CN104165961A - 一种多西他赛原料中有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种有关物质的检测方法，特别涉及一种多西他赛原料中有关物质的检测方法。采用反相高效液相色谱法，用有机溶剂和酸的水溶液为流动相A和流动相B在十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱进行梯度洗脱，流速为1.0-1.4mL/min，色谱柱柱温35-45℃，样品的检测波长为232nm。该检测方法的效果和优点是：1、可有效分离出多西他赛原料药中的杂质，方法灵敏度高；2、能对多西他赛原料药中的杂质进行定量分析，可准确控制杂质含量；3、在40分钟内能将杂质完全分离，分析时间周期短，且杂质峰对称性好；4、流动相容易配制、操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及一种有关物质的检测方法，特别涉及一种多西他赛原料中有关物质的检测方法。
背景技术
多西他赛(Docetaxel)也叫多西紫衫醇：属于紫杉类化合物抗肿瘤药，作用机制是加强微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，导致形成稳定的非功能性微管束，因而破坏肿瘤细胞的有丝分裂。其化学结构式如下：
众所周知，药物纯度对病人的影响是非常大的。注射药物不纯是引起药物不良反应(如过敏、药物热等)的主要原因。口服药物不纯，可能增加不良反应的发生率，如恶心、呕吐、腹痛、腹泻等。同时，可能影响的是药物的吸收，从而影响药物疗效。因此，药物纯度的检测方法就显的尤为重要。
目前，对于多西他赛原料中相关物质的检测，美国药典36版，英国药典2013版、欧洲药典7.8版均收载了多西他赛原料的有关物质检测方法。均采用高效液相色谱法，采用水和乙腈进行梯度洗脱，柱温45℃，采集时间50min，检测波长232nm，流速为1.2mL/min。该方法采集时间较长，主峰出峰时间晚，主峰出峰后基线漂移，且有关物质出峰过于集中，不利于样品分析。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中所存在的上述不足，提供一种多西他赛原料中有关物质的检测方法，该检测方法能检测出更多杂质，杂质峰之间分离效果好，灵敏度、准确度高。杂质峰形对称性好，采集时间短等优点。
为了达到上述目的，具体技术方案如下：
一种多西他赛原料中有关物质的检测方法，采用反相高效液相色谱法，用有机溶剂和酸的水溶液为流动相A和流动相B在十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱进行梯度洗脱，流速为1.0-1.4mL/min，柱温35-45℃，样品的检测波长为232nm；选用35-45℃的柱温。
所述的流动相A为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比分别为40％-50％，乙酸的体积百分比为0.01-0.1％，余下为水；所述的流动相B为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中个，乙腈的体积百分比为70％-75％，乙酸的体积百分比为0.01-0.1％的溶液，余下为水。本发明的流动相中加入乙酸，可以改善峰形及分离效果。
所述的以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，时间(min)/流动相A(v％)：0/100；20/100；25/0；30/0；35/100；40/100。本发明选用的流动相条件，采集时间短，杂质峰和主峰分离效果好，基线平稳，对杂质测定无干扰。
优选的，所述的检测方法，采用反相高效液相色谱法，用有机溶剂和酸的水溶液为以流动相A和流动相B在十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱进行梯度洗脱，，流速为1.2mL/min，柱温40℃，样品的检测波长为232nm；
所述的流动相A为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比为45％，乙酸的体积百分比为0.05％，余下为水；；所述的流动相B为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比为70％，乙酸的体积百分比为0.05％，余下为水；
所述的以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，时间(min)/流动相A(v％)：0/100；20/100；25/0；30/0；35/100；40/100。本发明优选的实验条件，主峰保留时间在10min左右，有利于杂质峰的检出与分离，溶剂峰对杂质测定无干扰，采集时间短。
所述的检测方法，所述的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱填料的颗粒度为3.5μm或5μm，规格为150mm×4.6mm。
所述的检测方法，采集时间为40min。采集时间控制在40min，因为前20min的流动相中，有机溶剂比例少，有利于水溶性杂质的分离，但是不能保证脂溶性难洗脱的杂质能够检出。为了能够检出脂溶性难洗脱的杂质，随着洗脱时间增加，在25min后增加流动相中有机溶剂比例，进行洗脱。
所述的检测方法，所述的样品为1.0mg/mL的多西他赛溶液，其中溶剂含体积百分比5％的无水乙醇，体积百分比50％的乙腈，体积百分比0.05％的乙酸，余下为水。配制样品时，溶剂中添加乙酸，是为了让溶剂和流动相pH值接近，这样多西他赛不会因环境pH改变，而出现溶解性改变，甚至出现析出现象，影响检测结果。
所述的检测方法，量取所述的多西他赛溶液10μL，进行测定。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明能够检测出更多的杂质，灵敏度高，采集时间较短。
(2)本发明中的流动相配制简单易操作，流动相中加入乙酸，能够改善峰形及分离效果。
