CN105273036A - 一种甾体皂类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甾体皂类化合物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。该甾体皂类化合物，是从金线重楼中提取分离得到的一种新的甾体皂苷类化合物，结构中苷元及3位糖链在重楼属中较为罕见，通过核磁及ESI-MS分析，确定其分子式为C₅₇H₉₂O₂₅。该化合物对缺氧/复氧模型诱导的心肌细胞损伤有保护作用，能够提高缺氧/复氧损伤后心肌细胞的存活率，降低血清中LDH含量，有望成为新的治疗心血管疾病的药物。上述甾体皂类化合物的制备方法，是从金线重楼中提取分离，方法操作简单，提取出的甾体皂类化合物纯度高、收率好。

Description

一种甾体皂类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从重楼属(Paris)植物中分离的甾体皂类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

中药重楼来源于百合科(Liliaceae)重楼属植物，主要分布于亚欧大陆的热带和温带地区，全世界共有24个种，我国种类最多，有19种，以西南各省区的种类和资源最为丰富。本属植物是一类极具药用价值的植物，其根茎在我国有着悠久的药用历史，具有清热解毒、消肿止痛和凉肝定惊之功效，用于治疗痈疮、毒蛇咬伤、凉风抽搐、咽喉肿痛和跌打伤痛等症。现代药理学研究表明重楼属植物具有抗肿瘤、心脏保护、肾脏保护及抗炎等作用。

金线重楼(Parispolyphyllavar.latifolia)主要分布于四川、云南、江西、湖北和陕西等地，有关该植物化学成分及药理活性的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甾体皂类化合物及其制备方法和应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种甾体皂类化合物，其化学结构式如下：

该甾体皂类化合物的分子式为C₅₇H₉₂O₂₅；命名为：26-O-β-D-吡喃葡萄糖-3β,26-二羟基-25(R)-Δ5,22-二烯-呋甾-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

本发明还公开了上述的甾体皂类化合物在制备治疗心血管疾病的药物和/或保健品中的应用。

所述的药物和/或保健品为对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤有保护作用的药物和/或保健品。

所述的药物和/或保健品为降低细胞血清中LDH含量的药物和/或保健品。

所述的药物和/或保健品为提高缺氧/复氧损伤后心肌细胞存活率的药物和/或保健品。

本发明还公开了一种甾体皂类化合物的制备方法，包括以下步骤：

1)将金线重楼药材粉碎后，加醇回流提取后，回收溶剂，得醇提物；

2)将醇提物分散于水中，先用石油醚萃取，再将萃取后的水相用正丁醇萃取，得到正丁醇萃取液；

3)将正丁醇萃取液采用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含甾体皂类化合物的馏分。

步骤1)中，金线重楼药材与加入的醇的料液比为1g:(8～10)mL；加入的醇为甲醇或乙醇；回流提取1～3次，每次1～3h。

步骤2)中，醇提物与水的用量比为1g：(4～8)mL；萃取时，先用石油醚萃取2～4次，再将萃取后的水相用正丁醇萃取2～4次；步骤3)是以体积比为10:1:0～6.5:3.5:1的氯仿-甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱。

在步骤3)收集含甾体皂类化合物的馏分后，还包括采用高效液相色谱分离纯化的步骤，具体操作为：将含甾体皂类化合物的馏分以体积比为70:30的甲醇-水混合溶剂为流动相进行洗脱，制得甾体皂类化合物纯品

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开的甾体皂类化合物，是从金线重楼中提取分离得到的一种新的甾体皂苷类化合物，结构中苷元及3位糖链在重楼属中较为罕见，通过核磁及ESI-MS分析，确定其分子式为C₅₇H₉₂O₂₅。

本发明通过体外活性试验证实，该化合物对缺氧/复氧模型诱导的心肌细胞损伤有保护作用，能够提高缺氧/复氧损伤后心肌细胞的存活率，降低血清中LDH含量，有望成为新的治疗心血管疾病的药物。

本发明还公开了上述甾体皂类化合物的制备方法，是从金线重楼中提取分离，方法操作简单，提取出的甾体皂类化合物纯度高、收率好。

附图说明

图1为化合物GDFR的HR-ESI-MS谱。

图2为化合物GDFR的1HNMR谱；

图3为化合物GDFR的13C-NMR谱

图4为化合物GDFR的DEPT(135°)谱

图5为化合物GDFR的HSQC谱

图6为化合物GDFR的1H-1HCOSY谱

图7为化合物GDFR的HMBC谱

图8为化合物GDFR的TOCSY谱

图9为化合物GDFR的NOESY谱

图10为化合物GDFR关键的HMBC和NOESY相关图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定，未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。未详细叙述的测试方法和英文缩写属本行业的常用方法和公知常识，在网上或文献中可以检索到。

