KR101730595B1 - Pak4 억제제를 유효성분으로 포함하는 미백 및 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PAK4(p21-activated kinase 4)의 활성 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 PAK4는 멜라닌 세포에서 α-MSH 또는 UVB에 의해 유도된 멜라닌 생성을 CREB 및 Wnt/β-카테닌 신호전달경로를 통해 촉진한다. 본 발명에 따라 멜라닌 세포에서 PAK4의 활성 또는 발현을 억제하면 멜라닌의 생성을 효과적으로 저해할 수 있다. 본 발명의 PAK4의 활성 또는 발현 억제제는 피부 미백제 또는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료제로 개발될 수 있다.

Description

PAK4 억제제를 유효성분으로 포함하는 미백 및 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료용 조성물{Composition for Skin Whitening and Treating Disorders of Melanin Hyperpigmentation Comprising p21-Activated Kinase Inhibitor As Active Ingredient}
본 발명은 PAK4(p21-activated kinase 4) 억제제의 피부 미백 및 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 용도에 관한 것이다.
PAK(p21-activated kinase)는 다양한 세포과정에 관여하는 중요한 조절자이다. PAK는 두 개의 그룹으로 나눌 수 있는데, 그룹 I은 PAK 1-3으로 구성되며 그룹 II는 PAK 4-6로 구성된다(Arias-Romero 및 Chernoff, 2008). PAK 동형단백질 중 PAK4는 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)의 재배치에 중요한 역할을 하여 세포의 형태나 운동성에 큰 영향을 주며 각질형성세포 성장인자(keratinocyte growth factor)의 항-세포사멸효과(anti-apoptotic effect)를 매개하는 것으로 알려져 있다(Abo et al, 1998 및 Lu et al, 2003). PAK4는 각질형성세포 성장인자 수용체와 직접 결합하여 산화스트레스(oxidant stress)로부터 폐상피세포(lung epithelial cell)를 보호하며 표피 각질형성세포(epidermal keratinocyte)가 분화되는 과정에서 활성화되어 표피 각질형성세포를 보호하는 것으로 보고되었으나 멜라닌세포(melanocyte)에서 멜라닌 생성(melanogenesis)에 어떠한 역할을 하는지 알려지지 않았다(Lu et al, 2003).
멜라닌 색소(melanin pigment)는 멜라닌세포에서 생성된 후 각질형성세포로 이동하여 자외선 조사(UV radiation)과 같이 해로운 환경적 자극으로부터 피부를 보호한다. 태양의 자외선은 파장에 따라 320 - 400nm 영역의 UVA; 280 - 320nm영역의 UVB; 및 200 - 280nm영역의 UVC로 분류할 수 있으며 그 중 UVB는 멜라닌의 생성을 유발한다(Choi et al, 2010; Maeda and Hatao, 2004; Miyamura et al, 2011; Wolber et al, 2008).
UVB는 각질형성세포와 멜라닌세포의 상호작용을 통하는 복잡한 공정을 통하여 멜라닌의 생성을 유도하거나, p38 MAPK-의존 인산화에 의한 CREB(cAMP-response element-binding protein)의 Ser133의 인산화를 통해 멜라닌 생성의 주 조절자인 MITF(Microphthalmia-associated transcription factor)의 발현을 증가시키는 방법을 통해 멜라닌의 생성을 증가시킨다(Cui et al, 2007; Lin and Fisher, 2007; Yamaguchi 및 Hearing, 2009; 및 Saha et al, 2006). UVB에 노출되면 각질형성세포는 측분비인자(paracrine factor)를 분비하여 멜라닌세포의 멜라닌 생성을 촉진하는데 분비되는 측분비인자들 중 멜라닌 생성을 자극하는 가장 중요한 작용물질(agonist)은 α-멜라닌세포자극호르몬(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)이다. α-MSH에 의해 유도되는 멜라닌 생성(α-MSH-induced melanogenesis)에 관여하는 신호전달경로는 cAMP/PKA 신호전달 경로이다(Ao et al, 1998; Kreiner et al, 1973; 및 Wong 및 Pawelek, 1973). 연구결과에 따르면, α-MSH가 세포내 cAMP의 농도를 증가시키면 순차적으로 cAMP가 PKA의 조절 서브유닛(regulatory subunit)으로부터 분리되고 이에 의하여 PKA의 촉매 서브유닛이 세포핵으로 이동하여 CREB의 Ser133을 인산화를 유도한다(Gonzalez 및 Montminy, 1989). 상기 과정으로 인산화된 CREB는 MITF에 결합하여 MITF를 활성화시킴으로 티로시나아제(tyrosinase), 티로시나아제 관련 단백질-1(tyrosinase-related protein-1, TRP-1) 및 티로시나아제 관련 단백질-2(tyrosinase-related protein, TRP-2)와 같은 멜라닌 생성효소(melanogenic enzyme)의 발현을 유도한다(Bertolotto et al, 1998 및 Price et al, 1998). MITF는 α-MSH 유도 멜라닌 생성에 중요한 역할을 하며 복잡한 기전에 의해 단백질의 발현 및 활성화가 조절된다. CREB 뿐만 아니라, LEF-1(lymphoid-enhancing factor-1), PAX3 및 SOX10 또한 전사의존방법을 통하여 MITF의 발현을 조절한다(Bondurand et al, 2000; Lee et al, 2000; Potterf et al, 2000; Takeda et al, 2000; Watanabe et al, 1998 및 Verastegui et al, 2000).
Wnt/β-카테닌에 의한 신호전달 물질은 티로시나아제의 프로모터(promoter)에 결합하여 티로시나아제의 발현을 촉진하는 MITF/β-카테닌/LEF-1 복합체의 생성을 유도함으로서 멜라닌 생성에 기여한다(Schepsky et al, 2006). 상기 신호전달에 의한 멜라닌 생성에는 β-카테닌 Ser167의 PKA 의존 인산화에 의한 β-카테닌의 안정화를 필요로 하며 상기 과정에서 β-카테닌 Ser657도 PKA 의존 인산화에 의해 인산화 된다는 결과가 보고되었다(Bellei et al, 2011; Hino et al, 2005, 및 Li et al, 2012).
