CN104109534A - 一种氮掺杂石墨烯量子点双光子荧光探针的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氮掺杂石墨烯量子点，其制备方法及其作为双光子荧光探针在活细胞成像中的应用。本发明的氮掺杂石墨烯量子点制备方法简便；用于活细胞的双光子荧光成像效果好，在较宽的pH值范围内具有非常强的双光子荧光，双光子吸收截面可达48,000GM；极易溶于水，无毒性，光稳定性好；溶液具有极强的稳定性，可以在24个月内保持稳定，具有广泛的应用前景。

Description

一种氮掺杂石墨烯量子点双光子荧光探针的制备及其应用

技术领域

本发明涉及一种双光子荧光探针的制备方法及其应用，具体地说是一种氮掺杂石墨烯量子点双光子荧光探针的制备方法及其在活细胞成像中的应用。

背景技术

双光子荧光显微成像兼具诸如近红外激发、激发光对生物组织的较深穿透能力、光毒性低、生物体自发背景荧光弱等特点而显著地优于传统的单光子荧光显微成像，是生命科学研究领域中最为重要而有力的工具之一。激光扫描共聚焦双光子荧光显微镜的出现促进了双光子荧光显微成像技术的发展，在活体生物组织成像领域展示出了极好的应用前景，受到人们越来越多的重视。为了提高成像效果和在生物组织中的成像深度，使激光扫描共聚焦双光子显微镜得到最广范围的应用，开发高效的双光子荧光探针十分必要。

一直以来，研究较多的双光子荧光材料包括半导体量子点如硒化镉、有机分子等等。但是半导体量子点中重金属的潜在毒性和有机分子的光漂白性限制了它们作为双光子荧光探针在生物成像领域中的进一步应用，尤其是对深层生物组织的成像和生物体生命活动的长期实时监测。

近年来，荧光碳纳米材料（包括碳点、刚刚兴起的石墨烯量子点等）具有良好的生物相溶性和光稳定性，受到了研究者的广泛关注。Sun等报道了经聚乙二醇表面修饰的碳点具有较大的双光子吸收截面，可用于癌细胞的双光子成像，但是所报导的碳点需要在极端条件如激光消融剥离下制备并且产率比较低。

石墨烯量子点（<10nm）由于其显著的量子尺寸效应和边缘效应，具有很强的荧光，根据理论研究，预测石墨烯量子点的特殊结构使其具有较强的双光子吸收，可作为高效的双光子荧光探针用于生物成像。但是石墨烯量子点的双光子荧光性质和石墨烯量子点作为双光子荧光探针用于生物成像还未有研究报道。

发明内容

除非特别指出，本文所述的量子点是指准零维(quasi-zero-dimensional)的纳米材料，尺寸小于或者接近激子波尔半径（一般直径不超过10nm），由少量的原子所构成，量子局限效应(quantum confinement effect)特别显著。

除非特别指出，本文所述的石墨烯量子点为尺寸小于10nm的单层石墨烯，具有石墨烯(110)面上的晶格,并修饰有部分含氧官能团。

本发明的目的在于提供一种氮掺杂石墨烯量子点，其制备方法以及其在制备双光子荧光探针产品中的用途，以及提供其在活细胞成像中的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种氮掺杂石墨烯量子点，所述氮掺杂石墨烯量子点是包含连接于碳原子的羟基，羧基和烷胺基的石墨烯纳米片层；所述氮掺杂石墨烯量子点的平均直径为1.5～5nm，平均厚度为0.5～1nm，并且所述的氮掺杂石墨烯量子点包含的C、O、N三种元素的摩尔百分比分别为75～85%、24～12%和1～3%。

在本发明一个优选的方面，所述的烷胺基为-NR₂，且R为-CH₃或-C₂H₅。

在本发明一个优选的方面，所述的所述氮掺杂石墨烯量子点的平均直径为3nm。

在本发明一个优选的方面，所述的氮掺杂石墨烯量子点包含有C、O、N三种元素，其摩尔百分比分别为81.48%、16.24%和2.28%。

在本发明一个优选的方面，所述的氮掺杂石墨烯量子点具有如图2所示的X射线光电子能谱图和/或图3所示的红外吸收光谱。

在本发明另一个方面，提供了制备前文所述的氮掺杂石墨烯量子点的方法，其特征在于：该方法以石墨片为起始原料，以及该方法包括步骤：氧化、超声剥离、溶剂热氮掺杂及纯化。

在本发明一个优选的方面，所述的氧化步骤包括用浓硫酸、K₂S₂O₈和P₂O₅处理石墨片，反应后产物用水稀释，过滤，洗涤，然后干燥，得到氧化石墨烯。

在本发明一个优选的方面，所述的超声剥离步骤包括将经洗涤和干燥的氧化石墨烯加入到酰胺类有机溶剂中并超声处理20～50分钟，氧化石墨烯的浓度为1～6mg/mL；优选地，所述的酰胺类溶剂是N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二乙基甲酰胺；和/或优选地，超声处理30分钟，以及氧化石墨烯的浓度为3.33mg/mL。