本发明公开的甾体皂类化合物，如式Ι所示：

上述结构其化学名称为26-O-β-D-吡喃葡萄糖-3β,26-二羟基-25(R)-Δ5,22-二烯-呋甾-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

26-O-β-D-glucopyranosyl-3β,26-dihydroxy-25(R)-furosta-5,20(22)-dien-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside)。

该化合物是从金线重楼中分离的新的甾体皂苷类化合物，以下简称其为GDFR。

所述式I化合物GDFR的制备方法，具体步骤如下：该化合物的制备方法是金线重楼药材经粉碎后，按重量体积比加入8～10倍原料重的甲醇或乙醇回流提取，共提取3次，每次1～3小时。合并后回收溶剂，得醇提取物，提取物分散于按重量体积比4～8倍的水中，依次用石油醚、水饱和正丁醇萃取3次，分别得到石油醚和正丁醇的两个萃取部位。正丁醇层采用硅胶柱层析，以体积比为10:1:0～6.5:3.5:1的氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，收集含式I化合物GDFR的流份，最后经高效液相色谱仪分离纯化，体积比为70:30的甲醇-水混合溶剂为流动相洗脱，得到GDFR的纯品。

所述的式I化合物GDFR的制备方法，除应用常规的溶剂提取、溶剂萃取和各种色谱分离技术外，在制备总皂苷时，对包含有GDFR的总皂苷的确定是采用如下手段来检查的：以硅胶薄层层析检测，采用体积比为10:1的水饱和正丁醇-甲醇混合溶剂或体积比为6.5:3.5:1的氯仿-甲醇-水混合溶剂展开，收集R_f值在0.2～0.35处显示紫红色斑点的流份，即为总皂苷。

所述的式I化合物GDFR在浓度为25μmol/L～100μmol/L时能够提高缺氧/复氧损伤后心肌细胞的存活率，降低血清中LDH含量，且呈一定的剂量依赖性。

本发明的特点是：式Ι化合物GDFR苷元及3位糖链在重楼属中较为罕见。该化合物对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤有明显的保护作用，表明其可以进一步研发为新的治疗心血管疾病的药物。

本发明从金线重楼中通过提取、分离纯化得到式Ι化合物GDFR，该化合物可为研制新的心血管药物提供了先导化合物。

1、化合物的提取和分离

采自陕西省宝鸡市太白县金线重楼根茎为原料，经粉碎成粗粉后，取10公斤，加入80升浓度为70％的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次2小时。合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物780克。

将乙醇提取物分散于8升水中，用石油醚萃取3次，每次8升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次8升，合并正丁醇萃取液，回收溶剂得到总皂苷提取物140克。

采用硅胶柱层析，以体积比为10:1:0.1～6.5:3.5:1(均取下层作为洗脱液)的氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，按150mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检测(薄层展开溶剂采用体积比为10:1的水饱和正丁醇-甲醇混合溶剂，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105℃加热显色)，收集R_f值在0.2～0.35处显示紫红色斑点的流份，即为含化合物GDFR的总皂苷混合物，减压蒸干溶剂后得2.1克样品。

最后经高效液相色谱仪(戴安公司)分离纯化(HPLC条件为：YMC-PackR&DODS-A色谱柱20×250mm，70％甲醇为流动相，流速7mL/min，25℃，206nm紫外检测)，得到GDFR的纯品40.1毫克。

2、化合物的结构鉴定

白色无定形粉末(MeOH)，Liebermann-Burchard和Molish反应均呈阳性，提示该化合物可能为皂苷类化合物。具体结构鉴定参见图1～图10：

参见图1，ESI-MS给出其准分子离子峰m/z1199[M+Na]⁺和m/z1175[M-H]^-，HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z1199.5834[M+Na]⁺(calc.forC₅₇H₉₂O₂₅Na1199.5825)，结合¹³C-NMR(125MHz，pyridine-d₅)数据(Table1)，确定其分子式为C₅₇H₉₂O₂₅。

参见图2，¹H-NMR图谱的高场区存在7个单峰，推测这些峰为甲基的特征信号峰，分别是δ0.74(3H，s，CH₃-18)，0.97(3H，s，CH₃-27)，1.07(3H，s，CH₃-19)，1.26(3H，d，J＝6.1Hz，CH₃-6””)，1.27(3H，d，J＝6.1Hz，CH₃-6”)，1.31(3H，d，J＝6.2Hz，CH₃-6”')，1.62(3H，s，CH₃-21)，低场区可观察到1个宽单峰，推测其为烯烃的特征信号峰，是δ5.42(1H，brs，H-6)。