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
Abo A, et al (1998) EMBO J 17:6527-40. Akiu S, et al (1991) Nihon Hifuka Gakkai Zasshi 101:609-13. Ao Y, et al (1998) Exp Cell Res 244:117-24. Arias-Romero, et al (2008) Biol Cell 100:97-108. Bellei B, et al (2011) Pigment Cell Melanoma Res 24:309-25. Bertolotto C, et al (1998) J Cell Biol 142:827-35. Bondurand N, et al (2000) Hum Mol Genet 9:1907-17. Callow MG, et al (2002) J Biol Chem 277:550-8. Choi W, et al (2010) J Invest Dermatol 130:1685-96. Cui R, et al (2007) Cell 128:853-64. Damsky WE, et al (2011) Cancer Cell 20:741-54. Dong L, et al (2010) Cancer Res 70:3547-56. Gonzalez GA, Montminy MR (1989) Cell 59:675-80. Hino S, et al (2005) Mol Cell Biol 25:9063-72. Kreiner PW, et al (1973) J Biol Med 46:583-91. Lee M, et al (2000) J Biol Chem 275:37978-83. Li Y, et al (2012) Biochim Biophys Acta 1823:465-75. Lin JY, Fisher DE (2007) Nature 445:843-50. Liu C, et al (2002) Cell 108:837-47. Lu Y, et al (2003) J Biol Chem 278:10374-80. Maeda K, Hatao M (2004) A. J Invest Dermatol 122:503-9. Miyamura Y, et al (2011) Pigment Cell Melanoma Res 24:136-47. Murray BW, et al (2010) Proc Natl Acad Sci U S A 107:9446-51. Nonaka D, et al (2008) Am J Surg Pathol 32:1291-8. Park MH, et al (2013) Oncogene 32:2475-82. Potterf SB, et al (2000) Hum Genet 107:1-6. Price ER, et al (1998) J Biol Chem 273:17983-6. Saha B, et al (2006) Pigment Cell Res 19:595-605. Saito H, et al (2003) Pigment Cell Res 16:261-5. Schepsky A, et al (2006) Mol Cell Biol 26:8914-27. Shin J, et al (2012) J Am Acad Dermatol 67:717-26. Tabusa H, et al (2013) Mol Cancer Res 11:109-21. Takeda K, et al (2000) J Biol Chem 275:14013-6. Taylor CT, et al (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97:12091-6. Verastegui C, et al (2000) J Biol Chem 275:30757-60. Watanabe A, et al (1998) Nat Genet 18:283-6. Wellbrock C, et al (2008) PLoS One 3:e2734. Widlund HR, Fisher DE (2003) Oncogene 22:3035-41. Wolber R, et al (2008) Pigment Cell Melanoma Res 21:487-91. Wong G, Pawelek J (1973) Nat New Biol 241:213-5. Xie S, Price JE, et al (1997) Oncogene 15:2069-75. Yamaguchi Y, Hearing VJ (2009) Biofactors 35:193-9.
본 발명자들은 멜라닌 생성 과정 중의 신호전달 경로에 관여하는 단백질들의 작용 기전을 규명하고 이를 기초로 효과적인 미백제를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, PAK4(p21-activated kinase 4)가 α-MSH 및 UVB에 의해 유도된 멜라닌 생성 과정에서 촉진자로서 역할을 수행하며, PAK4의 활성 또는 발현을 억제하면 멜라닌의 합성이 저해된다는 사실을 실험적으로 증명하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 PAK4 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 PAK4 활성 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 멜라닌 생성을 저해하는 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 PAK4(p21-activated kinase 4)의 활성 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 PAK4의 활성 또는 발현 억제제는 멜라닌 세포에서 멜라닌의 생성을 억제한다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기 PAK4의 활성 억제제는 PAK4 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드모사체, 기질유사체, 앱타머, 항체, 또는 단백질 인산화 효소 A(protein kinase A) 억제제이다.
본 발명에서 PAK4 단백질에 특이적으로 결합하여 이 단백질의 활성을 억제할 수 있는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. PAK4 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상기 PAK4 단백질에 대한 항체는 상업적으로 시판되는 항체를 구입하여 사용할 수 있다.
상기 항체는 PAK4 단백질에 특이적이고 직접적으로 결합하여 PAK4 단백질의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에서 PAK4 단백질에 특이적으로 결합하여 이의 활성을 억제할 수 있는 펩타이드는 당업계에 공지된 통상의 방법, 예를 들어 파아지 디스플레이 방식으로 얻을 수 있다(Smith GP, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface". Science 228 (4705):13151317(1985); Smith GP, Petrenko VA, "Phage display". Chem. Rev. 97(2):391410(1997)).
본 발명에서 PAK4 단백질에 특이적으로 결합하여 이의 활성을 억제할 수 있는 화합물은 PAK4 활성 특이적 억제제가 바람직하고, 예를 들어, 공지된 PAK4 활성 억제 화합물인 PF-3758309 [(S)-N-(2-(디메틸아미노)-1-페닐에틸)-6,6-디메틸-3-((2-메틸티에노[3,2-d]피리미딘-4-일)아미노)-4,6-디하이드로피롤로[3,4-c]피라졸-5(1H)-카르복사마이드)], 또는 LCH-7749944 [N2-(3-메톡시페닐)-N4-((테트라히드로푸란-2-일)메틸) 퀴나졸린-2,4-디아민](Cancer Lett. 2012 Apr 1;317(1);24-32)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 PF-3758309은 PAK4의 인산화 도메인에서 ATP-경쟁적 억제를 통한 효소 활성 억제 기능이 확인되었다.
본 발명에서 PAK4 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드 모방체(Peptide mimetics)는 PAK4 단백질의 특정 도메인에 결합하여 이 단백질의 활성을 억제한다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합(Benkirane, N., et al. J.Biol. Chem., 271:33218-33224, 1996)과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 모방체(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 모방체일 수 있다. 펩타이드 모방체는 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2) 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체(Park, B. W. et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) 또는 수용성 수용체(Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997)와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다(Wrighton, N. C. et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997).
본 발명에서 PAK4 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고 뉴클레오티드 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.
본 발명에서 PKA 단백질 활성 억제제는 바람직하게는 단백질 인산화 효소 A(protein kinase A) 억제제이고, 보다 바람직하게는 H89 화합물 {N-[2-[[3-(4-브로모페닐)-2-프로페닐]아미노]에틸]-5-이소퀴놀린술폰아미드}를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 H89 화합물은 PKA의 촉매 도메인의 ATP 결합부위에 경쟁적으로 결합하여 PKA의 활성을 억제한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 PAK4 발현 억제제는 PAK4 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 또는 라이보자임이다.
본 명세서에서 용어 "안티센스 뉴클레오타이드”란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 서열은 PAK4 mRNA에 상보적이고 PAK4 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, PAK4 mRNA의 번역, 세포질내로의 이동(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다. 상기 안티센스 뉴클레오타이드는 이의 활성을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55(1995)). 안티센스 핵산의 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 다양한 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오타이드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 공지되어 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 디자인은 당업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다(Weiss, B. (ed.): Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA : Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997; Weiss, B., et al., Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes. Cell. Mol. Life Sci., 55:334-358(1999).
본 발명에서 PAK4 발현 억제제는 PAK4 유전자의 염기서열에 상보적인 서열을 포함하는 shRNA 또는 siRNA이다.
