤、磺酸芳基酯、烷基卤化物、磺酸烷基酯、芳族化合物、杂环化合物、苯胺、烯、炔、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、氮丙啶、异氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物、酰基氯等。

已经描述PAK激酶的小分子抑制剂(参见WO2006072831，WO2007023382，WO2007072153，WO2010/071846，US20090275570)。

Afraxis,Inc在一系列专利申请(WO2009086204、WO2010071846、WO2011044535、WO2011156646、WO2011156786、WO2011156640、WO2011156780、WO2011156775、WO2011044264)中公开了一系列由2-氨基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(I)骨架修饰得到的PAK1选择性抑制剂。

AstraZeneca公开了式II的双环杂环PAK1抑制剂(参见WO2006106326)。

Pfizer公开了由1H-噻吩并[3,2-c]吡唑(III)、3-氨基-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑(IV)和N4-(1H-吡唑-3-基)嘧啶-2,4-二胺(V)修饰得到的PAK抑制剂(参见WO2004007504、WO2007023382、WO2007072153、和WO2006072831)。

PF-3758309(Ⅵ)是已经处于临床试验的PAK1、4、5和6的强的ATP-竞争性抑制剂(B.W.Murray等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 2010 107(20):9446；Rosen L等人，Phase 1,dose escalation,safety,pharmacokinetic andpharmacodynamic study of single agent PF-03758309,an oral PAK inhibitor,inpatients with advanced solid tumors[摘要].In:Proceedings of theAACR-NCI-EORTC International Conference on Molecular Targets and CancerTherapeutics；2011Nov 12-16；San Francisco,CA.Philadelphia(PA):AACR；Mol Cancer Ther 2011；10(11Suppl):摘要nr A177)。

已经公开了一系列N4-(1H-吡唑-3-基)嘧啶-2,4-二胺(VII)的N2-二环吲哚基、吲唑基和苯并咪唑基衍生物(2011年08月25日提交的美国序列号：61/527,453)及其氮杂吲哚基、吲唑基和苯并咪唑基衍生物(2011年12月22日提交的美国序列号61/579,227)，这些参考文献通过引用以其整体并入本文。(A＝吲哚基、吲唑基和苯并咪唑或其氮杂衍生物)。

核酸

本发明提供了用于在个体中治疗黑色素瘤的PAK1的多核苷酸拮抗剂。所述多核苷酸可以是RNAi，例如siRNA或miRNA、反义寡核苷酸、核酶(RNAzyme)、脱氧核酶(DNAzyme)、寡核苷酸、核苷酸，或它们的任何片段，包括基因组或合成来源的DNA或RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA)，其可以是单链或双链，并且可以表示对于以下的有义或反义链：肽核酸(PNA)或天然或合成来源的任何DNA样或RNA样物质，包括例如iRNA、核糖核蛋白(例如iRNPs)。在一些实施方案中，所述多核苷酸靶向PAK1的表达(例如，靶向PAK1 mRNA)。

所述多核苷酸可以是反义核酸和/或核酶。反义核酸包含与PAK1的RNA转录物的至少一部分互补的序列。然而，虽然优选的，绝对的互补性不是必需的。

本文所指的“与RNA的至少一部分互补”的序列是指具有足够的互补性，以能够与RNA杂交，从而形成稳定的双链的序列；在双链PAK1反义核酸的情况下，因此可以测试所述双链DNA的单链，或者可以测定三链形成。杂交的能力将取决于互补的程度和反义核酸的长度。通常，杂交核酸越大，可以含有的与PAK1的RNA错配的碱基越多，并仍然形成稳定的双链(或三链，视情况而定)。本领域技术人员可以通过使用标准程序来确定错配的可容许程度以确定杂交复合物的熔点。

与信使5’末端如直至且包括AUG起始密码子的5’未翻译序列互补的多核苷酸，应最有效地抑制翻译。然而，与mRNA的3’未翻译序列互补的序列也已示出有效地抑制mRNA的翻译。一般参见Wagner,R.,1994,Nature372:333-335。因此，与PAK1基因的5’或3’未翻译的非编码区互补的寡核苷酸，可用于反义方法中以抑制内源PAK1 mRNA的翻译。与mRNA的5’未翻译区互补的多核苷酸应包括AUG起始密码子的互补序列。与mRNA编码区互补的反义多核苷酸是效应较弱的翻译抑制剂，但根据本发明可以使用。不论是否设计为与PAK1 mRNA的5’、3’或编码区杂交，反义核酸长度应至少为6个核苷酸，优选长度为6到约50个核苷酸的寡核苷酸。在特别的方面，寡核苷酸长度为至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的PAK1反义核酸是在细胞内通过从外源序列中转录而产生的。例如，转录载体或其一部分，从而产生PAK1基因的反义核酸(RNA)。这种载体含有编码PAK1反义核酸的序列。这种载体可保持附加型(episomal)或成为染色体整合的载体，只要其可被转录产生所需的反义DNA。这种载体可通过本领域标准的重组DNA技术方法构建。载体可以是质粒、病毒，或本领域已知其它物质，用于在脊椎动物细胞中复制和表达。编码PAK1，或其片段的序列，可通过本领域已知的任何启动子在脊椎动物，优选人细胞中表达。这种启动子可以是可诱导的或组成型的。这种启动子包括但不限于SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，Nature 29：304-310(1981)，包含于Rous肉瘤病毒的3’长末端重复中的启动子(Yamamoto等人，Cell 22：787-797(1980))，疱疹胸苷启动子(Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445(1981)，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人，Nature 296：39-42(1982))，等。

小抑制RNA(siRNAs)也可以作为PAK1抑制剂用于治疗黑色素瘤。可以通过将黑色素瘤与小双链RNA(dsRNA)或导致产生小双链RNA的载体或构建体接触来抑制PAK1表达，使得特异性抑制PAK1的表达。选择适当的dsRNA或dsRNA编码载体的方法是本领域公知的(Tuschi,T等人(1999)Genes Dev.13(24):3191-3197；Elbashir,SM等人,(2001)Nature 411:494-498；Hannon,GF(2002)Nature 418:244-251；McManus MT和Sharp,PA(2002)Nature Reviews Genetics 3:737-747；Bremmelkamp,TR等人，(2002)Science296:550-553,US专利6,573,099和6,506,559和国际专利公开WO01/36646、WO 99/32619和WO 01/68836)。

PAK1siRNA寡核苷酸序列的实例包括但不限于1)GAAGAGAGGTTCAGCTAAA、2)GGAGAAATTACGAAGCATA、3)ACCCAAACATTGTGAATTA、4)GGTTTATGATTAAGGGTTT，所有这些获自Dharmacon，Inc.。