通过对¹³C-NMR图谱(125MHz)和HSQC图谱的观察分析，见图3和图5，可以得到7个甲基碳信号δ14.27(C-18)，17.46(C-27)，20.02(C-19)，18.00(C-6””)，18.15(C-6”)，18.70(C-6”')，δ12.08(C-21)，一个双键碳信号δ122.77(C-6)和142.00(C-5)。同时，在低场区还存在一组双键信号δ105.27(C-20)，δ153.02(C-22)，与¹H-NMR谱中两个宽单峰的信号相结合，可以推测出化合物苷元有两个双键。其中一组双键信号δ122.77(C-6)和δ142.00(C-5)为甾体皂苷苷元的特征信号，即在苷元5位与6位之间。

将¹³C-NMR与螺甾烷的结构相比较，可以确定A环，B环，C环，D环和E环的结构，而在F环中20位碳信号与22位碳信号为季碳，而且在¹³C-NMR中没有看到螺甾烷中C-20的信号(δ109.5～110.5)，说明在这两个位置的有其他的官能团取代。分析谱图数据可知21位存在甲基信号，推测双键存在于C-20与C-22之间。由HMBC图谱中，如图7所示，δ105.27(C-20)与质子δ2.52(C-17)；δ153.02(C-22)与质子δ1.62(C-21)远程相关，符合上述的推测，说明双键确实存在于C-20和C-22之间。另外，在¹³C-NMR图谱中还可以观察到化合物的苷元部分存在一个次甲基碳信号δ79.41(C-3)和一个亚甲基碳信号δ75.92(C-26)，而这两个碳信号均向低场移动说明在苷元的3位与26位均链接有糖链。结合二维图谱¹H-¹HCOSY(图6)，HMBC(图7)，HSQC(图5)，NOESY(图9)、TOCSY(图8)以及GDFR关键的HMBC和NOESY相关图(图10)上的数据将苷元上所有的碳、氢信号进行全归属。具体数据见表1。与文献[方进波,陈家春,刘焱文,等.空心莲子草化学成分及抗癌活性研究.[J].中国中药杂志,2009,34(19)：2473-2476]中化合物6的¹³C-NMR谱数据进行相互比对，结果发现这两个化合物苷元部分的¹³C-NMR谱数据和¹H-NMR谱数据基本一致。综合以上的数据信息可确定式化合物GDFR的苷元，且在苷元上的3位和26位均连有糖链。

酸水解后，经过GC分析，与标准糖衍生物比对，可以得出该化合物单糖的种类为D-Glucose和L-Rhanose，比例为2:3。从¹H-NMR图谱中，分析得到5个糖的端基质子信号δ4.53(1H，d，J＝7.8Hz，Glc'H-1)，5.21(1H，brs，Rha””H-1)，4.87(1H，brs，Rha”'H-1)，5.22(1H，brs，Rha”H-1)和4.27(1H，d，J＝7.8Hz，Glc””'H-1)。在HSQC图谱中找出对应相关的糖端基碳信号，分别是δ100.61(Glc'C-1)，102.46(Rha””C-1)，102.72(Rha”'C-1)，103.28(Rha”C-1)和104.60(Glc””'C-1)。通过¹H-¹HCOSY，HMBC，HSQC，NOESY以及TOCSY二维谱数据归属糖部分的所有的碳、氢信号。具体数据见表1。

HMBC图谱中，通过观察分析发现，Glc-H-1””'的质子信号δ4.27与C-26的碳信号δ75.92相关，说明苷元的C-26与Glc””'相连；Glc-H-1'的质子信号δ4.53与C-3的碳信号δ79.41相关，说明苷元的C-3与Glc'相连；Rha-H-1”的质子信号δ5.21与Glc-C-2'的碳信号δ79.56相关，说明Rha”与Glc'相连；Rha-H-1”'的质子信号δ4.87与Rha-C-2”的碳信号δ73.00相关，说明Rha”'与Rha”相连；Rha-H-1””的质子信号δ5.22与Rha-C-4”'的碳信号δ80.97相关，说明Rha””与Rha”'相连，这样就确认了单糖之间的链接顺序以及糖链的链接位置，此结果在NOESY图谱中得到了进一步的验证。

综合以上所有的图谱数据分析，最终确定化合物8的结构为26-O-β-D-吡喃葡萄糖-3β,26-二羟基-25(R)-Δ5,22-二烯-呋甾-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

表1式Ι化合物的¹H和¹³C核磁共振数据(测试溶剂：氘代吡啶)

Overlappedwithothersignals.