본 명세서에서 용어 “shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)”는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 나타내며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 침묵(silence)시키는 데 이용될 수 있다. shRNA는 세포 도입용 벡터를 이용하며 shRNA를 발현할 수 있는 U6 프로모터를 주로 이용한다. 이러한 벡터는 항상 딸세포로 전달되어 유전자 침묵이 유전될 수 있도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작(machinery)인 siRNA로 분해되어 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합된다. 상술한 복합체는 이에 결합된 siRNA에 상응하는(matched) mRNA에 결합하여 분해시킨다. shRNA는 RNA 폴리머라제 Ⅲ에 의해 전사되며, 포유동물 세포에서 shRNA 생산은 세포가 shRNA를 바이러스 공격으로 인식하여 방어 수단을 찾는 것처럼 인터페론 반응을 야기시킬 수도 있다.
본 발명에서 용어 “siRNA(small interference RNA)”는 RNA 방해 (RNA interference) 또는 유전자 침묵(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹-다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자 치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005).
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 상보적은 100% 상보적인 경우 뿐만 아니라 불완전한 상보성도 포괄하는 의미이며, 바람직하게는 90%의 상보성, 보다 바람직하게는 98%의 상보성, 가장 바람직하게는 100%의 상보성을 의미한다. 본 명세서에서 100% 상보성을 표현하는 경우에는 완전 상보적(completely complementary)으로 특별하게 기재된다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 보다 더 바람직하게는 20 내지 70 염기이다.
상기 siRNA는 PAK4 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성될 수 있다.
siRNA 말단 구조는 PAK4 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3’-말단 돌출 구조와 5’-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프(stem-and-loop) 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 동물 실험에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
본 발명의 PAK4 발현 억제제는 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 siRNA 이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물의 유효성분인 PAK4 유전자에 특이적으로 결합하는 RNAi(RNA interference) 분자는 유전자 캐리어에 삽입되어 있다.
본 발명의 유전자 캐리어는 플라스미드, 재조합 아데노바이러스(Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-
1073(1989)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV)( LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)), 레트로바이러스(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀 또는 니오좀이며, 가장 바람직하게는 재조합 렌티바이러스이다.
본 발명의 피부 미백용 조성물은 화장품학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 화장품학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 로션, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림, 로션, 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품학적 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 PAK4(p21-activated kinase4)의 활성 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 PAK4의 활성 또는 발현 억제제는 상기 피부 미백용 조성물에서 설명된 내용과 동일하므로 중복하여 설명하지 않는다.
본 명세서에서 용어 "멜라닌 색소의 과다침착(hyperpigmentation)"은 피부 또는 손발톱의 특정 부위에서 멜라닌의 과도한 증가에 의해 다른 부위에 비해 검게 또는 어둡게 되는 것을 의미한다. 상기 멜라닌 색소 과다침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광 흑색증(solar lentigines) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물이 멜라닌 색소 과다 침착 질환을 치료 또는 예방을 위해 적용되는 점을 감안하면, 피부에 국소적으로 도포되어 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부외용 제형을 갖는다. 피부외용 제형은 특별히 한정되지 않으며 바람직하게는 파우더, 젤, 연고, 크림, 로션, 액제 또는 에어로졸 제형이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 멜라닌 생성 저해 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 후보물질과 세포를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 세포에서 PAK4 (p21-activated kinase 4) 단백질 수준 또는 PAK4 단백질 코딩 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 세포는 멜라닌 세포이다.
상기 후보물질과 접촉된 세포에서 PAK4 단백질 수준 또는 PAK4 단백질 코딩 유전자의 mRNA 수준이 후보물질과 접촉전의 수준과 비교하여 감소한 경우 상기 후보물질은 멜라닌 생성 저해 활성을 갖는 물질로 인정된다.
상기 PAK4 단백질 코딩 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 PAK4 단백질의 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블롯팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 PAK4(p21-activated kinase 4)의 활성 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 PAK4는 멜라닌 세포에서 α-MSH 또는 UVB에 의해 유도된 멜라닌 생성을 CREB 및 Wnt/β-카테닌 신호전달경로를 통해 촉진한다. 본 발명에 따라 멜라닌 세포에서 PAK4의 활성 또는 발현을 억제하면 멜라닌의 생성을 효과적으로 저해할 수 있다. 본 발명의 PAK4의 활성 또는 발현 억제제는 피부 미백제 또는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료제로 개발될 수 있다.
도 1은 생쥐의 피부와 B16 흑색종 세포에서 발현된 PAK 동형 단백질들을 보여준다.
패널 (a)는 HRM-2 생쥐의 피부를 PAK1, PAK2, PAK4 또는 PAK6(녹색), SOX10(붉은색)에 대해 염색한 결과를 보여준다. SOX10은 멜라닌 세포에 특이적으로 발현하는 단백질로 멜라닌 세포를 표시하는 목적으로 사용하였다. PAK3/SOX10의 공동면역염색과 PAK5/SOX10의 공동면역염색은 인접한 슬라이드에서 수행하였다. 흰색 화살표는 SOX10 양성(positive) 세포를 의미하며, 핵은 파란색의 DAPI로 염색하였으며 기준자(scale bar)는 5이다.
패널 (b)는 B16 흑색종 세포에서 PAK 동형단백질의 발현을 면역블로팅으로 확인한 것이다. 양성 대조군으로 Myc이 결합된 외인성 PAK 동형단백질을 사용하였다.
도 2는 PAK4의 활성 또는 발현을 억제하였을 때 α-멜라닌세포자극호르몬(α-MSH)에 의해 유도된 멜라닌 생성을 저해하는 결과를 보여준다.
패널 (a) 및 (b)는 α-MSH이 시간 및 농도 의존적으로 PAK4 인산화를 증가시키는 결과를 보여준다.
패널 (c) 및 (d)는 4시간 동안 PF3758309을 전 처리한 후 15분 동안 α-MSH 자극을 수행한 세포의 면역블로팅 및 면역형광의 정량적 측정결과를 보여준다. 기준자(scale bar)는 10이다.
패널 (e)는 하루 동안 PF3758309을 전 처리한 후 3일 동안 α-MSH 자극을 수행한 세포의 멜라닌 함유량을 정량적으로 측정한 결과를 보여준다. 측정값은 3번의 반복 실험을 통해 산출하였고 평균값± 표준오차로 표시하였으며 *P<0.01 이다.
패널 (f)의 왼쪽 패널에는 siRNA 처리된 세포를 α-MSH로 3일 동안 자극한 후 멜라닌의 함유랑을 측정한 결과를 보여준다. 측정값은 3번의 반복 실험을 통해 산출하였고 평균값± 표준오차로 표시하였으며 *P<0.01이다. 오른쪽 패널에는 면역블로팅을 통해 PAK4의 발현 억제 결과를 보여준다.
