CN104131043A - 一种提高古龙酸产酸的发酵方法 - Google Patents

一种提高古龙酸产酸的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种提高古龙酸产酸的发酵方法。本发明的发酵方法为：用巨大芽孢杆菌与氧化葡萄糖酸杆菌混合菌系为生产菌株，以山梨糖为原料进行有氧发酵，在前期流加葡萄糖，中后期流加牛肉蛋白胨。前期流加葡萄糖，可以让大菌生长迅速；中后期流加牛肉蛋白胨，可以解决小菌生长缓慢、产酸期短、产酸慢的问题。此发明方法可以提高发酵终点古龙酸的含量，提高产酸浓度，提升发酵生产效率，并且成功运用在500L发酵罐。

Description

一种提高古龙酸产酸的发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种提高古龙酸产酸的发酵方法。
背景技术
目前国内生产古龙酸多采用二步发酵法，二步发酵法通常采用混合菌系进行发酵，这种混合菌系最为常用的一种是氧化葡萄糖酸杆菌(俗称小菌)，另一种是巨大芽孢杆菌(俗称大菌)，其中小菌为产酸菌，胞内分泌L-山梨酮氧化酶，可以将山梨糖氧化成2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)，但是单独培养生长缓慢，产酸能力低；大菌不能产酸，但是可以作为小菌的伴生菌，在发酵中起辅助作用，促进小菌的生长和产酸。研究证实，大菌胞内液和胞外液菌均可以促进小菌生长，缩短小菌生长的延迟期，大菌的胞内液主要促进小菌生长，并促进2-KLG的合成，大菌的胞外液对小菌的产酸有促进作用，不影响小菌生长。
二步发酵法采用氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌组成的混菌发酵体系使得发酵过程控制更为复杂，两种细菌的比例对于2-KLG的生产具有显著影响，实际生产中难以对两菌比例进行控制。
经检索发现，公开号为CN103627775A，发明名称为一种提高2-酮基-L-古龙酸发酵生产效率的方法，公开了一种提高发酵生产效率的方法，采用流加胰酪蛋白胨的技术缩短了发酵周期，但在产酸上未有较大提高。
为了解决上述问题，本发明提出采用通过发酵罐不同阶段流加葡萄糖和牛肉蛋白胨来调整发酵过程中大小菌的生长比例，使营养条件有利于促进巨大芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌混菌系细胞生长，从而能延长氧化葡萄糖酸杆菌的产酸期，增加氧化葡萄糖酸杆菌的数量，使发酵终点古龙酸的含量达105～107mg/ml，提高产酸浓度10～17％，2-KLG的生物合成速度比原加式方法提高了0.3～0.5g/l/h，达到提高发酵产酸，提升发酵生产效率的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高古龙酸产酸的发酵方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：一种提高古龙酸产酸的发酵方法为用巨大芽孢杆菌与氧化葡萄糖酸杆菌混合菌系为生产菌株，以山梨糖为原料进行有氧发酵，在发酵过程的前期流加葡萄糖溶液，中后期流加牛肉蛋白胨。
具体的，本发明的提高古龙酸产酸的发酵方法，包括以下步骤：(1)制备巨大芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌的混合菌液，并接入到发酵初始培养基中；
(2)第一发酵阶段：控制发酵液PH值为6.5～6.7，在步骤(1)所得的混合物中流加葡萄糖溶液，使发酵液中葡萄糖浓度为1～3mg/ml，培养5～7h；
(3)第二发酵阶段：调整发酵液PH值为6.0～6.4，在步骤(2)所得的发酵液中流加葡萄糖溶液，使发酵液中葡萄糖浓度为1～3mg/ml，培养3～5h；
(4)第三发酵阶段：在步骤(3)所得发酵液的基础上，培养19～21h；
(5)第四发酵阶段：在步骤(4)所得发酵液的基础上，培养5～7h，在培养的过程中流加牛肉蛋白胨；
(6)第五发酵阶段：在步骤(5)所得发酵液的基础上，培养至发酵终点。
本申请中发酵终点的判断为本领域常规的技术手段，本发明中当耗糖速率小于0.5～0.8mg/ml/h时，即到达发酵终点。
其中，所述流加葡萄糖溶液的浓度为300～400mg/ml。
其中，步骤(5)牛肉蛋白胨的流加量与发酵液终体积的质量体积比为0.1～0.3g/100ml；优选的，牛肉蛋白胨分批流加到发酵液中；更优选的，牛肉蛋白胨分3批流加到发酵液中。
本发明的技术方案，步骤(1)～步骤(5)中流加山梨糖，使山梨糖浓度保持在15～20mg/ml，发酵温度为28～33℃。