3、化合物体外抗心肌缺血作用的研究

对本发明公开的化合物GDFR体外抗心肌缺血活性采用MTT法、乳酸脱氢酶(LDH)含量测定法进行评价，试验所采用的细胞为新生大鼠心肌细胞。

(1)MTT法测定细胞存活率

根据细胞生长速率，将处于对数生长期的细胞以1×10⁴个细胞/孔接种于96孔培养板，贴壁生长48小时后，弃去原培养液，加入用DMEM培养液配制好的含不同浓度(25μmol/L～100μmol/L)本发明化合物的溶液200μL，每个浓度设6个复孔，并设盐酸地尔琉卓阳性对照、生理盐水对照和无细胞调零孔，置37℃培养箱(5％CO₂)中培养24小时。随后细胞置于缺氧箱(95％N₂+5％CO₂，37℃)中培养3小时，复氧培养(95％O₂+5％CO₂，37℃)2小时。加入PBS溶解的浓度为10mg/mL的MTT(Sigma公司)20μL，在正常条件下孵育4小时。最后，每孔加入200μL的二甲基亚砜，混匀。将96孔板置酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光度(OD)值。按下式计算被测物对细胞存活率：

细胞存活率＝治疗组OD值/对照组OD值×100％；

设对照组的细胞存活率为1。

统计学分析：

所有数据均采用SPSS15.0统计学软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为有统计学差异。试验结果见表2：

表2不同浓度式Ι化合物GDFR对缺氧3h/复氧2h大鼠心肌细胞存活率的影响

对照组比^##P<0.01，与模型组相比*P<0.05，**P<0.01，n＝10

与模型组比，25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L组均能提高缺氧/复氧损伤后心肌细胞的存活率，有一定的剂量依赖性。表明化合物GDFR对缺氧/复氧后的细胞损伤有抑制作用。

(2)LDH含量测定法

根据细胞生长速率，将处于对数生长期的细胞以5×10⁴个细胞/孔接种于96孔培养板，贴壁生长48小时后，弃去原培养液，加入用DMEM培养液配制好的含不同浓度(25μmol/L～100μmol/L)本发明化合物的溶液200μL，每个浓度设6个复孔，并设盐酸地尔琉卓阳性对照、生理盐水对照和无细胞调零孔，细胞在37℃、5％CO₂-95％O₂条件下培养24小时后，置于缺氧箱(5％CO₂-95％N₂,37℃)中培养3小时，再复氧培养(5％CO₂-95％O₂,37℃)2小时。细胞损伤指标乳酸脱氢酶(LDH)含量采用试剂盒(南京建成生物工程有限公司)测定，具体实验方法依据生产商提供的方法进行，660nm处采用酶标仪测定LDH的含量。

统计学分析：

所有数据均采用SPSS15.0统计学软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为有统计学差异。实验结果见表3：

表3不同浓度式Ι化合物GDFR对大鼠心肌细胞缺氧3h/复氧2h后LDH的影响

与对照组比^##P<0.01，与模型组相比**P<0.05，*P<0.01，n＝10

与模型组比，化合物GDFR25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L组均能显著降低细胞血清中LDH含量，且呈一定的剂量依赖性。提示GDFR对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤有保护作用，可望成为新的治疗心血管疾病的药物。

Claims (10)

1.一种甾体皂类化合物，其特征在于，其化学结构式如下：

2.根据权利要求1所述的甾体皂类化合物，其特征在于，该甾体皂类化合物的分子式为C₅₇H₉₂O₂₅；命名为：26-O-β-D-吡喃葡萄糖-3β,26-二羟基-25(R)-Δ5,22-二烯-呋甾-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

3.权利要求1所述的甾体皂类化合物在制备治疗心血管疾病的药物和/或保健品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物和/或保健品为对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤有保护作用的药物和/或保健品。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物和/或保健品为降低细胞血清中LDH含量的药物和/或保健品。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物和/或保健品为提高缺氧/复氧损伤后心肌细胞存活率的药物和/或保健品。

7.一种甾体皂类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将金线重楼药材粉碎后，加醇回流提取后，回收溶剂，得醇提物；

2)将醇提物分散于水中，先用石油醚萃取，再将萃取后的水相用正丁醇萃取，得到正丁醇萃取液；

3)将正丁醇萃取液采用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含甾体皂类化合物的馏分。

8.根据权利要求7所述的甾体皂类化合物的制备方法，其特征在于，步骤1)中，金线重楼药材与加入的醇的料液比为1g:(8～10)mL；加入的醇为甲醇或乙醇；回流提取1～3次，每次1～3h。

9.根据权利要求7所述的甾体皂类化合物的制备方法，其特征在于，步骤2)中，醇提物与水的用量比为1g：(4～8)mL；萃取时，先用石油醚萃取2～4次，再将萃取后的水相用正丁醇萃取2～4次；步骤3)是以体积比为10:1:0.1～6.5:3.5:1的氯仿-甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱。

10.根据权利要求7所述的甾体皂类化合物的制备方法，其特征在于，在步骤3)收集含甾体皂类化合物的馏分后，还包括采用高效液相色谱分离纯化的步骤，具体操作为：将含甾体皂类化合物的馏分以体积比为70:30的甲醇-水混合溶剂为流动相进行洗脱，制得甾体皂类化合物纯品。