도 3은 PAK4의 활성화를 억제했을 때 UVB에 의해 유도된 멜라닌 생성을 저해하는 결과를 보여준다.
패널 (a)는 본 실험의 전체적인 개요를 보여준다. HRM-2 생쥐에 PAK4의 억제제인 PF3758309가 함유된 크림을 매일 도포하고 크림이 흡수되면 표시된 양과 시간에 따라 UVB 자외선에 노출시켰다. 마지막 16일 차에 UVB 자외선노출 후 8 시간이 지나 생쥐를 희생시키고 분석을 수행하였다.
패널 (b)는 실험 생쥐로부터 채취된 피부의 위치를 도식화하여 보여준다.
패널 (c)는 HRM-2 생쥐의 피부를 pPAK4 및 SOX10로 공동염색한 결과를 보여준다. SOX10은 멜라닌 세포에 특이적으로 발현하는 단백질로 멜라닌 세포를 표시하는 목적으로 사용하였다. pPAK4는 녹색으로 SOX10은 붉은색 및 하얀색 화살표로 표시되었다. 노란색 화살표는 pPAK4 및 SOX10의 양성 세포를 보여준다. 기준자(scale bar)는 10이다.
패널 (d)는 SOX10 양성 세포 중에서 pPAK4가 염색된 세포의 수를 세어 전체 SOX10 양성 멜라닌세포에 대하여 퍼센트(%)로 산출한 결과(표본 수=60)를 보여주며 *P<0.01이다.
패널 (e)는 시간에 따른 HRM-2 생쥐피부의 멜라닌색소 침착의 변화를 정량적으로 비교한 결과를 보여준다. 피부의 멜라닌색소 침착 정도는 L값으로 표시되었다.
도 4는 PAK4의 발현 및 활성화 억제가 pCREB, CREB, MITF 및 티로시나아제의 활성 및 단백질 양을 억제하는 결과를 보여준다.
패널 (a)는 B16 흑색종 세포(왼쪽) 및 HEM(오른쪽)세포에 siRNA를 처리하고 3일 후α-MSH으로 자극한 후 면역블로팅을 수행한 결과를 보여준다.
패널 (b)는 B16 흑색종 세포를 siRNA, MITF-luc 리포터(reporter) 및 레닐라(renilla) 플라스미드로 형질전환 하고 2시간 동안 H89로 처리한 후 4시간 동안 α-MSH으로 자극하고 리포터 분석(reporter assay)을 수행한 결과이며 *P<0.01이다.
패널 (c)는 본 실험의 전체적인 개요를 보여준다. 세포를 22시간 동안 PF3758309으로 처리하고 α-MSH으로 표시된 시간동안 자극한 후 제시된 단백질의 활성도 또는 발현 결과를 보여준다.
패널 (d)와 (e)는 PF3758309가 처리된 세포를 α-MSH으로 자극한 후 측정하고자 하는 단백질에 대하여 CREB와 pCREB는 15분 후; MITF는 4시간 후; 또는 티로시나아제는 2일 후에 수확하고 면역블로팅을 수행한 결과를 보여준다.
패널 (f)는 도 3의 결과의 실험에서와 같은 방법으로 처리한 HRM-2 생쥐피부에 CREB(녹색), MITF(녹색), 티로시나아제(녹색) 및 SOX10(붉은색)에 대한 면역조직화학분석을 수행한 결과를 보여준다. 흰색 화살표는 SOX10 양성 세포를 보여주며 노란색 화살표는 두 개의 단백질이 동시에 양성인 세포를 보여준다. 기준자는 10이다. 아래쪽 패널에는 SOX10양성 세포의 pPAK4 형광을 정량적으로 측정한 결과이며 *P<0.01이다.
도 5는 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 생성에서 PAK4-β 카테닌 신호전달에 관한 결과를 보여준다.
패널 (a)는 제시된 농도와 시간동안 α-MSH을 세포에 처리한 후 면역블로팅을 수행한 결과를 보여준다.
패널 (b)는 PF3758309을 6시간 동안 처리한 후 α-MSH으로 15분 동안 자극한 세포(위쪽 패널) 및 siRNA를 처리하고 3일 후 α-MSH으로 자극한 세포(아래쪽 패널)에 대하여 면역블로팅을 수행한 결과를 보여준다.
패널 (c)는 pβ-카테닌S675(녹색) 및 SOX10(붉은색)에 대한 면역염색결과(위쪽 패널)를 보여준다. 기준자는 10이다. 아래쪽 패널은 SOX10 양성세포에서 pβ-카테닌S675을 면역염색한 후 결과를 정량적으로 분석한 결과를 보여준다.
패널 (d)는 siRNA로 처리한지 3일된 B16 흑색종 세포(왼쪽 패널)와 HEM 세포(오른쪽 패널)에 대하여 MG132 및 사이클로헥사마이드(cycloheximide)로 2시간동안 처리한 후 90분 동안 α-MSH으로 자극하여 면역블로팅을 수행한 결과를 보여준다.
패널 (e)는 세포에 PF3758309을 6시간동안 처리한 후 MG132 및 사이클로헥사마이드(cycloheximide)로 2시간동안 처리하고 α-MSH으로 90분동안 자극한 후 면역블로팅을 수행한 결과를 보여준다.
실시예
실험재료 및 방법
1. 실험재료
1차 항체는 셀 시그날링 테크(Cell Signaling Tech, Danver, MA, USA), 산타크루즈 바이오텍 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA) 또는 에이비캠 (Abcam, Cambridge, UK)에서 구입하였으며 겨자무과산화효소(Horseradish peroxidase) 접합 2차 항체는 써모 사이언티픽 (Thermo Scientific, Middletown, VA, USA)에서 구입하였다. 바이오티닐화 2차 항체, 벡타스테인(vectastain) ABC 시스템 및 벡타쉴드 마운팅 용액(Vectashild mounting medium)은 벡터 연구소 (Vector laboratories, Burlingame, CA, USA)에서 구입하였다. PF3758309 및 다른 화학물질들은 시그마-알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 제품번호 #1404672 및 #MSS291252인 PAK4 특이 siRNA (5’- CUCUGUCUCAGCCUAGGAA - 3’: 서열번호 1; 5’ AACUAGCAGCUGGCAGGCCCUUUAA - 3’: 서열번호 2)는 바이오니아 라이프 테크놀로지(Bioneer and life technology)에서 구입하였으며 HRM-2 생쥐는 호시노 실험동물 (Yashino, Saitama, Japan)에서 구입하였다.