多肽

本发明提供了用于在个体中治疗黑色素瘤的PAK1活性的多肽抑制剂。例如，结合多肽是优选地和特异地结合如本文所述的PAK1的多肽。在一些实施方案中，结合多肽是PAK1拮抗剂。结合多肽可以使用已知的多肽合成方法来化学合成或可以使用重组技术制备和纯化。结合多肽在长度上通常是至少约5个氨基酸，或者在长度上至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更长，其中所述结合多肽能够优选、特异地结合如本文所述的PAK1。可以在没有过度实验的情况下使用公知的技术来鉴定结合多肽。在这方面，应该注意的是筛选多肽库以获得能够特异性结合多肽靶标的结合多肽的技术是本领域中公知的(参见，例如，美国专利5,556,762、5,750,373、4,708,871、4,833,092、5,223,409、5,403,484、5,571,689、5,663,143；PCT公开WO 84/03506和WO 84/03564；Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:3998-4002(1984)；Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:178-182(1985)；Geysen等人，in Synthetic Peptides as Antigens,130-149(1986)；Geysen等人，J.Immunol.Meth.,102:259-274(1987)；Schoofs等人，J.Immunol.,140:611-616(1988)，Cwirla，SE等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378；Lowman HB等人(1991)Biochemistry,30:10832；Clackson，T.等人(1991)Nature,352:624，Marks JD等人(1991),J.Mol.Biol.,222:581，Kang AS等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363，和Smith GP(1991)CurrentOpin.Biotechnol.,2:668)。

在这方面，噬菌体展示是一种允许筛选大型多肽文库以鉴定那些文库中能够特异结合靶标PAK1的成员的公知技术。噬菌体展示是将变体多肽作为融合蛋白与外壳蛋白展示在噬菌体颗粒表面的一种技术(Scott JK和SmithGP(1990)Science 249：386)。噬菌体展示的效用在于，可以对选择性随机化蛋白变体(或随机克隆cDNA)的大型文库迅速且有效地分选那些以高亲和力结合靶分子的序列。在噬菌体上肽(Cwirla SE等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378)或蛋白质(Lowman HB等人，(1991)Biochemistry，30：10832；Clackson T等人(1991)Nature，352：624；Marks JD等人(1991)，J.Mol.Biol.，222：581；Kang AS等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8363)文库的展示已经用于从数以百万计的多肽或寡肽中筛选具有特异结合特性的多肽或寡肽(Smith GP(1991)Current Opin.Biotechnol.2:668)。分选随机突变体的噬菌体文库需要构建和繁殖大量变体的策略，使用靶受体进行亲和纯化的方法，及评估结合富集结果的手段。参见美国专利5,223,409、5,403,484、5,571,689和5,663,143。

尽管大多数噬菌体展示方法已经使用丝状噬菌体，但是λ形噬菌体展示系统(WO 95/34683；US 5,627,024)、T4噬菌体展示系统(Ren等人，Gene，215：439(1998)；Zhu等人，Cancer Research，58(15)：3209-3214(1998)；Jiang等人，Infection&Immunity，65(11)：4770-4777(1997)；Ren等人，Gene，195(2)：303-311(1997)；Ren，Protein Sci.，5：1833(1996)；Efimov等人，Virus Genes，10：173(1995))和T7噬菌体展示系统(Smith和Scott，Methods in Enzymology，217：228-257(1993)；U.S.5,766,905)也是已知的。

其他的改进增强了展示系统从肽文库中筛选与选定靶分子结合的肽及展示功能性蛋白质的能力，所述功能性蛋白质具有筛选这些蛋白质期望特性的潜力。已经开发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置(WO 98/14277)，而且噬菌体展示文库已经用于分析和控制生物分子相互作用(WO 98/20169；WO 98/20159)和受约束螺旋肽的特性(WO 98/20036)。WO 97/35196描述了分离亲和配体的方法，其中使噬菌体展示文库接触其中配体将结合靶分子的一种溶液和其中亲和配体将不会结合靶分子的第二种溶液，以选择性分离能结合的配体。WO 97/46251描述了一种方法，即用亲和纯化的抗体生物淘选随机噬菌体展示文库，然后分离结合的噬菌体，随后使用微量板的孔进行生物淘选过程以分离高亲和力结合的噬菌体。已经报道了金黄色葡萄球菌蛋白A作为亲和标签的用途(Li等人(1998)Mol Biotech.，9：187)。WO 97/47314描述了底物扣除文库用于区别酶特异性的用途，其中使用组合文库，其可以是噬菌体展示库。WO 97/09446描述了使用噬菌体展示选择适用于洗涤剂的酶的方法。美国专利5,498,538、5,432,018和WO 98/15833中描述了选择特异结合的蛋白质的其它方法。

产生肽文库和筛选这些文库的方法还于美国专利5,723,286、5,432,018、5,580,717、5,427,908、5,498,530、5,770,434、5,734,018、5,698,426、5,763,192和5,723,323中公开。

抗体

在本发明的一些实施方案中，在个体中治疗黑色素瘤的PAK1抑制剂是结合PAK1的分离的抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化的。在本发明的进一步的方面中，抗PAK1抗体或抑制PAK1功能的抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、ScFv、双抗体，或F(ab')₂片段。在另一个实施方案中，所述抗体是全长抗体，例如，完整IgG1”抗体或如本文定义的其它抗体种类或同种型。

在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体和/或结合多肽的结合亲和力和/或其他生物性质。抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体可以通过将合适的修饰引入编码抗体和/或结合多肽的核苷酸序列或通过肽合成而制备。此类修饰包括，例如，在抗体和/或结合多肽的氨基酸序列内进行残基的删除和/或插入和/或置换。可以进行删除、插入和置换的任何组合，以得到最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征，例如靶标结合。

在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体和/或结合多肽变体。用于置换诱变的目的位点包括HVRs和FRs。氨基酸置换可以引入至目的抗体和/或结合多肽内，并且就所需活性例如保留/改善的抗原结合、减少的免疫原性或改善的ADCC或CDC，筛选产物。

一类置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，选择用于进一步研究的所得变体将具有相对于亲本抗体在一些生物性质上的改变(例如改善)(例如增加的亲和力、减少的免疫原性)，和/或将基本上保留亲本抗体的一些生物性质。示例性置换变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文描述的技术，方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并且将变体抗体展示在噬菌体上且筛选特定生物活性(例如结合亲和力)。

