CN104163838A - 一种甜菊叶片ra和stv提取工艺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甜菊叶片RA和STV提取工艺的方法，其特征在于包括以下步骤：精确称取50mg甜叶菊粉末，加入各体积分数的乙醇1.0mL，上下颠倒混匀，于旋转振荡仪上室温振荡过夜，置于相应水温水浴的超声波清洗仪中超声提取相应时间后10000rpm离心10min，取上清，0.45μm有机微孔滤膜过滤，4℃冰箱中保存待测，本发明的方法为更快速准确地评价甜叶菊种质RA和STV含量特性奠定了基础，具有快速、简便、高效等特点。

Description

一种甜菊叶片RA和STV提取工艺的方法

技术领域

本发明主要涉及一种优化提取工艺的方法，尤其涉及一种甜菊叶片RA和STV提取工艺的方法。

背景技术

甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)为菊科多年生新型草本糖料作物，其叶含30多种甜菊糖苷类组分^[2,3]，原产于巴拉圭^[1]，1976年引入以来，我国已成为甜叶菊主产区，甜叶菊叶提取物甜菊糖苷出口量占世界出口总量80％^[6,7]。RA(莱鲍迪苷A，Rebaudioside A)和STV(Steviolside)为甜叶菊叶片所含两种主要甜菊糖苷类组分^[4,5]，随着美国FDA和欧盟食品安全局对RA安全性的认可，欧美市场对“第三代糖源”RA的需求量加大^[11]，我国及世界各地区高RA苷含量、高RA/STV比的甜叶菊新品种的种植面积将进一步扩大^[7]。为适应市场需求对甜叶菊品种的要求，须大力开展高RA苷含量和高RA/STV含量比值的甜叶菊新品种选育。

甜叶菊种质RA和STV含量的快速准确检测是甜叶菊新品种选育的依据。甜叶菊种质RA和STV含量的测定包括提取、分离和检测等三个步骤，其中，叶片所含RA和STV的高效提取是后继分离和检测的基础，只有对甜叶菊叶片所含RA和STV进行充分提取，才能对甜叶菊种质甜菊糖苷含量进行准确评估。此外，在甜叶菊种质评估中，由于需要同时处理大量的样品，快速简便的样品处理体系的建成可提高数据可靠性。为此，本研究的目的就是为甜叶菊种质RA和STV含量分析建立一种快速、简便、高效的提取方法，推动高RA苷含量、高RA/STV比甜叶菊新品种选育。

由于RA和STV都为具有一定水溶性的化合物，目前有关甜叶菊种质RA和STV提取的方法都是以溶剂浸提法为基础发展起来的，所使用的溶剂包括水、甲醇及其混合物，在浸提过程中，人们采用酶解、超声、加热、浓度梯度等的联合使用来促进RA和STV向溶剂的传递。超声助溶乙醇提取法以操作简便、提取效率高、环境污染小而被人们广泛应用于植物化学组分的分离提取，但在甜叶菊RA和STV提取分离中的应用还未见报道。

发明内容

本发明目的就是提供一种甜菊叶片RA和STV提取工艺的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种甜菊叶片RA和STV提取工艺的方法，其特征在于：

将甜菊叶片粉末按料液比m:v＝1:18-22加入48-52％的乙醇，室温振荡过夜，38-42℃下超声提取55-65分钟,9000-10000rpm离心8-12min，取上清，0.45μm左右的有机微孔滤膜过滤，即得。

所述的一种甜菊叶片RA和STV提取工艺的方法，其特征在于：

所述的甜叶菊粉末的制备方法为：将所得甜叶菊叶片剔除杂质和色泽灰暗者后，80℃左右烘干，于研钵中研磨充分，过40-60目筛，得甜菊叶片粉末于干燥器中保存备用。

本发明的优点是：

本发明的方法能够更快速准确地评价甜叶菊种质RA和STV含量特性，操作简便、提取效率高、环境污染小。

附图说明

图1为实施例2的乙醇体积分数对RA和STV提取效率的影响；

图2为实施例2的超声提取时间对RA和STV提取效率的影响；

图3为实施例2的超声提取温度对RA和STV提取效率的影响；；

图4为实施例2的方法与部分已知方法的得率对比。

具体实施方式

实施例1、

(1)将所得甜叶菊叶片剔除杂质和色泽灰暗者后，80℃烘干，于研钵中研磨充分，过60目筛，得甜菊叶片粉末于干燥器中保存备用。

(2)再将甜菊叶片粉末按料液比m:v＝1:10加入50％的乙醇，室温振荡过夜，40℃下超声提取60分钟,10000rpm离心10min，取上清，0.45μm有机微孔滤膜过滤，即得。