其中，所述山梨糖的浓度为200～250mg/ml。
本发明的技术方案，步骤(1)中所述混合菌液中巨大芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌数量比为1:2～1:3。
步骤(1)将混合菌液接入到发酵初始培养基中，接种量为10～15％。
所述步骤(1)发酵初始培养基，按质量体积比包括2～2.5mg/100ml的山梨糖、0.9～1.2mg/100ml玉米浆、0.1～0.2mg/100ml的尿素、0.02～0.04mg/100ml的MgSO4·7H2O、0.05～0.08mg/100ml的KH2PO4，发酵初始培养基PH值为6.7～7.0。
优选的，所述步骤(1)发酵初始培养基，按质量体积比包括2mg/100ml的山梨糖，1.2mg/100ml的玉米浆、0.2mg/100ml的尿素、0.02mg/100ml的MgSO4·7H2O、0.05mg/100ml的KH2PO4，发酵初始培养基PH值为6.7。
本发明采用本领域常用的氧化葡萄糖酸杆菌(俗称小菌)和巨大芽孢杆菌(俗称大菌)制备菌液，菌液制备和接种采用常规的制备方法，本发明对此不做限定。
本发明前期流加葡萄糖，可以让大菌生长迅速；中后期流加牛肉蛋白胨，可以解决小菌生长缓慢、产酸期短、产酸慢的问题，并结合温度、pH、溶氧、低初糖和流加补糖等因素的控制，优化混菌发酵中大小菌的生长比例。本发明的方法可以提高发酵终点古龙酸的含量，提高产酸浓度，提升发酵生产效率，并且成功运用在500L发酵罐。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
如无特别指明，本发明采用本领域常用的氧化葡萄糖酸杆菌(俗称小菌，购自菌种保藏中心，保藏号CGMCC1.110)和巨大芽孢杆菌(俗称大菌，购自菌种保藏中心，保藏号CMCC(B)63103)制备菌液。
菌液制备采用常规的制备方法，可以但不限于以下制备方法：
冻存管--摇瓶活化24h--大小菌分别分离(28℃培养小菌2天，大菌2-3天)--选菌落饱满，边缘整齐，偏大的小菌单菌落挑一满环涂布试管(28℃培养一天)--搭上大菌，选菌落饱满，边缘整齐，大小适中的大菌单菌落在已搭过小菌的试管上(28℃培养2天)--用无菌水将试管上的菌苔洗下接种子瓶(28℃，200r/min，培养22h)。
固体培养基在进行菌种分离和制备试管时用，液体种子培养基在进行冻存管活化和种子扩大培养时用，固体培养基、液体种子培养基、摇瓶种子培养为本领域的常规技术手段，本发明的具体选择如下：
固体培养基(种子活化的平板培养基)包括山梨糖1.8mg/100ml、酵母膏0.3mg/100ml、玉米浆0.6mg/100ml、尿素0.3mg/100ml、MgSO4.7H2O0.04mg/100ml、KH2PO40.03mg/100ml、轻质CaCO30.5mg/100ml，琼脂2mg/100ml，PH＝7.0。
液体种子培养基(种子扩大培养用的摇瓶培养基)包括：山梨糖1.8mg/100ml、酵母膏0.3mg/100ml、玉米浆0.6mg/100ml、尿素0.3mg/100ml、MgSO4.7H2O0.04mg/100ml、KH2PO40.03mg/100ml、轻质CaCO30.5mg/100ml，PH＝7.0。
摇瓶种子培养：培养温度28℃，培养时间22h，摇床转速200r/min。此处摇瓶种子培养是将培养好的大小菌试管接入种子摇瓶进行培养的，目的是为了扩大培养。
实施例1
发酵初始培养基按质量体积比，包括山梨糖2mg/100ml，玉米浆1.2mg/100ml、KH2PO40.05mg/100ml、MgSO4.7H2O0.02mg/100ml、尿素0.2mg/100ml，初始PH为6.7，其中流加浓度为200mg/ml的山梨糖，初始山梨糖与其它培养基分开灭菌。
本实施例提高古龙酸产酸的发酵方法包括以下步骤：
(1)将培养好的氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液3L接入到10L含有2mg/100ml的山梨糖，1.2mg/100ml玉米浆、0.2mg/100ml的尿素、0.02mg/100ml的MgSO4·7H2O、0.05mg/100ml的KH2PO4的发酵培养基中，发酵容器采用30L自动发酵罐。
(2)第一发酵阶段：控制发酵液PH值为6.7，搅拌转速350rpm，通气比1：0.6vvm，在步骤(1)所得的混合物中流加300mg/ml葡萄糖溶液，使发酵液中葡萄糖浓度保持在1～3mg/ml，培养6h；