改变(例如置换)可以在HVRs中作出，例如以改善抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点”(即，由在体细胞成熟过程中高频率发生突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)))和/或SDRs(a-CDRs)中进行，测试所得到的变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库和从中再选择的亲和力成熟已在例如Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人，编辑，Human Press，Totowa，NJ，(2001).)中描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任何一种(例如易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变)，将多样性引入到选择用于成熟的可变基因内。随后构建二级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR指导的方法，其中几个HVR残基(例如一次4-6个残基)被随机化。涉及抗原结合的HVR残基可以，例如使用丙氨酸筛选诱变或建模，而被特异地鉴定。CDR-H3和CDR-L3尤其常被作为靶标。

在某些实施方案中，置换、插入或删除可以在一个或多个HVRs内发生，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，基本上不减少结合亲和力的保守改变(例如如本文提供的保守置换)可以在HVRs中作出。此类改变可以在HVR“热点”或SDRs之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。

组合疗法

本文所述的方法的PAK1抑制剂在治疗黑色素瘤的疗法中可以单独使用或与其他药物组合使用。例如，本文所述的PAK1抑制剂可以与至少一种包括另一PAK1抑制剂的另外治疗剂共同给药。在某些实施方案中，另外的治疗剂是化疗剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂可以是阿地白介素(Aldesleukin)、达卡巴嗪(Dacarbazine)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、易普利姆玛(Ipilimumab)，Proleukin(阿地白介素)、威罗菲尼(Vemurafenib)、Yervoy(易普利姆玛)，和/或Zelboraf(威罗菲尼)。2011年11月14日提交的PCT/EP2011/070008提供了在组合疗法中使用PAK1抑制剂的实例。

如上所述的这样的组合疗法包括组合给药(其中将两种或多种治疗剂包含在相同或分开的制剂)，和分开给药，在这种情况下，PAK1抑制剂的给药可以发生在给药另外的治疗剂和/或辅料之前、同时和/或之后。在一些实施方案中，用于在个体中治疗黑色素瘤的PAK1抑制剂与放射治疗组合。在一些实施方案中，用于在个体中治疗黑色素瘤的PAK1抑制剂与从个体手术切除黑色素瘤的全部或一部分组合。

在本发明的一些实施方案中，之前所述个体已经治疗过黑色素瘤，例如，使用抗癌疗法。在一个实施方案中，抗癌疗法是手术。在另一个实施方案中，在PAK1抑制剂给药之前、期间(例如，同时地)或者之后，可以用另外的抗癌疗法进一步治疗受试者。抗癌疗法的实例包括但不限于，手术、放射疗法(放疗)、生物疗法、免疫疗法、化学疗法、或这些疗法的组合。

给药途径

给药途径是按照已知的和公认的方法，例如通过单个或多个推注给药(bolus)，或以合适的方式在一段长时间内输注，例如，通过皮下的、静脉内的、腹膜内的、肌内的、动脉内的、病灶内的或关节内的途径注射或输注，局部施用，吸入或通过持续释放或延时释放的方法。在一些实施方案中，本发明提供了在个体中以PAK1抑制剂治疗黑色素瘤的方法，其中PAK1抑制剂静脉给药到个体。在其它实施方案中，本发明提供了在个体中以PAK1抑制剂治疗黑色素瘤的方法，其中将PAK1抑制剂局部给药到个体。

药物组合物

对于本发明的方法，本发明的治疗制剂通过将具有所需纯度的PAK1抑制剂与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington’sPharmaceutical Sciences，16th edition,Osol,A.Ed.(1980))混合而制备，以冻干制剂或水溶液的形式保存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸盐；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如锌-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN^TM，PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

本文的制剂还可根据所治疗的具体适应症所需而包含一种以上活性成分，优选具有互补活性但相互无不良影响的那些。例如，优选还提供免疫抑制剂。这样的分子适合以对于所需目的有效的量组合存在。

活性药物成分还可包埋在通过例如凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊(nanocapsules))中或在巨乳液(macroemulsion)中，分别为羟基甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。所述技术披露于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)中。

可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固态疏水性聚合物的半渗透性基质，其中基质以成形的制品形式(例如薄膜或微胶囊)存在。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(US3773919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯、降解性乳酸-羟乙酸共聚物如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装的抗体在体内长时间保持时，它们可能由于在37℃暴露于湿气而变性或聚集，导致生物学活性的损失和免疫原性可能改变。根据涉及的机制可以设计出用于稳定的合理策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫醇-二硫化物互换的分子间S-S键的形成，稳定化可以通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现。

在一些方面中，本发明提供了治疗黑色素瘤的包含PAK1抑制剂的组合物。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中与非癌性细胞，例如非癌性皮肤细胞相比，PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是突变的BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，黑色素瘤是突变的BRAF黑色素瘤和与非癌性细胞相比，PAK1在黑色素瘤中是过表达的和/或PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，本发明提供用于在哺乳动物中治疗黑色素瘤的包含PAK1抑制剂的组合物。在一些实施方案中，本发明提供用于在人中治疗黑色素瘤的包含PAK1抑制剂的组合物。

在一些方面中，本发明提供了PAK1抑制剂在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中与非癌性细胞，例如非癌性皮肤细胞相比，PAK1在黑色素瘤中是过表达的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤，其中PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，PAK1在黑色素瘤中是过表达的和PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，黑色素瘤是突变的BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，黑色素瘤是突变的BRAF黑色素瘤和与非癌性细胞相比，PAK1在黑色素瘤中是过表达的和/或PAK1在黑色素瘤中是扩增的。在一些实施方案中，本发明提供了PAK1抑制剂在制备用于在哺乳动物中治疗黑色素瘤的药物的用途。在一些实施方案中，本发明提供了PAK1抑制剂在制备用于治疗人类黑色素瘤的药物中的用途。

试剂盒

本发明也提供了用于本文所述的任一方法的试剂盒、药物、组合物和单位剂型。

本发明的试剂盒包括包含PAK1抑制剂的一个或多个容器(或单位剂型和/或制品)，并在一些实施方案中，还包括根据本文所述任一方法治疗黑色素瘤的使用说明。所述试剂盒可进一步包括对选择适合的个体或治疗的描述(例如，基于BRAF基因型选择)。在本发明的试剂盒中提供的说明通常写在标签或包装说明书(例如，包括在试剂盒中的纸页)上，但机器可读的说明(例如，磁盘或光存储盘上携带的说明)也是可接受的。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含另一种治疗剂。

本发明的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于，小瓶、瓶、罐、软包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供其它组分，如缓冲剂和说明信息。因此，本申请还提供了制品，其中包括小瓶(如密封小瓶)、瓶、罐、软包装等。