RA得率13.5％、STV得率2.2％。

实施例2、

1材料和方法

1.1材料

研究所用材料为甜叶菊扦插苗鑫农4号叶片，由安徽宿州群富甜叶菊专业合作社提供，经鉴定为菊科植物甜叶菊(S.rebaudiana)。

1.2材料的预处理

将所得鑫农4号叶片剔除杂质和色泽灰暗者后，80℃烘干，于研钵中研磨充分，过60目筛，于干燥器中保存备用。

1.3材料的处理

精确称取50mg甜叶菊粉末，加入各体积分数的乙醇1.0mL，上下颠倒混匀，于旋转振荡仪上室温振荡过夜，置于相应水温水浴的超声波清洗仪中超声提取相应时间后10000rpm离心10min，取上清，0.45μm有机微孔滤膜过滤，4℃冰箱中保存待测。同时设3个提取重复。

在实验2.3验证对比中涉及的前人的相关样品处理方法分别参照相应文献方法进行。其中，ref.1为利用甲醇室温超声提取10min，重复提取3次合并提取液；ref.2是以水为提取用溶剂室温振荡浸提2h后再用正丁醇萃取的方法，重复提取3次合并提取液；ref.4是利用水100℃振荡浸提30min，重复提取3次合并提取液；ref.3是利用pH为7.0的0.01M磷酸缓冲液(钠盐)100℃振荡浸提5min，重复提取3次合并提取液；ref.5是利用pH为7.0的0.01M磷酸缓冲液(钠盐)68℃振荡浸提32min，重复提取3次合并提取液.

1.4样品的检测

参照JECFA(2010)方法检测各样品RA及STV含量。

1.5检测数据的处理

利用EXCEL(2007)处理各检测数据和制图。

2结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1乙醇体积分数对RA和STV提取效率的影响

图1结果显示RA和STV得率受提取所用乙醇体积分数的影响较大。以料液比1:20，室温下超声提取40分钟的条件下，随提取所用乙醇体积分数从0％增大至30％区间，RA和STV得率迅速增大，当提取所用乙醇体积分数为30％，50％和70％时RA和STV的得率间差异不显著，当提取所用乙醇体积分数超过70％时，RA和STV得率下降，当提取所用乙醇体积分数为100％时，RA和STV的得率都降到最低。

同时，图1结果显示RA和STV得率比例也受提取所用乙醇体积分数的影响。总的表现为随提取所用乙醇体积分数的增大而逐渐降低，当提取所用乙醇体积分数为100％时，RA和STV的得率比例最低，但是当提取所用乙醇体积分数为30％，50％和70％时RA和STV的得率比例间差异不显著。

2.1.2超声提取时间对RA和STV提取效率的影响

根据实验2.1.1的结果，用体积分数为30％的乙醇以料液比1:20，在室温下超声提取不同时间，以检测超声提取时间对RA和STV得率及其得率比例的影响。

图2结果显示，超声提取时间对RA和STV得率及其得率比例的影响不是特别明显，但当超声提取时间小于20min时，RA和STV得率及其得率比例随超声提取时间的延长而增大，当超声提取时间大于20min时，RA和STV得率及其得率比例受超声提取所用时间的影响不明显，各处理间差异不显著。

2.1.3超声提取温度对RA和STV提取效率的影响

根据实验2.1.1和实验2.1.2的结果，用体积分数为30％的乙醇以料液比1:20，分别在室温(25℃)、40℃、60℃和80℃下超声提取40min，以检测超声提取水浴温度对RA和STV得率及其得率比例的影响。

图3结果显示，超声提取水浴温度对RA和STV得率及其得率比例的影响不明显，但当超声提取水浴温度超过40℃时，RA和STV得率表现出轻微的下降；而RA和STV得率比例受超声提取水浴温度的影响不明显，各处理间差异不显著。

2.2正交设计实验

根据实验2.1.1、实验2.1.2和实验2.1.3的结果，用正交设计实验联合分析提取用乙醇体积分数、超声提取水浴温度和超声提取时间等三因素对RA和STV得率的影响，具体的实验及分析结果见表1。

表1

RA和STV得率受提取用乙醇体积分数、超声提取水浴温度和超声提取时间等三因素影响由强到弱的顺序都表现为超声提取时间>提取用乙醇体积分数>超声提取水浴温度。在上述三因素中，除提取温度对RA和STV得率的影响都一样外(最佳提取温度为40℃)，提取用乙醇体积分数和超声提取时间对RA和STV得率的影响不同。

首先，提取用乙醇体积分数对RA和STV得率影响出现极化现象，即，对RA最适合的提取用乙醇体积分数为30％，而对STV最适合的提取用乙醇体积分数为70％；而超声提取时间对RA和STV得率的影响都表现为适当延长超声提取时间可以提高RA和STV得率，对RA最适合的超声提取时间为60min，而对STV最适合的超声提取时间为40min。

为实现对甜叶菊资源的RA和STV含量特性的同步检测，结合表1结果，本研究将甜叶菊叶片RA和STV提取各参数确定为：提取用乙醇体积分数为50％、超声提取水浴温度为40℃、超声提取时间为60min。