(3)第二发酵阶段：控制发酵液PH值为6.4，搅拌转速350rpm，通气比1：0.6vvm，在步骤(2)所得的发酵液中流加300mg/ml的葡萄糖溶液，使发酵液中葡萄糖浓度保持在1～3mg/ml，培养4h；
(4)第三发酵阶段：在步骤(3)所得发酵液的基础上，用碳酸钠溶液控制发酵液PH值为6.4，搅拌转速380rpm，通气比1：0.8vvm，培养20h；
(5)第四发酵阶段：在步骤(4)所得发酵液的基础上，用碳酸钠溶液控制发酵液PH值为6.4，搅拌转速450rpm，通气比1：1.2vvm，培养6h，在培养的过程中流加牛肉蛋白胨，牛肉蛋白胨分三批流加到发酵液中，培养开始时加入第一批，隔2小时后加入第二批，再隔2小时后加入第三批，所述三批牛肉蛋白胨的总流加量与发酵液终体积的质量体积比为0.1g/100ml；
(6)第五发酵阶段：用碳酸钠溶液控制发酵液PH值为6.4，搅拌转速450rpm，通气比1：1.2vvm，培养至发酵终点，用时10h。
在整个发酵过程中当残糖(山梨糖)降低到15mg/ml时，流加200mg/ml的山梨糖，使山梨糖浓度保持在15～20mg/ml，温度控制30℃。
发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量95.1mg/ml，发酵周期46h，产酸速率2.0g/l/h。
实施例2
本实施例的制备方法与实施例1相同，不同之处仅为发酵初始培养基。本发明的发酵初始培养基，按质量体积比包括2.5mg/100ml的山梨糖、0.9/100ml玉米浆、0.1/100ml的尿素、0.04mg/100ml的MgSO4·7H2O、0.08mg/100ml的KH2PO4，发酵初始培养基PH值为7.0，其中流加浓度为250mg/ml的山梨糖，初始山梨糖与其它培养基分开灭菌。
本实施中，发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量93.2mg/ml，发酵周期47h，产酸速率1.98g/l/h。
实施例3
本实施例的制备方法与实施例1相同，不同之处仅为第一发酵阶段，控制发酵液PH值为6.5，第二发酵阶段～第五发酵阶段控制发酵液PH值为6.4。
本实施例中，发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量94.3mg/ml，发酵周期45h，产酸速率2.0g/l/h。
实施例4
本实施例的制备方法与实施例1相同，不同之处仅为第一发酵阶段，发酵7h，第二发酵阶段，发酵5h，第三发酵阶段，发酵19h，第四发酵阶段，发酵5h，第五发酵阶段至发酵终点。
本实施例中，发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量92.8mg/ml，发酵周期47h，产酸速率1.97g/l/h。
实施例5
本实施例的制备方法与实施例1相同，不同之处仅为第一发酵阶段，发酵5h，第二发酵阶段，发酵3h，第三发酵阶段，发酵21h，第四发酵阶段，发酵7h，第五发酵阶段至发酵终点。
本实施例中，发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量94.6mg/ml，发酵周期48h，产酸速率1.97g/l/h。
实施例6
发酵初始培养基按质量体积比，包括山梨糖2mg/100ml，玉米浆1.2mg/100ml、KH2PO40.05mg/100ml、MgSO4.7H2O0.02mg/100ml、尿素0.2mg/100ml，初始PH为6.7，其中流加浓度为200mg/ml的山梨糖，初始山梨糖与其它培养基分开灭菌。
本发明提高古龙酸产酸的发酵方法包括以下步骤：
(1)将培养好的氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液52L接入到180L含有2mg/100ml的山梨糖，1.2mg/100ml玉米浆、0.2mg/100ml尿素、0.02mg/100ml MgSO4·7H2O、0.05mg/100ml KH2PO4的发酵培养基中，发酵容器采用500L自动发酵罐；
(2)第一发酵阶段：控制发酵液PH值为6.5～6.7，搅拌转速200rpm，通气比1：0.4vvm，在步骤(1)所得的混合物中流加400mg/ml葡萄糖溶液，使发酵液中葡萄糖浓度保持在1～3mg/ml，培养6h；
(3)第二发酵阶段：控制发酵液PH值为6.0～6.4，搅拌转速200rpm，通气比1：0.4vvm，在步骤(2)所得的发酵液中流加400mg/ml的葡萄糖溶液，使发酵液中葡萄糖浓度保持在1～3mg/ml，培养4h；
(4)第三发酵阶段：在步骤(3)所得发酵液的基础上，用碳酸钠溶液控制发酵液PH值为6.4，搅拌转速240rpm，通气比1：0.6vvm，培养20h；