黑色素瘤的生物标记物和治疗

本发明提供了通过确定一种或多种黑色素瘤生物标记物的存在而鉴定适合以PAK1抑制剂治疗的人黑色素瘤患者的方法。在一些实施方案中，黑色素瘤的生物标记物是PAK1在黑色素瘤中的过表达、黑色素瘤中PAK1的扩增和/或黑色素瘤中野生型BRAF的存在。在一些实施方案中，通过与非癌性组织，例如非癌性皮肤组织相比较，确定PAK1的过表达。在一些实施方案中，在获得自个体的测试样品中检测生物标记物。在一些实施方案中，通过测试样品与参照样品的比较确定所述生物标记物的存在。

在一个实施方案中，本发明提供了鉴定适合以PAK1抑制剂治疗的人黑色素瘤患者的方法，通过确定黑色素瘤中PAK1的表达，其中与非癌性细胞相比，黑色素瘤中PAK1的过表达表明患者适合以PAK1抑制剂治疗。在一些实施方案中，与非癌性细胞相比，黑色素瘤中PAK1过表达约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％中任何一种表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗。在一些实施方案中，与非癌性细胞中PAK1的表达相比，PAK1过表达约1.5倍、2.0倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或10倍中任何一种表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗。确定PAK1表达的方法是本领域已知的。确定黑色素瘤中PAK1表达水平的方法的实例包括但不限于免疫组化、反相蛋白质阵列(RPPA)、定量PCR、免疫测定等。可以使用基因表达综合性数据库(GEO)与其他肿瘤和细胞比较PAK1的表达水平。

在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定适合以PAK1抑制剂治疗的人类黑色素瘤患者的方法，通过检测黑色素瘤中PAK1的扩增，其中黑色素瘤中PAK1基因的扩增表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗。在一些实施方案中，黑色素瘤中约2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10或大于10中任何一种的PAK1拷贝数表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗。确定基因扩增的方法是本领域已知的。例如，可以使用SNP阵列，如Affymetrix 500K SNP阵列分析来确定PAK1基因的拷贝数。

在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定适合以PAK1抑制剂治疗的人黑色素瘤患者的方法，通过检测黑色素瘤中BRAF基因型，其中黑色素瘤中野生型BRAF表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗。确定黑色素瘤中BRAF基因的基因型方法是本领域已知的；例如，可以使用标准的测序方法或使用KASP SNP基因分型系统(KBioscience)确定得自黑色素瘤的BRAF基因的核苷酸序列。

本发明提供了在患者中治疗黑色素瘤的方法，条件是所述患者已被发现具有黑色素瘤的生物标记物，所述生物标记物选自黑色素瘤中PAK1的过表达、黑色素瘤中PAK1的扩增和/或黑色素瘤中野生型BRAF的存在；所述方法包括给患者施用治疗有效量的PAK1抑制剂。在一些实施方案中，所述患者是人类患者。在上述实施方案的一些实施方案中，至少一种生物标记物是PAK1的过表达，其中与非癌性细胞相比，黑色素瘤中PAK1过表达约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％中任何一种。在一些实施方案中，与非癌性细胞中PAK1的表达相比，黑色素瘤中PAK1的表达是约1.5倍、2.0倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或10倍中任何一种。确定PAK1表达的方法是本领域已知的。确定黑色素瘤中PAK1表达水平的方法的实例包括但不限于免疫组化、反相蛋白质阵列、定量PCR、免疫测定等。可以使用基因表达综合性数据库(GEO)与其他肿瘤和细胞比较PAK1的表达水平。

在上述实施方案的一些实施方案中，至少一种生物标记物是黑色素瘤中PAK1的扩增，其中黑色素瘤中PAK1的拷贝数为约2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10或大于10中任何一种。确定基因扩增的方法是本领域已知的。例如，可以使用SNP阵列，如Affymetrix 500K SNP阵列分析来确定PAK1基因的拷贝数。

在上述实施方案中的一些实施方案中，至少一种生物标记物是黑色素瘤中BRAF基因型，其中所述患者具有包含野生型黑色素瘤的黑色素瘤。

在上述实施方案中的一些实施方案中，在以PAK1抑制剂治疗之前已经确定的患者中黑色素瘤生物标记物的存在。

本发明提供了在以PAK1抑制剂进行治疗的患者中调整黑色素瘤治疗的方法，其中确定了黑色素瘤中PAK1的表达。在一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，黑色素瘤中PAK1的过表达表明以PAK1抑制剂的治疗可以继续。在一些实施方案中，在以PAK1抑制剂进行治疗的患者中随时间的推移监测黑色素瘤中PAK1的表达。在一些实施方案中，黑色素瘤中PAK1的表达至少每天一次监测、至少每周一次监测、至少每月一次监测。在一些实施方案中，在以PAK1抑制剂进行治疗的患者中随时间的推移监测黑色素瘤中PAK1的表达。如果在以PAK1抑制剂治疗的过程中PAK1表达增加，给药于患者的PAK1抑制剂的量增加或保持不变。在一些实施方案中，给药于患者的PAK1抑制剂的量增加，直到PAK1的表达水平降低或不再检测到。如果在以PAK1抑制剂治疗的过程中PAK1的表达降低，给药于患者的PAK1抑制剂的量减少或保持不变。在一些实施方案中，在以PAK1抑制剂进行治疗的患者中随时间的推移监测黑色素瘤中PAK1的表达，其中以PAK1抑制剂的治疗继续进行，直到黑色素瘤中不再检测到PAK1的表达。

示例性实施方式

在一些实施方案中，本发明提供了在个体中治疗黑色素瘤的方法，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。在进一步的实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在又进一步的实施方案中，与非癌性皮肤细胞相比，PAK1在肿瘤中是过表达的。在任一上述实施方案的进一步的实施方案中，PAK1在肿瘤中是扩增的。在进一步的实施方案中，肿瘤中PAK1的拷贝数大于约2.5。

在任一上述实施方案的进一步的实施方案中，抑制剂是小分子、核酸或多肽。在一些实施方案中，所述小分子是PF-3758309。在一些实施方案中，所述小分子是式I的化合物。

在进一步的实施方案中，所述小分子是式I的化合物，且A是4-吲哚基、5-吲哚基、4-吲唑基、5-吲唑基、4-苯并咪唑基或5-苯并咪唑基；R^a、R^1a和R^1b独立地是氢或C_1-3烷基；R⁵是氢或C_1-6烷基；R⁶为氢、卤素或C_1-6烷基；并且，R⁷为环烷基，任选地被氟取代。

在任一上述实施方案的进一步的实施方案中，所述个体是人。

在任一上述实施方案的进一步的实施方案中，PAK1抑制剂与治疗剂组合使用。

本发明提供了PAK1抑制剂在个体中治疗黑色素瘤的用途。在所述用途的一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。

本发明提供了用于治疗黑色素瘤的包含PAK1抑制剂的组合物。在所述组合物的一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。在一些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。

本发明提供了PAK1抑制剂在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。在所述用途的一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。