2.3验证对比实验

为进一步验证实验2.2所确定的超声提取各因素组合对RA和STV得率及其得率比例的影响，本实验在正交设计实验2.2的基础上，联合已发表的相关方法对本研究正交设计实验2.2所确定的RA和STV提取方法进行了验证。

表2

图4的结果表明，与已发表的5种方法相比较，实验2.2所确定的方法在提高RA和STV得率、维持RA和STV得率比例参数的稳定性上显示出了较好的优越性，可为准确评估甜叶菊种质叶片RA和STV含量及其比例提供更可靠的提取方法。

3.讨论和结论

RA和STV为现有甜叶菊栽培品种叶片中的主要甜菊糖苷类物质，随着市场对RA需求量的增加^[11]，须大力开展高RA苷含量和高RA/STV含量比值的甜叶菊新品种选育，为促进甜叶菊新品种的选育，有必要建立一种可用于甜叶菊种质RA和STV含量特性分析的快速、简便、高效的RA和STV提取方法。超声助溶乙醇提取法以其溶媒极性可调、操作简便、提取效率高、环境污染小而被广泛应用于植物化学组分的分离提取，但在甜叶菊RA和STV提取分离中还未见报道。为此，本研究对以水和乙醇的混合溶媒在甜叶菊种质评价时RA和STV提取上的应用进行了探讨。

正交设计实验结果表明提取用溶媒极性对RA和STV得率影响是除提取时间外影响最大的因素(表1)。现有的RA和STV提取方法都是基于单一溶媒(水或甲醇)而建立的，我们在研究中发现RA和STV具有不同的水溶性，其中RA由于其分子结构上具有3个葡萄糖基团，其水溶性较STV强，而STV的脂溶性较强(未发表资料)。图1的结果显示：RA和STV得率在纯水和纯乙醇的情况下远低于使用混合溶媒的情况，这是到目前为止有关混合溶媒在RA和STV提取上的首次应用报道。这一结果同时也得到了实验2.3中相关研究结果的印证(图4)，表明在甜叶菊种质评价中，与采用纯合试剂作为提取用溶媒相比，较宜利用两极性不同的溶剂配制为混合溶剂来提取。可以进一步推断的是，由于甜叶菊体内存在的30多种甜菊糖苷类化合物间分子结构和极性差异大，若欲进一步详细评价甜叶菊种质中各甜菊糖苷组分含量，深入评估不同极性混合溶媒在各甜菊糖苷组分提取中的可行性应是一个大的研究方向。

适宜水浴温度可促进溶质向溶媒的扩散，提高超声提取效率，图3的结果显示，与常温相比较，当水浴温度为40℃时，RA和STV的得率有所提高；但是，当水浴温度高于40℃时，RA和STV的得率反倒表现出不明显的轻微下降，这可能是由于过高的提取温度易于引起混合溶媒中乙醇的部分挥发，使提取体系中的乙醇随提取时间的延长而部分减少所致。需要说明的是，为克服这一现象，本研究采用的是密闭体系，但也观察到提取用试管的局部区域出现液滴，这有可能就是在超声过程中挥发出的乙醇，从而引起与物料实际接触的溶媒中乙醇量减少。当然，有水浴温度所引起的提取体系局部乙醇量轻微减少对RA和STV得率影响并不严重，因为实验2.2的正交设计分析结果表明提取用水浴温度对RA和STV的得率的影响在本研究所探讨的3个因素中为最小，这一结果也为实验2.1.3有关超声提取水浴温度对RA和STV得率及其得率比例影响不明显的结果所印证。

与现有方法相比较，本研究所建立的RA和STV提取方法的优越性体现为：

表3

最后，通过与已发表的现有提取方法相比较，本研究建立了一种在RA和STV得率等方面明显优于已有方法，为更充分地提取甜叶菊叶片所含以RA和STV为代表的甜菊糖苷，为更快速准确地评价甜叶菊种质RA和STV含量特性奠定了基础，具有快速、简便、高效等特点，具体的提取方法为：将甜菊叶片粉末按料液比1:20(m:v)加入50％乙醇，室温振荡过夜，40℃下超声提取60分钟。

Claims (2)

1.一种甜菊叶片RA和STV提取工艺的方法，其特征在于：

将甜菊叶片粉末按料液比m:v=1:18-22加入48-52%的乙醇，室温振荡过夜，38-42℃下超声提取55-65分钟,9000-10000rpm离心8-12min，取上清，0.45μm左右的有机微孔滤膜过滤，即得。

2.根据权利要求1所述的一种甜菊叶片RA和STV提取工艺的方法，其特征在于：

所述的甜叶菊粉末的制备方法为：将所得甜叶菊叶片剔除杂质和色泽灰暗者后，80℃左右烘干，于研钵中研磨充分，过40-60目筛，得甜菊叶片粉末于干燥器中保存备用。