(5)第四发酵阶段：在步骤(4)所得发酵液的基础上，用碳酸钠溶液控制发酵液PH值为6.4，搅拌转速280rpm，通气比1：0.8vvm，培养6h，在培养的过程中流加牛肉蛋白胨，牛肉蛋白胨的流加量与发酵液终体积的质量体积比为0.2g/100ml；
(6)第五发酵阶段：用碳酸钠溶液控制发酵液PH值为6.4，搅拌转速280rpm，通气比1：0.8vvm，培养至发酵终点，用时9h。
在整个发酵过程中当残糖(山梨糖)降低到15mg/ml时，流加250mg/ml的山梨糖，使山梨糖浓度保持在15～20mg/ml，温度控制30℃。
发酵液终点2--酮基-L-古龙酸含量107mg/ml，发酵周期45h，产酸速率2.37g/l/h。
对比例1
本对比例中发酵初始培养基与实施例1相同，具体的制备方法包括如下步骤：
(1)将培养好的氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液3L，接入到10L含有2mg/100ml的山梨糖、1.2mg/100ml玉米浆、0.2mg/100ml尿素、0.02mg/100ml MgSO4·7H2O、0.05mg/100ml KH2PO4的发酵培养基中，发酵容器采用30L自动发酵罐。
(2)第一发酵阶段：控制发酵液PH值为6.7，搅拌转速350rpm，通气比1：0.6vvm，培养6h；
(3)第二发酵阶段：用碳酸钠溶液控制发酵液PH值为6.4，搅拌转速350rpm，通气比1：0.6vvm，培养4h；
(4)第三发酵阶段：用碳酸钠溶液控制发酵液PH值为6.4，搅拌转速380rpm，通气比1：0.8vvm，培养20h；
(5)第四发酵阶段：用碳酸钠溶液控制发酵液PH值为6.4，搅拌转速450rpm，通气比1：1.2vvm，培养至发酵终点，用时20h。
在整个发酵过程中当残糖(山梨糖)降低到15mg/ml时，流加200mg/ml的山梨糖，使山梨糖浓度保持在15～20mg/ml，温度控制30℃。
本对比例中，发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量82.26mg/ml，发酵周期50h，产酸速率1.65g/l/h。
实施例1中，发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量95.1mg/ml，发酵周期46h，产酸速率2.0g/l/h。实施例1较对比例1产酸提高12.84％，周期缩短4h，产酸速率提高0.35g/l/h，产酸速率提高了21.2％。
在发酵过程中通过镜检观察对比例1和实施例1大小菌的比例(如表1)，可以发现在前期流加葡萄糖和在中后期流加牛肉蛋白胨可以优化大小菌的比例关系，提高产酸。
表1  发酵过程中大小菌的比例关系
项目 10h(大菌：小菌) 20h(大菌：小菌) 30h(大菌：小菌) 40h(大菌：小菌)
对比例1 6：4 5：5 4：6 2：8
实施例1 7：3 5：5 3：7 1：9
对比例2
本对比例中发酵初始培养基与实施例6相同，具体的制备方法包括如下步骤：
(1)将培养好的氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液52L，接入到180L含有2mg/100ml的山梨糖、1.2mg/100ml玉米浆、0.2mg/100ml尿素、0.02mg/100ml MgSO4·7H2O、0.05mg/100ml KH2PO4的发酵培养基中，发酵容器采用500L自动发酵罐。
(2)第一发酵阶段：控制发酵液PH值为6.7，搅拌转速200rpm，通气比1：0.4vvm，培养6h；
(3)第二发酵阶段：用碳酸钠溶液控制发酵液PH值为6.4，搅拌转速200rpm，通气比1：0.4vvm，培养4h；
(4)第三发酵阶段：用碳酸钠溶液控制发酵液PH值为6.4，搅拌转速240rpm，通气比1：0.6vvm，培养20h；
(5)第四发酵阶段：用碳酸钠溶液控制发酵液PH值为6.4，搅拌转速450rpm，通气比1：1.2vvm，培养至发酵终点，用时18h。
在整个发酵过程中当残糖(山梨糖)降低到15mg/ml时，流加250mg/ml的山梨糖，使山梨糖浓度保持在15～20mg/ml，温度控制30℃。
对比例2发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量90mg/ml，发酵周期48h，产酸速率1.875g/l/h。
实施例6发酵液终点2-酮基-L-古龙酸含量107mg/ml，发酵周期45h，产酸速率2.37g/l/h。实施例6较对比例2产酸提高17％，周期缩短3h，产酸速率较对照组提高0.5g/l/h，产酸速率提高了26.4％。