本发明提供了用于治疗黑色素瘤的包含PAK1抑制剂的试剂盒，包含PAK1抑制剂和用于黑色素瘤治疗的说明书。在所述试剂盒的一些实施方案中，黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。

本发明提供了在个体黑色素瘤中抑制CRAF信号传导的方法，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。

本发明提供了抑制黑色素瘤中MEK信号传导的方法，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。

本发明提供了鉴定适合以PAK1抑制剂治疗的人类黑色素瘤患者的方法，包括确定黑色素瘤的BRAF基因型，其中黑色素瘤包含野生型BRAF表明该患者是适合以PAK1抑制剂治疗。

本发明提供了鉴定适合以PAK1抑制剂治疗的人类黑色素瘤患者的方法，包括确定黑色素瘤中PAK1的表达，其中与非癌性皮肤细胞相比，黑色素瘤中PAK1的过表达表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗。在所述方法的一些实施方案中，黑色素瘤中PAK1的过表达是非癌性皮肤细胞中PAK1表达的2.5倍。本发明提供了以PAK1抑制剂治疗人黑色素瘤患者的方法，包括：(a)根据黑色素瘤的BRAF基因型选择患者，其中黑色素瘤包含野生型BRAF表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗；和(b)给药所选患者治疗有效量的PAK1抑制剂。

本发明提供了以PAK1抑制剂治疗人类黑色素瘤患者的方法，包括：(a)根据黑色素瘤的PAK1表达水平选择患者，其中黑色素瘤中PAK1的过表达表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗；和(b)给药所选患者治疗有效量的PAK1抑制剂。在所述方法的一些实施方案中，黑色素瘤中PAK1的过表达是非癌性皮肤细胞中PAK1表达的2.5倍。

本发明提供了治疗人黑色素瘤患者的方法，包括给药所述选择的个体治疗有效量的PAK1抑制剂，其中所述黑色素瘤的基因型已被确定为野生型BRAF。

本发明提供了治疗人类黑色素瘤患者的方法，包括给药所述患者治疗有效量的PAK1抑制剂，其中所述黑色素瘤与非癌性皮肤细胞相比，已被确定过表达PAK1。在所述方法的一些实施方案中，黑色素瘤中PAK1的过表达是非癌性皮肤细胞中PAK1表达的2.5倍。

本发明提供了在以PAK1抑制剂进行治疗的患者中调整黑色素瘤治疗的方法，所述方法包括评估在黑色素瘤中PAK1的表达，其中黑色素瘤中PAK1的过表达表明对该个体的治疗进行调整，直到不再检测到PAK1的过表达。

在本说明书中公开的所有特征可以以任何组合方式组合。本说明书中公开的每一特征可以由提供相同的、等价的或类似的目的的备选特征代替。因此，除非另外清楚地表述，公开的每一特征仅是一类系列等价或相似特征的实例。

本发明的进一步详细描述将通过以下非限制性实施例进行举例说明。本说明书中所有引用文献的内容均引入本文作为参考。

实施例

下面的实施例意在仅仅是示例性的本发明，因此不应被认为是以任何方式限制本发明。以说明的方式而不是通过限制的方式提供下面的实施例和详细描述。

实施例1：黑色素瘤中升高的PAK1蛋白表达和基因组扩增。

为了确定在人黑色素瘤中PAK1失调的可能程度，使用高分辨单核苷酸多态性(SNP)阵列测定了取自87位黑色素瘤患者的原发肿瘤组织的DNA拷贝数变化。如先前公开的(Harvey PM等人，(2008)Genes Chromosomes Cancer,47(6):530-542)进行Affymetrix 500K SNP阵列分析、基因组DNA制备、芯片处理和数据分析以测量样本黑色素瘤组织中11q13(即隐藏PAK1基因的11号染色体区域)的拷贝数增加。为收集所匹配的肿瘤样本的表达阵列数据，从冷冻的肿瘤组织中提取RNA并将其应用于Affymetrix(Santa Clara，CA)HGU133基因表达微阵列。在此肿瘤组中PAK1扩增的频率为9％(87份样本中的8份具有拷贝数≥2.5)(图1A)。从42份黑色素瘤和细胞系样本纯化了RNA而且增加的PAK1拷贝数与mRNA表达相关(Pearson相关系数＝0.75；图1B)。失调的PAK1表达比单独通过基因组扩增预测的更频繁，从而表明在此适应症中，其他的转录或调节机制增加PAK1表达(Reddy SD等人,(2008)Cancer Res,68(20):8195-8200和de la Torre-Ubieta L等人,(2010)Genes Dev,24(8):799-813)。使用存放在基因表达综合性数据库(GSE4587)中的基因表达数据也证实了与正常皮肤组织相比，在黑色素瘤中PAK1升高的表达。有趣的是，优先地在缺乏BRAF致癌基因的活化突变的肿瘤中观察到PAK1基因扩增，对于BRAF野生型或突变体而言分别为22％与0％(P＝0.005，双侧t检验，图1B)。野生型与BRAF(V600E)或者BRAF基因(V600M)基因型之间PAK1的mRNA表达水平不同(分别为P＝0.006和P＝0.125，图1B)。综上所述，这表明PAK1可能是BRAF野生型黑色素瘤的亚类中的一种肿瘤促进“驱动”基因。

为了进一步评估在人黑色素瘤中PAK1失调的程度，通过一组独特的组织微阵列的免疫组化(IHC)染色确定了PAK1蛋白表达水平和亚细胞定位。简言之，从1993和2009年间切除的92例原发黑色素瘤获得了福尔马林固定、石蜡包埋的组织块和相应的病理报告(Oxford Radcliffe Hospitals,Oxford,UK)。黑色素瘤系列包括23份结节、3份恶性雀斑样痣、45份浅表扩散、3份促结缔组织增生、5份肢端雀斑样痣和13份不能分类的黑色素瘤标本。四份癌症分期为PT1期，17份为pT2期，28份为pT3期，35份为pT4期和8例不能准确分期。如先前(Bubendorf L等人，(2001)J Pathol，195(1):72-79)所述的组装组织微阵列(TMA)。从本地研究伦理委员会(C02.216)获准使用所有人体组织。如先前(Ong CC等人，(2011)PNAS,108(17):7177-7182)所述的进行免疫组化(IHC)。以0到3的等级分别对赘生细胞的细胞质和细胞核中PAK1的表达强度进行评分。将复制核之间的最高强度得分用作每位患者的得分。相同的病理学家对所有的情况进行评分，其不知晓临床数据。卡方检验用来评估分类变量之间的关联。先前已经证实PAK1抗体的稳健和选择性IHC反应性(Ong CC等人，(2011)PNAS，108(17):7177-7182)。在恶性黑色素瘤中，92例中的46例(50％)原发肿瘤样本呈PAK1表达阳性和所有病例中26％在恶性细胞中显示中度(2+)或高(3+)强度的染色(图1C，组III和IV；表1)。PAK1的核定位仅体现在非常小的比例的黑色素瘤中。用碱性磷酸酶标签和固红色原代替辣根过氧化物酶标签和棕色二氨基联苯观察到相同的结果。PAK1在正常皮肤的基底角质形成细胞中微弱表达，以及淋巴细胞和推测的朗氏细胞呈PAK1表达阳性(图1C，组IV)。总之，这些数据表明人黑色素瘤中PAK1DNA拷贝数、mRNA和蛋白表达广泛上调。