2. 세포배양
B16 흑색종 세포(melanoma cell)는 10% 소혈청알부민이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였고, 인간 표피 멜라닌세포(human epidermal melanocyte)는 인간 멜라닌세포 성장인자(human melanocyte growth supplement)가 포함된 254 배지를 넣고 37℃, 습화된 5％ CO2 상태에서 배양하였다.
3. siRNA 또는 DNA의 일시적 형질전환(transient transfection)
세포의 형질전환(transfection)은 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 시약을 사용하였으며 제조사의 지시서에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, 옵티-엠이엠(OPTI-MEM)에서 100nM의 siRNA 또는 5㎍의 DNA를 5㎕의 리포펙타민 2000 용액으로 희석하여 4시간 동안 세포에 첨가하고 배지를 교체하였으며 3일 후 형질전환된 세포를 수확하였다.
4. 멜라닌 함유량 측정
B16 흑색종세포 또는 인간 멜라닌 세포는 100nM의 α-멜라닌세포자극호르몬(α-MSH)으로 3일 동안 자극하였다. 다음으로 세포의 수를 측정하고 70℃의 1M 수산화나트륨(NaOH)과 20% 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)용액에서 용해하였다. 405nM에서 스펙트라맥스(SpectraMax) M5 리더(Molecular, Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 흡광을 측정하고 실험에 사용한 세포의 총 개수로 표준화(normalize) 하였다.
5. 피부 멜라닌색소침착의 측정
6주령의 HRM-2 생쥐를 23± 3℃로 유지되는 온도조절이 가능한 사육시설에서 55± 5%의 상대 습도를 유지하며 12 시간의 명/암 사이클의 환경하에서 사육하였다. 2주간의 환경순응기간을 거친 후 실험 생쥐를 다섯 마리씩 4개의 그룹으로 나누고 0.4, 2, 또는 10μM의 PF3758309 또는 2 mM의 알부틴(arbutin)을 처리하였다. 시료의 도포는 준비된 HRM-2 생쥐의 등피부를 2cm x 2cm로 구획하고 0.4, 2, 또는 10μM의 PF3758309 또는 2 mM의 알부틴(arbutin)을 크림제제로 만들어 피부에 도포한 후 크림이 흡수되면 UV 조사기(crosslinker)(UVP Inc, Upland, CA, USA)를 이용하여 100-200mJ/cm2의 UVB 자외선에 노출하였다. 실험 생쥐의 피부색은 CR-200B 핸드핼드 크로마 메터(handheld chroma meter)(Konica Minolta Sensing, Inc., Sakai, Osaka, Japan)를 이용하여 측정하였다.
6. 면역세포화학법 및 면역조직화학법
검체 슬라이드는 순차적으로 블로킹버퍼(1% 소혈청알부민, 0.1% 냉각된 물고기 젤라틴(cold fish gelatin), 0.3% 트리톤(triton) X-100, 0.05% 트윈(tween) 20 및 0.05% 소디움 아지드(sodium azide)가 포함된 PBS))에서 상온으로 한 시간 동안 반응 시키고, 4℃에서 1차 항체로 밤새 반응시켰다. PBS-T로 세척한 후, 슬라이드는 AlexFluor 488 또는 AlexFluor 594 형광이 표지된 2차 항체와 함께 한 시간 동안 암실 및 상온 하에서 반응 시켰다. PBS-T로 세척 후, 슬라이드는 벡타실드 마운팅 용액(Vectashield mounting medium)으로 마운팅 하였다. 염색사진은 냉각 CCD 카메라가 설치된 올림푸스 형광현미경(Olympus Optical Co., 도쿄, 일본)으로 찍었으며 사진처리 및 결과분석은 이미지 J(image J) 프로그램으로 수행하였다. DAB(diaminobenzidine) 염색은, 슬라이드를 내인성 퍼옥시다아제를 차단하기 위해 3% 과산화수소로 10분간 처리하였고, 3,3-DAB(diaminobenzidine) 용액(0.5mg/ml DAB, 0.1M phosphate buffer, pH 7.4, 및 0.003% H2O2)으로 발색한 후 PBS로 충분히 세척하고 슬라이드를 헤마톡실린으로 염색, 탈수시킨 후 커버스립을 덮고 마운팅하는 단계를 제외하고는 동일한 과정을 상기 기술한 바와 같이 적용하였다.
7. 통계분석
데이터는 평균± 표준오차(standard error, SE)로 표시하였고 통계적 유의성은 시그마플롯(SigmaPlot) 10.0 소프트웨어를 사용하여 스튜던트의 t-테스트(student's t-test)에 의해 평가하였다. P<0.05 값의 경우를 유의하게 차이가 있는 것으로 평가하였다.
실험결과
1. 쥐 표피 멜라닌세포와 B16 흑색종세포에서 PAK2 및 PAK4가 발현한다.
멜라닌 생성에 있어서 PAK의 역할을 조사하기 위해, 먼저, B16 흑색종세포와 HRM-2 생쥐의 표피에서 어떠한 PAK 동형단백질(isoform)들이 발현되는 지를 확인하였다.
HRM-2 생쥐의 표피에서 멜라닌세포의 마커인 SOX10을 사용하여 SOX10과 함께 존재하는 PAK 동형단백질들을 확인하기 위하여 면약조직화학염색법을 수행한 결과, 표피에서 다른 PAK 동형단백질은 염색되지 않고 PAK2 및 PAK4만이 염색되었다. 또한, PAK2 및 PAK4는 SOX10과 공동염색 되어 멜라닌세포에서 특정의 기능을 할 것으로 시사되었다(도 1의 패널 a).
멜라닌 생성 모델에서 사용되는 B16 흑색종 세포에서 PAK 동형단백질 발현여부를 확인하기 위하여 면역블로팅(immunoblotting)을 수행한 결과, 상기 동물 실험결과와 같이, B16 흑색종 세포에서 PAK2와 PAK4만이 발현되는 것이 확인되었다(도 1의 패널 b).
2. PAK4는 α-멜라닌세포자극호르몬에 의해 유도된 멜라닌 생성을 매개한다.
어떠한 PAK 동형단백질이 멜라닌 생성에 기여하는지를 확인하기 위하여, 먼저 PAK2가 α-멜라닌세포자극호르몬(α-MSH)에 의해 활성화되는지 확인하였다.