在发酵过程中通过镜检观察对比例2和实施例6大小菌的比例(如表2)，可以发现在前期流加葡萄糖和在中后期流加牛肉蛋白胨可以优化大小菌的比例关系，提高产酸。
表2  发酵过程中大小菌的比例关系
项目 10h(大菌：小菌) 20h(大菌：小菌) 30h(大菌：小菌) 40h(大菌：小菌)
对比例2 6：4 5：5 4：6 2：8
实施例6 7：3 5：5 3：7 1：9
由此可见，本发明可以提高发酵终点古龙酸的含量，提高产酸浓度，提升发酵生产效率，并且成功运用在500L发酵罐。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种提高古龙酸产酸的发酵方法，用巨大芽孢杆菌与氧化葡萄糖酸杆菌混合菌系为生产菌株，以山梨糖为原料进行有氧发酵，其特征在于：在发酵过程的前期流加葡萄糖溶液，中后期流加牛肉蛋白胨。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备巨大芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌的混合菌液，并接入到发酵初始培养基中；
(2)第一发酵阶段：控制发酵液PH值为6.5～6.7，在步骤(1)所得的混合物中流加葡萄糖溶液，使发酵液中葡萄糖浓度为1～3mg/ml，培养5～7h；
(3)第二发酵阶段：调整发酵液PH值为6.0～6.4，在步骤(2)所得的发酵液中流加葡萄糖溶液，使发酵液中葡萄糖浓度为1～3mg/ml，培养3～5h；
(4)第三发酵阶段：在步骤(3)所得发酵液的基础上，培养19～21h；
(5)第四发酵阶段：在步骤(4)所得发酵液的基础上，培养5～7h，在培养的过程中流加牛肉蛋白胨；
(6)第五发酵阶段：在步骤(5)所得发酵液的基础上，培养至发酵终点。
3.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于：所述流加葡萄糖溶液的浓度为300～400mg/ml。
4.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于：步骤(5)牛肉蛋白胨的流加量与发酵液终体积的质量体积比为0.1～0.3g/100ml。
5.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：步骤(1)～步骤(5)中流加山梨糖，使山梨糖浓度保持在15～20mg/ml，发酵温度为28～33℃。
6.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于：所述山梨糖的浓度为200～250mg/ml。
7.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述混合菌液中巨大芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌数量比为1:2～1:3。
8.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：步骤(1)将混合菌液接入到发酵初始培养基中，接种量为10～15％。
9.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述步骤(1)发酵初始培养基，按质量体积比包括2～2.5mg/100ml的山梨糖、0.9～1.2mg/100ml玉米浆、0.1～0.2mg/100ml的尿素、0.02～0.04mg/100ml的MgSO4·7H2O、0.05～0.08mg/100ml的KH2PO4，发酵初始培养基PH值为6.7～7.0。
10.根据权利要求9所述的发酵方法，其特征在于：所述步骤(1)发酵初始培养基，按质量体积比包括2mg/100ml的山梨糖，1.2mg/100ml的玉米浆、0.2mg/100ml的尿素、0.02mg/100ml的MgSO4·7H2O、0.05mg/100ml的KH2PO4，发酵初始培养基PH值为6.7。
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CN101736071A (zh) * 2009-12-24 2010-06-16 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 一种2-酮基-l-古龙酸的生产方法

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