(3)采用本发明中的方法进行检测，分离度达到1.5以上，杂质峰和主峰，杂质峰之间能够很好分离，分离效果好。拖尾因子接近1，峰形对称性好。一般理论塔板数大于5000，峰形尖锐，与杂质峰分离效果好，理论塔板数越大效果越好，本发明的主峰理论塔板数大于6万。
附图说明：
图1为实施例1高效液相色谱图。
图2为实施例2高效液相色谱图。
图3为实施例3高效液相色谱图。
图4为实施例4高效液相色谱图。
图5为对比例1高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
一种多西他赛原料中有关物质的检测方法，采用反相高效液相色谱法，选用Agilent zorbax SB-C18色谱柱，填料的颗粒度为3.5μm，规格为150mm×4.6mm。以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，时间(min)/流动相A(v％)：0/100；20/100；25/0；30/0；35/100；40/100，具体如表1所示。流速为1.2mL/min，柱温40℃，量取10μL、1.0mg/mL多西他赛溶液进行检测，其中溶剂含体积百分比5％的无水乙醇，体积百分比50％的乙腈，体积百分比0.05％的乙酸，余下为水，检测波长为232nm，采集时间40min。
所述的流动相A为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比为45％：乙酸的体积百分比为0.05％；余下为水；所述的流动相B为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比为70％：乙酸的体积百分比为0.05％；余下为水；
检测结果如图1所示。主峰保留时间(R＝8.651min)，同时相邻峰得到了很好的分离(分离度R＝1.849)，峰理论塔板数较高(N＝66637)，峰型对称性好(Symm＝1.005)。除了主峰之外，能够检测出七种杂质。其表明该方法准确度高，灵敏度高，能够检测出多种杂质。
表1流动相梯度洗脱体积时间表
| 时间(min) | 流动相A(V％) | 流动相B(V％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 20 | 100 | 0 |
| 25 | 0 | 100 |
| 30 | 0 | 100 |
| 35 | 100 | 0 |
| 40 | 100 | 0 |
实施例2
一种多西他赛原料中有关物质的检测方法，采用反相高效液相色谱法，选用Agilent zorbax SB-C18色谱柱，填料的颗粒度为3.5μm，规格为150mm×4.6mm。以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，时间(min)/流动相A(v％)：0/100；20/100；25/0；30/0；35/100；40/100，具体如表2所示。流速为1.4mL/min，柱温45℃，量取10μL、1.0mg/mL多西他赛溶液进行检测，其中溶剂含体积百分比5％的无水乙醇，体积百分比50％的乙腈，体积百分比0.05％的乙酸，余下为水，检测波长为232nm，采集时间40min。
所述的流动相A为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比为40％：乙酸的体积百分比为0.05％；余下为水；所述的流动相B为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比为75％：乙酸的体积百分比为0.05％；余下为水。
检测结果如图2所示。主峰保留时间(R＝10.155min)，同时相邻峰得到了很好的分离(分离度R＝2.018)，峰理论塔板数较高(N＝57623)，峰型对称性好(Symm＝1.002)。除了主峰之外，能够检测出七种杂质。其表明该方法准确度高，灵敏度高，能够检测出多种杂质。
表2流动相梯度洗脱体积时间表
| 时间(min) | 流动相A(V％) | 流动相B(V％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 20 | 100 | 0 |
| 25 | 0 | 100 |
| 30 | 0 | 100 |
| 35 | 100 | 0 |
| 40 | 100 | 0 |
实施例3
一种多西他赛原料中有关物质的检测方法，采用反相高效液相色谱法，选用Agilent zorbax SB-C18色谱柱，填料的颗粒度为5μm，规格为150mm×4.6mm。以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，时间(min)/流动相A(v％)：0/100；20/100；25/0；30/0；35/100；40/100，具体为表3所示。流速为1.0mL/min，柱温40℃，量取10μL、1.0mg/mL多西他赛溶液进行检测，其中溶剂含体积百分比5％的无水乙醇，体积百分比50％的乙腈，体积百分比0.05％的乙酸，余下为水，检测波长为232nm，采集时间40min。
所述的流动相A为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比为50％：乙酸的体积百分比为0.1％；余下为水；所述的流动相B为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比为72％：乙酸的体积百分比为0.01％；余下为水。
检测结果如图3所示。主峰保留时间(R＝5.569min)，同时相邻峰得到了很好的分离(分离度R＝1.477)，峰理论塔板数较高(N＝60039)，峰型对称性好(Symm＝1.035)。除了主峰之外，能够检测出七种杂质。其表明该方法准确度高，灵敏度高，能够检测出多种杂质。
表3流动相梯度洗脱体积时间表
| 时间(min) | 流动相A(V％) | 流动相B(V％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 20 | 100 | 0 |
| 25 | 0 | 100 |
| 30 | 0 | 100 |
| 35 | 100 | 0 |
| 40 | 100 | 0 |
实施例4