PAK2의 활성화 과정중에 PAK2는 Thr402가 인산화 되므로, 이를 인식하는 항체를 이용하면 활성화된 PAK2를 검출할 수 있다. 실험결과, α-MSH는 시간 및 농도 의존적으로 PAK2를 활성화시켰다. 다음으로, PAK2의 발현 억제가 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 생성에 어떠한 영향을 주는 지를 확인하였다. PAK2를 제거하기 위해, 2개의 서로 다른 PAK2 특이적인 siRNA들을 사용한 결과, PAK2의 단백질 양이 현저히 감소하였다. 상기 실험에서 멜라닌 합성을 정량적으로 측정하였을 때 PAK2-siRNA를 처리한 세포와 음성대조군인 스크램블드 si-RNA(scrambled siRNA)를 처리한 세포 모두에서 α-MSH에 의해 멜라닌 생성이 정상적으로 유도되는 것이 확인되었다. 양성대조군에 사용한 알부틴(arbutin)은 멜라닌 생성을 촉매하는 티로시나아제의 특이적 억제제이므로 멜라닌 생성 억제제로 사용된다(Akiu et al, 1991). 알부틴은 알려진 대로, α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 생성을 농도 의존적으로 저해하였다. 상기 PAK2의 멜라닌 생성을 측정한 실험결과는 PAK2가 멜라닌 생성과 관련 없음을 시사한다.
다음으로, PAK4가 멜라닌 합성에 어떤 영향을 주는지 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 먼저 α-MSH가 PAK4를 활성화 시키는지 확인하였다. PAK4의 활성화는 PAK4의 Ser474의 인산화 정도를 인식하는 항체를 이용하여 측정하는 방법을 통해 간접적으로 측정하였다(Callow et al, 2002)(이하에서 pPAK4s474를 pPAK4로 표기한다). 실험결과, α-MSH는 100nM까지 농도 의존적으로 PAK4를 활성화 증가시켰다(도 2의 패널 a). PAK4를 간접적으로 인산화 시키는 단백질 인산화효소(PKA, protein kinase A)의 억제제인 H89를 전 처리한 결과, PAK4의 인산화가 현저하게 억제되었다. 이러한 결과는 PAK4가 PKA의 하위(downstream)에서 기능한다는 것을 의미한다. PAK4는 α-MSH로 자극한지 5분 이후부터 인산화가 시작되었으며 15 - 30분이 지나면 인산화의 안정화 상태로 유지되었고 60분이 지나면 기저 수준으로 감소하였다(도 2의 패널 b).
초기에 PAK4에 특이적인 억제제로 발견되었으나 이후에 모든 PAK 동형단백질들에 억제 효과가 있는 것이 확인된, PF3758309를 처리한 결과, B16 흑색종 세포와 인간 표피 멜라닌세포에서 α-MSH에 의하여 활성화된 PAK4의 인산화를 농도 의존적 방식으로 억제하는 것이 확인되었다(도 2의 패널 c). 그러나, PF3758309는 PKA를 직접적으로 억제하지 않았는데, 이는 상기 억제 효과가 PKA의 상위 단계(upstream)에 작용하지 않음을 시사한다. 그리고 PF3758309의 세포독성 실험에서 PF3758309만 최대 농도로 처리하였을 때 세포독성이 없음을 확인 하였다. 이어서, B16 흑색종 세포에서 pPAK4에 대한 면역염색화학을 수행하였다. α-MSH로 자극된 B16 흑색종 세포의 pPAK4 활성이 자극을 주지 않은 음성대조군에 비해 약 5배까지 증가하였으며 세포의 핵에서 염색되었다(도 2의 패널 d). 그리고 α-MSH로 자극된 B16 흑색종 세포에서 PF3758309의 농도가 증가함에 따라 핵에 염색되는 pPAK4의 양이 점차 감소하였다. 이어서, PAK4가 B16 흑색종 세포에서 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 생성에 필수적인지 확인하기 위하여 다음 실험을 수행하였다(도 2의 패널e).
B16 흑색종 세포를 α-MSH으로 자극한지 3일 후에 멜라닌의 함유량을 측정한 결과, 아무것도 처리하지 않은 음성대조군과 비교하여 멜라닌 합성이 약 5배 증가하였고 여기에 PAK4의 억제제인 PF3758309를 처리하였을 때 PF3758309가 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 색소 생성을 농도 의존적으로 저해하는 것으로 확인되었다. 상기 실험에서 PF3758309의 50% 저해농도(IC50)은 38 nM 이었다. 알부틴의 50% 저해농도가 78μM이므로, PF3758309의 멜라닌 색소 생성 저해능력은 알부틴에 비해 약 2000배 강한 것이다. 인간 멜라닌 세포에서 동일한 실험을 수행한 결과 PF3758309은 인간 멜라닌 세포에서도 PAK4의 인산화와 멜라닌 생성을 농도 의존적으로 저해하는 것이 확인되었다(도 2의 패널 e). 이어서, PAK4의 발현을 억제하고 멜라닌 색소 생성과 관련된 단백질의 발현을 확인하였다. 실험결과, PAK4 특이적인 siRNA로 PAK4의 발현을 억제 하였을 때 CREB의 발현 수준이 현저히 감소되었다. siRNA에 저항성이 있는 인간 PAK4를 발현시킨 결과, CREB의 발현수준이 정상으로 회복되었는데, 이는 PAK4 siRNA에 의한 오프타겟효과(off-target effect)는 없다는 것을 시사한다. 다음으로 siRNA로 PAK4의 발현을 억제하고 α-MSH를 처리하였을 때 멜라닌 생성이 기저수준으로 감소하였다(도 2의 패널 f). 상기 결과들은 PAK4가 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 생성에서 반드시 필요한 것임을 의미한다.