实施例2：原发黑色素瘤中PAK1过表达与BRAF突变负相关

鉴于黑色素瘤中BRAF和NRAS致癌基因突变的发生(Lee JH等人，(2011)Br J Dermatol,164(4):776-784)，将黑色素瘤组织进行BRAF(密码子600)和NRAS(密码子12、13、61和146)基因中已知的热点突变的基因分型。通过KASPar(KBioscience，Herts，England)和常规Sanger DNA测序方法确定了BRAF密码子600和NRAS密码子12、13、61和146的突变状态。分别针对86和84例肿瘤的BRAF(39例Val600Glu，1例Val600Lys和46例野生型)和NRAS(1例Gln61His，7例Gln61Lys，1例Gln61Lys+Gln61Arg+Leu59Ala，1例Gln61Leu，19例Gln61Arg，2例Gln61Arg+Gln61Lys和53例野生型)的基因型数据是可利用的，并且与此前(Lee JH等人,(2011)Br JDermatol,164(4):776-784)公开的皮肤黑色素瘤的突变频率的范围相一致。在不知晓临床病理详细描述的情况下对PAK1IHC染色进行评分且突变状态和结果总结于表1中。值得注意的是，与表达致癌的V600E或V600K突变体的黑色素瘤(40例肿瘤中的4例具有强IHC染色)相比，在BRAF野生型肿瘤中(46例肿瘤中的19例的PAK1强IHC染色为阳性)PAK1蛋白表达选择性失调。PAK1表达与BRAF突变之间的这种负相关性是统计学显著的(P<0.001，卡方10.702)。BRAF和NRAS突变并不相互排斥，而且具有任何突变的肿瘤的存在也与PAK1蛋白表达负相关(P＝0.004，卡方8.128)。当仅将样品二分为NRAS突变和非突变状态时，观察到相似的趋势，尽管不是统计学显著的(P＝0.45，卡方0.569)。PAK1蛋白表达与有丝分裂计数(P＝0.61Student’s T检验)、病理肿瘤(pT)分期(P＝0.14卡方)、Breslow厚度(P＝0.85Student’s T检验)或溃疡(P＝0.91卡方)之间没有显著关联。总之，这些结果提供证据表明PAK1失调与皮肤黑色素瘤强烈相关，所述皮肤黑色素瘤缺乏BRAF致癌突变并且确定了无有效靶向治疗的人黑色素瘤亚类。

表1.在BRAF野生型黑色素瘤中PAK1蛋白的过表达

实施例3：PAK1是BRAF野生型黑色素瘤细胞增殖所需要的

鉴于在BRAF为野生型的人黑色素瘤亚类中升高的PAK1表达的基因组学和组织学数据，为了解释PAK1对肿瘤细胞增殖的贡献，在一组黑色素瘤细胞系中检测了PAK1的表达和RNAi介导的PAK1击倒(knockdown)的效果。细胞系获得自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)，并在37℃和5％CO₂保持在含10％胎牛血清和4mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)或Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI1640)培养基中。用以前针对PAK1和PAK2击倒的效率和选择性(Ong CC等人，(2011)PNAS,108(17):7177-7182)表征的来自Dharmacon RNAi Technologies(Chicago，IL)的市售的小分子干扰RNA(siRNA)寡核苷酸双链体转染细胞系。使用CellTiter-Glo发光测定(Promega，Madison，WI)通过ATP含量评估细胞存活力并且结果表示为三次实验的平均值±标准偏差。在培养的无限增殖细胞系中也观察到表达野生型与突变型BRAF的黑色素瘤中增加的PAK1蛋白表达。细胞存活力分析表明537MEL、MeWo、SK-MEL23和SK-MEL30黑色素瘤细胞表达高水平PAK1蛋白，而与转染非靶向、阴性对照siRNA寡核苷酸的细胞相比，通过多种PAK1选择性siRNA寡核苷酸库瞬时击倒PAK1导致了细胞存活力的1.8倍至4.3倍的降低(P<0.0001；图2A)。此外，相对于BRAF^V600E细胞，PAK1抑制通常降低BRAF野生型黑色素瘤细胞的增殖(P<0.07，n＝14)，进一步支持了在该黑色素瘤亚型中PAK1作为增殖驱动器的作用(图2B)。为了更好地评估PAK1利于增殖的机制，在537MEL和SK-MEL23细胞中评估了PAK-依赖的细胞信号传导。在4℃用细胞提取缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)、1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)、磷酸酶抑制剂混合物1/2(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)和一片完全无EDTA的MiniTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)从细胞裂解物中制备蛋白提取物。对于Western印迹分析，通过4-12％SDS-PAGE分离蛋白并转移至硝酸纤维素膜(Millipore Corporation，Billerica，MA)。使用所示的第一抗体进行免疫印迹分析并使用第二抗体分析增强的化学发光(ECL)。PAK击倒显著地抑制MAPK途径的激活，如通过ERK和MEK的磷酸化所确定(图2C)。与该结果一致，作为PAK1去除的结果，细胞周期蛋白D1的水平(其对于调节细胞周期蛋白依赖的激酶和G1/S期进展是至关重要的)也降低了。使用反相蛋白质阵列(RPPA)磷酸蛋白组学平台进一步研究了BRAF野生型黑色素瘤细胞中PAK1信号传导。通过首先稀释所有样品到0.5mg/mL的终浓度，利用RPPA(Theranostics Health，LLC)分析蛋白裂解物。将样品稀释液一式两份印制到载玻片上，然后用主要针对特定的磷酸化或裂的解蛋白的抗体组进行免疫染色。这些抗体中的每一种先前均已经通过免疫印迹使用在适当的分子量的单一条带检测进行了针对磷酸化和蛋白特异性的广泛验证。通过鉴定每个样品的每个重复稀释曲线的斑点来确定每个终末点的强度值，其中在每个斑点经过背景扣除后，所述斑点在染色的线性动态范围内(玻片局部背景内且也对比仅用第二抗体染色的玻片)。每个值相对于来自SyproRuby(Invitrogen)染色的玻片的样品的总蛋白强度值进行归一化。通过log₂转换和线性比例缩放(z-分数转换)对RPPA数据进行处理以确保归一和线性。RPPA分析显示在BRAF野生型(SK-MEL23)而不是BRAF突变型(A375)的黑色素瘤细胞中，PAK1抑制后对MAPK、核因子-κB(NF-κB)和细胞骨架途径的降低的信号传导(图2D)。