一种多西他赛原料中有关物质的检测方法，采用反相高效液相色谱法，选用Agilent zorbax SB-C18色谱柱，填料的颗粒度为3.5μm，规格为150mm×4.6mm。以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，时间(min)/流动相A(v％)：0/100；20/100；25/0；30/0；35/100；40/100，具体如表4所示。流速为1.4mL/min，柱温35℃，量取10μL、1.0mg/mL多西他赛溶液进行检测，其中溶剂含体积百分比5％的无水乙醇，体积百分比50％的乙腈，体积百分比0.05％的乙酸，余下为水，检测波长为232nm，采集时间40min。
所述的流动相A为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比为43％：乙酸的体积百分比为0.01％；余下为水；所述的流动相B为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比为70％：乙酸的体积百分比为0.05％；余下为水。
检测结果如图4所示。主峰保留时间(R＝8.613min)，同时相邻峰得到了很好的分离(分离度R＝1.726)，峰理论塔板数较高(N＝64413)，峰型对称性好(Symm＝0.998)。除了主峰之外，能够检测出七种杂质。其表明该方法准确度高，灵敏度高，能够检测出多种杂质。
表4流动相梯度洗脱体积时间表
| 时间(min) | 流动相A(V％) | 流动相B(V％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 20 | 100 | 0 |
| 25 | 0 | 100 |
| 30 | 0 | 100 |
| 35 | 100 | 0 |
| 40 | 100 | 0 |
对比例1
一种多西他赛原料中有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法，选用Agilent zorbax SB-C18色谱柱，填料的颗粒度为3.5μm，规格为150mm×4.6mm。以水和乙腈进行梯度洗脱，时间(min)/流动相A(v％)：0/72；9/72；25/0；39/28；40/72；50/72，具体如表5所示。流速为1.2mL/min，柱温45℃，量取10μL、1.2mg/mL多西他赛溶液进行检测，其中溶剂含体积百分比5％的无水乙醇，体积百分比50％的乙腈，体积百分比0.05％的乙酸，余下为水，检测波长为232nm，采集时间50min。
检测结果如图5所示。主峰保留时间较迟(R＝27.003min)，除了主峰之外，能够检测出四种杂质。主峰出峰之后基线漂移，出现溶剂峰，对主峰之后出现的杂质峰不能检出。可见现有方法的杂质检出数量低，检测效果不好，不利于样品分析。
表5流动相梯度洗脱体积时间表
| 时间(min) | 水(V％) | 乙腈(V％) |
| 0 | 72 | 28 |
| 9 | 72 | 28 |
| 39 | 28 | 72 |
| 40 | 72 | 28 |
| 50 | 72 | 28 |
Claims (6)
1.一种多西他赛原料中有关物质的检测方法，采用反相高效液相色谱法，其特征在于：用有机溶剂和酸的水溶液为流动相A和流动相B在十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱进行梯度洗脱，流速为1.0-1.4mL/min，色谱柱柱温35-45℃，样品的检测波长为232nm；
所述的流动相A为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比为40％-50％，乙酸的体积百分比为0.01-0.1％,余下为水；所述的流动相B为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比为70％-75%，乙酸的体积百分比为0.01-0.1％，余下为水；流动相A和流动相B中乙酸比例应保持相同；
所述的以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，时间（min）/流动相A(v％)：0/100；20/100；25/0；30/0；35/100；40/100。
2.如权利要求1所述的检测方法，采用反相高效液相色谱法，其特征在于：，用有机溶剂和酸的水溶液为流动相A和流动相B在十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱进行梯度洗脱，流速为1.2mL/min，色谱柱柱温40℃，样品的检测波长为232nm；
所述的流动相A为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比为45％，乙酸的体积百分比为 0.05％，余下为水；所述的流动相B为乙腈、水、乙酸三者的混合溶剂，其中，乙腈的体积百分比为70％，乙酸的体积百分比为 0.05%，余下为水；
所述的以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，时间（min）/流动相A(v％)：0/100；20/100；25/0；30/0；35/100；40/100。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱填料的颗粒度为3.5μm或5μm，规格为150mm×4.6mm。
4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，采集时间为40 min。
5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述的样品为1.0mg/mL的多西他赛溶液，其中溶剂含体积百分比5%乙醇，体积百分比50%的乙腈，体积百分比0.05%的乙酸，余下为水。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：量取所述的多西他赛溶液10μL，进行测定。
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