3. PAK4는 동물 실험에서 UVB에 의해 유도된 멜라닌 생성을 매개한다.
UVB에 의해 유도된 멜라닌 생성(UVB-induced melanogenesis)은 UVB에 노출된 각질형성세포에서 분비된 α-MSH과 연관이 있으며, PAK4가 동물 실험에서 UVB에 의해 유도된 멜라닌 생성에 어떠한 역할을 하는지 알아보기 위하여 실험을 수행하였다. 멜라닌 색소를 생산하는 능력이 있으며 털이 없는 HRM-2 생쥐를 사용하여 동물 실험을 수행하였다. PAK4를 억제하기 위하여 PF3758309를 크림 혼합물로 제조하여 HRM-2 생쥐의 등피부에 농도 별로 도포하고 UVB 자외선에 노출시켰다(도 3의 패널 a). 실험에 참여한 생쥐들 사이의 멜라닌 색소 침착의 오차를 줄이기 위하여 각 생쥐의 피부를 세부분으로 나누었다(도 3의 패널 b). 그리고, PAK4가 UVB 자외선에 노출된 표피 멜라닌 세포에서 활성화 되는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 상기와 같이 처리된 생쥐의 피부를 자외선에 노출한 후 SOX10과 pPAK4에 대하여 공동염색을 수행하고 SOX10이 염색 세포에서 pPAK4의 발현 양을 정량분석 하였다(도 3의 패널 c 및 d). UVB 조사에 의해 pPAK4 수준이 크게 증가하였다 (도 3의 패널 c). 그러나, PF3758309을 미리 도포한 세포에서는 농도 의존적으로 pPAK4의 강도가 감소하였다. 이는, UVB 조사가 표피 멜라닌세포에서 pPAK4 활성화를 촉진시킨다는 것을 지시한다. 또한, PF3758309의 피부 독성 정도를 실험하기 위해 자외선 노출 없이 PF3758309 만으로 최대 실험 허용농도인 10으로 처리하였을 때 HRM-2 마우스의 표피에서 세포사멸이 유도되지 않았다. 이어서, PF3758309가 UVB에 의해 유도된 멜라닌 생성에 미치는 효과를 확인하였다. 피부의 멜라닌색소의 침착정도를 정량적으로 측정한 값을 L값(L value)으로 표기하였으며 상기 L값(L value)은 멜라닌색소의 침착정도에 반비례한다. 실험결과, UVB에 노출된 생쥐 등피부는 노출 후 6일까지 색소의 변화를 보이지 않았으나 반복적인 UVB 노출에 의해 멜라닌색소의 침착이 증가하여 14일에서 가장 낮은 L값 59을 보였다. 그러나, PF3758309가 처리된 생쥐 등피부에서는 PF3758309의 농도 의존적으로 UVB에 의해 유도된 멜라닌 색소침착이 저해되었다(도 3의 패널 e). 2에서의 PF3758309의 억제 효과는 2 mM의 알부틴과 동등한 효과를 나타내었다. 정리하면, 상기 결과들에 의하여 PAK4가 동물 실험에서도 UVB에 의해 유도된 멜라닌 생성을 매개한다는 것을 알 수 있다.
4. PAK4는 CREB/MITF/티로시나아제를 상향조절(up-regulate)함으로써 멜라닌 생성을 매개한다.
PAK4가 멜라닌 생성을 매개하는 기전(molecular mechanism)을 규명하기 위하여 PAK4의 발현 및 활성화 억제가 멜라닌 생성의 핵심 신호전달 효소인 pCREB, CREB, MITF 및 티로시나아제의 발현 수준에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. CREB는 MITF 프로모터(promoter)에 결합하여 이를 활성화시키고, 결과적으로 멜라닌 합성에 중요한 티로시나아제의 전사를 촉진한다(Saito et al, 2003; Widlund and Fisher, 2003). B16 흑색종 세포와 인간 표피 멜라닌세포에서 PAK4의 발현을 억제하고 관련단백질의 발현 수준을 측정한 결과, pCREB, CREB, MITF 및 티로시나아제의 발현이 감소되었다(도 4의 패널 a). PAK4의 발현을 억제했을 때 CREB가 MITF 프로모터와 결합하는데 어떤 영향을 주는지를 추가적으로 분석하기 위하여, 리포터어세이(reporter assay)를 이용하여 MITF 프로모터 활성을 측정하였다. α-MHS을 처리한 실험군은 상기 호르몬을 처리하지 않은 음성대조군에 비하여 약 2.8배 높은 MITF 프로모터의 리포터 활성도를 보였으나, 반면에 PAK4 siRNA 또는 H89로 PAK4의 발현 및 활성을 저해한 실험군은 MITF 프로모터의 리포터 활성도가 감소하는 것을 확인하였다(도 4의 패널 b). PAK4의 발현 억제에 의해 유도되는 CREB 및 pCREB의 감소 결과(도 4의 패널 a)와 함께, 상기 결과들은 PAK4가 CREB를 통해 MITF 프로모터 활성을 조절한다는 것을 시사한다. 이러한 시사를 지지하는 결과로서, PAK4의 발현 억제가 MITF의 하위 타겟인 티로시나아제의 발현 수준을 현저하게 감소시켰다(도 4의 패널 a). 이어서, PAK4의 활성화 억제에 대한 영향을 조사하였다. PF3758309으로 단기간 처리한 경우 CREB 단백질 수준에 영향이 없었다. 하지만 22시간 동안 B16 흑색종 세포에 PF3758309을 처리하고 15분간 α-MSH으로 자극하여 면역블로팅한 결과, 도표에서 보여지는 바와 같이, 100 및 300nM PF3758309를 처리한 실험군에서 CREB, MITF, 및 티로시나아제의 발현 수준이 감소하였다(도 4의 패널 d 및 e). pCREB 수준은 300nM PF3758309가 처리된 실험군에서 감소하였는데, 이러한 감소된 수준은 직접적인 단백질 인산화에 의한 효과이기 보다 CREB 단백질의 감소 때문인 것으로 보인다. PKA 특이적 억제제인 H89는 거의 완벽하게 CREB 단백질의 Ser133 인산화를 억제하였다(도 4의 패널 d). 상기 결과는 PAK4의 발현 또는 활성화 억제가 CREB, MITF 및 티로시나아제를 감소시켜 B16 흑색종 세포에서 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 생성을 억제한다는 것을 의미한다. 동물 실험에서 PAK4의 활성을 억제함으로 UVB에 의해 유도된 멜라닌 생성이 감소되는 효과를 확인하기 위하여, PF3758309를 농도별로 도포하고 UVB를 조사하여 멜라닌 합성을 유발시킨 생쥐의 등피부를 채취하여 SOX10 면역화학염색을 수행하고 SOX10-양성 세포에서 티로시나아제와 MITF의 수준을 정량적으로 측정하였다(도 3의 패널 c). 실험결과, CREB 단백질은 핵안에 위치하고 있으며, UVB에 노출을 하지 않아도 CREB의 기저 발현 수준(basal expression level)이 높은 수준이었다. 따라서, UVB는 CREB를 실질적으로 상향 조절하지 않았으나, PAK4의 활성화 억제는 농도 의존적으로 CREB 수준을 감소시켰다(도 4의 패널 f). 그러나, CREB와는 대조적으로, MITF 및 티로시나아제의 발현 수준은 UVB 노출에 의하여 크게 증가하였으며 PAK4의 활성 억제는 UVB에 의해 유도된 티로시나아제 및 MITF의 발현 수준을 농도 의존적으로 감소시켰다(도 4의 패널f).