已经显示PAK1可以使CRAF(Ser338)和MEK1(Ser298)(17，29-31)都磷酸化。因此，研究了BRAF野生型黑色素瘤细胞中PAK1触发MAPK途径活化的分子机制。因为针对MEK蛋白的Ser217/Ser221活化环位点而产生的磷酸-特异性抗体不能区分MEK1和MEK2，所以将MEK同工型从用对照或先前所述(HatzivassiliouG等人，(2010)Nature,464(7287):431-435)的PAK-选择性siRNA寡核苷酸转染的细胞进行免疫沉淀并通过用磷酸-MEK1/2(Ser217/Ser221)抗体的免疫印迹分析来检测MEK的活化。PAK击倒降低了在537MEL和SK-MEL23细胞中MEK1(图3A)和MEK2(图3B)的磷酸化。由于MEK1上的Ser298磷酸化位点在MEK2上不是保守的，两种MEK同工型的PAK-依赖的活化表明在BRAF野生型黑色素瘤细胞中，对CRAF的上游信号传导可能是MAPK途径调节的驱动器。将CRAF从用对照或先前所述(HatzivassiliouG等人，(2010)Nature,464(7287):431-435)的PAK-选择性siRNA寡核苷酸转染的细胞进行免疫沉淀并通过用磷酸-CRAF(Ser338)抗体的免疫印迹分析来检测CRAF的活化。Western分析表明，PAK去除降低了在Ser338(该激酶完全活化的关键残基)上的CRAF的磷酸化(图3C)。使用PF-3758309(一种目前正处于临床开发的PAKs抑制剂)(Murray BW等人，(2010)PNAS,107(20):9446-9451)和IPA-3(一种结合PAK1-3并防止Rho家族GTP酶激活的变构抑制剂)(Deacon SW等人，(2008)Chemistry&Biology,15(4):322-331)，也证实了CRAF(Ser338)磷酸化(图3D)和CRAF效应器信号传导(图3E)对PAK催化活性的依赖性。

通过研究PAK1对黑色素瘤细胞迁移的贡献进行了另外的功能丧失研究以分析在BRAF野生型的黑色素瘤细胞中PAK1的作用。简言之，用非靶向对照(NTC)或PAK1/2siRNA寡核苷酸转染WM-266-4黑色素瘤细胞72小时，并随后将汇合的WM-266-4黑色素瘤细胞划伤。记录划伤时的图像(深色阴影)和划伤28小时后的图像(明场)。在相对伤口密度上的差异是统计学上显著的(P<0.001；n＝3)，这揭示了在黑色素瘤细胞迁移中需要PAK1(图4)。总之，在BRAF野生型黑色素瘤细胞中PAK1阻断的功能性后果包括通过降低的CRAF活化和随后的MAPK途径信号传导的明显的抑制细胞作用。

实施例4：BRAF野生型黑色素瘤细胞对PAK和BRAF抑制的差示灵敏度

为了更仔细地研究敏感和不敏感的肿瘤类型中PAK信号传导作用的活性和细胞机制，使用SK-MEL23BRAF野生型和A375BRAF(V600E)细胞比较了PAK和BRAF的小分子抑制。为了进行途径调节分析，用5μMPF-3758309或0.2μM PLX-4720(一种BRAF抑制剂)处理细胞4小时，然后分析细胞裂解物的MAPK途径组分的磷酸化。如通过测量对催化活性关键的激酶环残基的ERK1/2和MEK1/2磷酸化所确定的(图5A)，PF-3758309的给药导致在SK-MEL23细胞(泳道2)而不是A375细胞(泳道5)的显著的MAPK途径调节。相比之下，对PLX-4720-介导的信号传导变化的分析显示在SK-MEL23细胞(泳道3)中只有轻微的对ERK1/2和MEK1/2磷酸化的抑制，而在相同的处理条件下在BRAF(V600E)细胞(泳道6)中有效抑制了MAPK活化。作为对照，在此实验中总的ERK1/2或MEK1/2蛋白水平没有差异。与之前的报告一致，将MEK1-Ser298确认为一个PAK特定的磷酸化位点，但Ser298磷酸化与BRAF(V600E)黑色素瘤细胞(泳道5)中MEK活化环磷酸化是不相关的。MEK1-Ser298的PAK1磷酸化的生物学后果目前还不十分清楚，但是已经表明，PAK1-MEK1信号传导可以通过细胞-细胞接触和粘附介导(Slack-Davis JK等人，(2003)J Cell Biol,162(2):281-291)。PAK信号传导也是通过在只有适度的内源性PAK1表达的BRAF(V600E)细胞中Flag-PAK1的异位表达所诱导。在A375细胞中升高的PAK1信号传导导致CRAF和MEK磷酸化的显著增加，其通过加入PF-3758309是可逆的(图5B)，这表明PAK1过表达的获得可能是克服黑色素瘤中对致癌性BRAF的依赖的另一机制(Johannessen CM等人，(2011)Nature,468(7326):968-972)。

为了确定PAK抑制剂是否降低野生型BRAF黑色素瘤细胞的细胞存活力，在用PF-3758309或(S)-N²-(1-(1H-吲哚-5-基)乙基)-N⁴-(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)-6-甲基嘧啶-2,4-二胺(I-007)、N²-((1H-吲哚-4-基)甲基)-N⁴-(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)-6-甲基嘧啶-2,4-二胺(I-054)和N²-((4-氯-1H-苯并[d]咪唑-5-基)甲基)-N⁴-(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)-N²-甲基-嘧啶-2,4-二胺(I-087)处理后，用CellTiter-Glo发光测定(Promega，Madison，WI)测定SK-MEL23和537MEL细胞。通过用所有测试的PAK抑制剂处理的PAK1抑制显著降低细胞增殖，这表明PAK信号传导的抑制是治疗BRAF野生型黑色素瘤的靶点(图6A和B)。