5. PAK4는 β-카테닌 활성화를 통해 멜라닌 생성을 매개한다.
β-카테닌은 티로시나아제 유전자의 전사를 유도하는 MITF와 상호작용하여 멜라닌 생성에 기여한다. 또한, α-MSH는 Wnt/β-카테닌의 신호전달을 유도한다는 것이 보고되었다((Schepsky et al, 2006 및 Bellei et al, 2011). 최근 연구결과에 의하면, PAK4는 직접적으로 β-카테닌의 Ser675를 인산화시키고, β-카테닌의 Ser675의 인산화는 β-카테닌의 분해를 억제함으로 β-카테닌의 안정성을 향상시킨다(Hino et al, 2005). 따라서, 본 발명자들은 멜라닌 세포에서 PAK4가 β-카테닌의 Ser675 인산화에 미치는 영향을 조사하였다. α-MSH는 농도 및 시간 의존적으로 B16 흑색종 세포에서 β-카테닌 Ser675 인산화를 촉진시켰다(도 5의 패널 a). B16 흑색종 세포에서 PAK4 활성 억제는 농도 의존적으로 α-MSH에 의해 증가된 β-카테닌의 Ser675 인산화를 억제하였다(도 5의 패널 b의 상부 패널). 또한, PAK4의 발현 억제는 α-MSH에 의해 유도된 β-카테닌 Ser675 인산화를 크게 억제하였다(도 5의 패널 b의 하부 패널). 이어서, 동물 모델에서 PAK4 활성 억제의 효과를 조사하였다. 먼저, UVB 자외선에 노출된 HRM-2 생쥐 피부에서 β-카테닌 S675 인산화(pβ-카테닌S675) 및 SOX10에 대한 면역화학염색법을 수행하였다. 실험결과, pβ-카테닌S675 은 대부분 세포막에서 염색되었다(도 5의 패널 c의 두 번째 컬럼). pβ-카테닌S675은 PF3758309의 농도가 증가함에 따라 점차적으로 감소하였다(도 5의 패널 c). β-카테닌은 Ser33/Ser37에서 인산화가 되면 유비큐틴화 의존성 단백질 가수분해(ubiqutination-dependent proteolysis) 과정에 의해 분해된다(Liu et al, 2002). 따라서 PAK4가 β-카테닌 Ser33/Ser37의 인산화를 억제하여 β-카테닌의 안정성을 증가시키는지 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 단백질 합성 억제제인 사이클로헥사마이드(cycloheximide)와 프로테아좀(proteasome) 억제제인 MG132를 전 처리한 결과 β-카테닌 Ser33/Ser37 인산화 수준이 크게 증가하였다(도 5의 패널 d에서 레인 1 및 레인 2 비교). 여기에 α-MSH를 처리했을 때 β-카테닌 Ser33/Ser37 인산화 수준이 상당히 감소하였으나(도 5의 패널 d의 레인 3), PAK4의 발현을 억제한 B16 흑색종 세포 및 인간 표피 멜라닌세포에서는 β-카테닌 Ser33/Ser37 인산화가 감소되지 않았다(도 5의 패널 d의 레인 4 및 5). 그리고 PF3758309을 처리하여 PAK4의 활성을 억제하였을 때 α-MSH에 의해 유도된 β-카테닌 Ser33/Ser37 인산화 감소를 억제하였다(도 5의 패널 e). 또한, 본 발명자들은 이러한 효과가 β-카테닌 Ser33/Ser37 인산화를 수행하는 GSK3β를 PF3758309가 직접적으로 억제하는 것 때문이 아님을 확인하였다. 따라서, PAK4는 β-카테닌 Ser675의 인산화를 향상시키고 β-카테닌 Ser33/37의 인산화는 억제하는 두 가지의 서로 다른 기작으로 β-카테닌을 안정화시키는 것으로 추정된다.
결론
상기 수행한 실험들에 의하면, PAK4는 α-멜라닌세포자극호르몬 및 UV 자외선에 의해 유도된 멜라닌 생성에서 매우 중요한 역할을 한다. PAK4 활성화는 멜라닌 합성에서 핵심 전사인자인 CREB 및 β-카테닌의 상위 신호전달 물질로서 기능하여 멜라닌 생성을 증진시킨다. PAK4의 발현 및 활성을 억제하면 CREB의 단백질 수준이 감소한다. MITF와 티로시나아제의 발현은 CREB에 의하여 조절되기 때문에 CREB의 단백질 수준이 감소하게 되면 MITF와 티로시나아제의 발현이 저해되며 이는 멜라닌 생성의 저해로 이어진다. 또한 PAK4의 발현 및 활성 억제는 α-MSH / UVB 조사에 의해 유도된 β-카테닌 Ser675 인산화를 억제한다. 정리하면, 활성화된 PAK4는 CREB와 β-카테닌이 관련된 서로 다른 두 개의 신호전달경로인 CREB/MITF/티로시나아제 또는 β-카테닌/MITF 신호전달경로를 통하여 멜라닌의 생성을 촉진한다. 그러므로, PAK4의 발현 및 활성을 억제하면 과색소 침착 질환(hyperpigmentation disorders)을 치료하거나 미백(skin whitening)을 증진시키데 도움이 될 수 있다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시 예는 본 발명의 바람직한 구현 예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허 청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Composition for Skin Whitening and Treating Disorders of Melanin Hyperpigmentation Comprising p21-Activated Kinase Inhibitor As Active Ingredient <130> MP15-0020 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAK4 specific siRNA No. 1 <400> 1 cucugucuca gccuaggaa 19 <210> 2 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAK4 specific siRNA No. 2 <400> 2 aacuagcagc uggcaggccc uuuaa 25

Claims (11)

  1. PAK4(p21-activated kinase 4) 활성 또는 발현 억제제로서, 상기 PAK4에 특이적으로 결합하는 (S)-N-(2-(디메틸아미노)-1-페닐에틸)-6,6-디메틸-3-((2-메틸티에노[3,2-d]피리미딘-4-일)아미노)-4,6-디하이드로피롤로[3,4-c]피라졸-5(1H)-카르복사마이드), 앱타머 또는 항체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물.
  2. PAK4(p21-activated kinase 4) 활성 또는 발현 억제제로서, PAK4 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 또는 라이보자임을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 PAK4 활성 또는 발현 억제제는 멜라닌 세포에서 멜라닌의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 삭제
  5. PAK4(p21-activated kinase 4)의 활성 또는 발현 억제제로서, 상기 PAK4에 특이적으로 결합하는 (S)-N-(2-(디메틸아미노)-1-페닐에틸)-6,6-디메틸-3-((2-메틸티에노[3,2-d]피리미딘-4-일)아미노)-4,6-디하이드로피롤로[3,4-c]피라졸-5(1H)-카르복사마이드), 앱타머 또는 항체를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  6. PAK4(p21-activated kinase 4)의 활성 또는 발현 억제제로서, PAK4 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 또는 라이보자임을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광 흑색증(solar lentigines)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 PAK4 억제제는 멜라닌 세포에서 멜라닌의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 삭제
  10. 다음의 단계를 포함하는 멜라닌 생성 저해 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법:
    (a) 후보물질과 세포를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 세포에서 PAK4 (p21-activated kinase 4) 단백질 수준 또는 PAK4 단백질 코딩 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 세포는 멜라닌 세포인 것을 특징으로 하는 방법.

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