为了延长体外观察，使用肿瘤异种移植物模型评估了PAK小分子抑制剂的药效调节。从培养物中除去培养的SK-MEL-23、A2058.X1和A375.X1细胞，悬浮于Hank’s缓冲盐水溶液(HBSS)，与Matrigel(BD Biosciences，USA)1:1混合，并皮下植入到首次用于实验的(naive)雌性NCR裸鼠(TaconicFarm，NY)或Beige裸XID(Harlan Laboratories,CA)小鼠的右胁。将带有平均体积约250mm³的肿瘤的动物分为治疗组。按下列公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝0.5×(A×b²)中，其中“a”是最大肿瘤直径和“b”是垂直的肿瘤直径。肿瘤体积的结果表示为平均肿瘤体积±平均值的标准误差(SEM)。在研究结束时(EOS)的生长抑制百分率(％INH)以％INH＝100[(EOS媒介物EOS处理)/(EOS媒介物)计算。使用JMP软件(SAS研究所，Cary，NC)进行数据分析和使用Dunnett t检验生成p值。所有的实验程序符合美国生理学学会的指导原则，并由Genentech机构动物护理和使用委员会批准。建立肿瘤后，对动物给药盐水或PF-3758309(25mg/kg，腹膜内注射)，并在给药1小时后收集肿瘤。冷冻肿瘤并在干冰上使用小Bessman组织粉碎机(SpectrumLaboratories，Rancho Dominguez，CA)粉碎并在4℃用细胞提取缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)、1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)、磷酸酶抑制剂混合物1/2(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)以及一片完全无EDTA的MiniTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)制备蛋白提取物。随后通过4-12％SDS-PAGE分离蛋白，并转移至硝酸纤维素膜(MilliporeCorporation，Billerica，MA)进行指定抗体的免疫印迹。

PF-3758309处理导致SK-MEL23肿瘤中CRAF、MEK1/2和ERK1/2磷酸化的大幅减少(图7A)。在A2058.X1BRAF(V600E)肿瘤中，PF-3758309给药后没有观察到降低的CRAF(Ser338)磷酸化。也在21天有效性试验中评估了PF-3758309对BRAF野生型肿瘤生长和保持的效果(图7B和图8A-B)。如给药的最后一天所测量的，相对于媒介物组，以10、15和25mg/kgPF-3758309的处理显著损害了肿瘤生长(相对于对照组分别为74％、76％和91％的抑制)(Dunnett t检验，P<0.0001)。相比较而言，对于以强的RAF抑制剂体内处理的SK-MEL23肿瘤，观察到最小的抗肿瘤效果和CRAF磷酸化抑制(图9B)(Hoeflich KP,等人,(2009)Cancer Res,69(7):3042-3051)。此外，由于BRAF抑制，以PLX-4720BRAF抑制剂处理的BRAF突变体(A375)和野生型(SK-MEL23)细胞的磷酸蛋白组学分析表明这些黑色素瘤细胞亚型表现出不同的信号传导应答(图9A)。

总之，在BRAF野生型黑色素瘤异种移植物模型中，PF-3758309引起的MAPK途径失活的幅度与抗肿瘤有效性相关，并且这些数据支持了在此黑色素瘤亚型中干扰PAK信号传导可能具有治疗效果的结论(模型在图10中示出)。

Claims (33)

1.用于在个体中治疗黑色素瘤的方法，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中与非癌性皮肤细胞相比，PAK1在肿瘤中是过表达的。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中PAK1在肿瘤中是扩增的。

5.根据权利要求4所述的方法，其中肿瘤中PAK1的拷贝数大于约2.5。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述抑制剂是小分子、核酸或多肽。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述小分子是PF-3758309。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述小分子是式VII的化合物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述小分子是式VII的化合物，并且A是4-吲哚基、5-吲哚基、4-吲唑基、5-吲唑基、4-苯并咪唑基或5-苯并咪唑基；R^a、R^1a和R^1b独立地是氢或C_1-3烷基；R⁵是氢或C_1-6烷基；R⁶是氢、卤素或C_1-6烷基；并且，R⁷是任选地被氟取代的环烷基。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述个体是人。

11.根据权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述PAK1抑制剂与治疗剂组合使用。

12.PAK1抑制剂在个体中治疗黑色素瘤的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。

14.用于治疗黑色素瘤的组合物，包含PAK1抑制剂。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。

16.根据权利要求14或15所述的用途，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。

17.PAK1抑制剂在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。

19.用于治疗黑色素瘤的包含PAK1抑制剂的试剂盒，其包含PAK1抑制剂和用于黑色素瘤治疗的说明书。

20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述黑色素瘤是野生型BRAF黑色素瘤。

21.在个体的黑色素瘤中抑制CRAF信号传导的方法，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。

22.抑制黑色素瘤中MEK信号传导的方法，包括将黑色素瘤与治疗有效量的PAK1抑制剂接触。

23.鉴定适合以PAK1抑制剂治疗的人类黑色素瘤患者的方法，包括确定黑色素瘤的BRAF基因型，其中包含野生型BRAF的黑色素瘤表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗。

24.鉴定适合以PAK1抑制剂治疗的人类黑色素瘤患者的方法，包括确定黑色素瘤中PAK1的表达，其中与非癌性皮肤细胞相比，黑色素瘤中PAK1的过表达表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗。

25.根据权利要求24所述的方法，其中黑色素瘤中PAK1的过表达比非癌性皮肤细胞中PAK1的表达高X％。

26.以PAK1抑制剂治疗人类黑色素瘤患者的方法，包括：

(a)根据黑色素瘤的BRAF基因型选择患者，其中包含野生型BRAF的黑色素瘤表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗；和

(b)给药所选患者治疗有效量的PAK1抑制剂。

27.以PAK1抑制剂治疗人类黑色素瘤患者的方法，包括：

(a)根据黑色素瘤的PAK1表达水平选择患者，其中在黑色素瘤中PAK1的过表达表明该患者适合以PAK1抑制剂治疗；和

(b)给药所选患者治疗有效量的PAK1抑制剂。

28.根据权利要求27所述的方法，其中黑色素瘤中PAK1的过表达比非癌性皮肤细胞中PAK1的表达高2.5倍。

29.治疗人类黑色素瘤患者的方法，包含给药所选个体治疗有效量的PAK1抑制剂，其中已经确定黑色素瘤的基因型为野生型BRAF。

30.治疗人类黑色素瘤患者的方法，包含给药所述患者治疗有效量的PAK1抑制剂，其中已经确定与非癌性皮肤细胞相比，黑色素瘤过表达PAK1。

31.根据权利要求30所述的方法，其中黑色素瘤中PAK1的过表达比非癌性皮肤细胞中PAK1的表达高2.5倍。

32.在以PAK1抑制剂进行治疗的患者中调整黑色素瘤治疗的方法，所述方法包括评估黑色素瘤中PAK1的表达，其中黑色素瘤中PAK1的过表达表明对该个体的治疗进行调整，直到不再检测到PAK1的过表达。

33.如本申请描述的发明。