在本发明一个优选的方面，所述的溶剂热氮掺杂是以酰胺类溶剂作为氮源，将石墨片经氧化和超声剥离得到的氧化石墨烯在155～220℃下进行溶剂热处理4-8小时；优选地，在160～200℃下进行溶剂热处理4-6小时，例如在200oC下进行溶剂热反应4.5小时；和/或优选地，所述的酰胺类溶剂是N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二乙基甲酰胺。

在本发明一个优选的方面，所述的纯化步骤包括经微孔滤膜过滤和干燥的步骤；优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.2～0.45微米；更优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.22微米。

在本发明另一个方面，提供了前文所述的氮掺杂石墨烯量子点在活细胞双光子成像中的应用；优选地，所述的活细胞为Hela细胞。

在本发明另一个方面，提供了一种活细胞荧光成像的方法，其包括步骤：1）将活细胞与包含前文所述的氮掺杂石墨烯量子点的培养基共同培养2-12小时，且氮掺杂石墨烯量子点的浓度为80-120μg氮掺杂石墨烯量子点/1ml培养基；2）在双光子显微镜下对培养得到的细胞进行观测；优选地，在观测中的激发波长为800nm；和/或优选地，所述的活细胞为Hela细胞；和/或优选地，氮掺杂石墨烯量子点的浓度为100μg氮掺杂石墨烯量子点/1ml培养基。

与此同时，本申请还提供了如下的技术方案：所述氮掺杂石墨烯量子点是包含一定数量的连接于碳原子的羟基、羧基和烷基氨基团（-NR₂）的石墨烯纳米片层，其中R基团为-CH₃或-C₂H₅；并且所述氮掺杂石墨烯量子点平均直径为3nm，平均厚度为0.5～1nm，包含有C、O、N三种元素，其摩尔百分比分别为81.48%,16.24%，2.28%。

在本发明一个优选的方面，所述的氮掺杂石墨烯量子点具有如图2所示的X射线光电子能谱图和图3所示的红外吸收光谱。

在本发明的另一个方面，以石墨片（购自alfa aser,325目）为原料，酰胺类溶剂为氮源，提供了制备上述氮掺杂石墨烯量子点的方法，其包括步骤氧化、超声剥离以及溶剂热处理掺杂氮，与现有技术的区别是所述溶剂热处理掺杂氮是指经氧化、剥离得到的氧化石墨烯以酰胺类溶剂作氮源及溶剂经200℃加热处理时，酰胺类溶剂在高于沸点温度时分解为烷基胺，而分解得到的烷基胺与氧化石墨烯量子点表面的环氧基团发生开环反应生成1,2-氨基醇，氮原子得以掺杂到石墨烯量子点中，得到氮掺杂的石墨烯量子点。

具体操作步骤如下：

1）用浓硫酸、K₂S₂O₈、P₂O₅预处理石墨片，反应后产物用水稀释，过滤，洗涤，然后放入真空烘箱干燥。将经洗涤和干燥的氧化石墨烯加入到酰胺类有机溶剂中并超声处理20～50分钟，氧化石墨烯的浓度为1～6mg/mL；优选地超声处理30分钟以及氧化石墨烯的浓度为3.33mg/mL；2）将步骤1）中得到的分散液在155-220°C下进行溶剂热反应4-8小时；优选地步骤1）中得到的分散液在200°C下进行溶剂热反应4.5小时；3）将步骤2）中得到的反应液使用微孔滤膜过滤，并旋蒸除去溶剂。

在本发明一个优选的方面，在步骤1）中所述的酰胺类溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二乙基甲酰胺。

在本发明一个优选的方面，在步骤3）中的滤膜的孔径为0.2～0.45微米；优选地，该孔径为0.22微米。

在本发明另一个方面，提供了上述氮掺杂石墨烯量子点作为双光子荧光探针进行活细胞双光子成像的应用。其包括步骤：1）将前文所述的氮掺杂石墨烯量子点按照10～400μg/ml培养基的量加入到细胞的培养物中，优选地所述的氮掺杂石墨烯量子点按照50μg/ml培养基的量加入到细胞的培养物中；2）将上述细胞培养物继续培养1～24小时，优选地继续培养2小时；3）将所得到的细胞培养物在800nm的激发波长下进行双光子成像。

其中所述活细胞为Hela细胞。

试验结果证实，所述氮掺杂石墨烯量子点双光子荧光探针可用于活细胞成像，荧光显微图像说明氮掺杂石墨烯量子点主要分布在细胞质或细胞膜上。所述氮掺杂石墨烯量子点在较宽的pH值范围内具有非常强的双光子荧光，双光子吸收截面可达48,000GM，且极易溶于水，无毒性，光稳定性好，预示着该氮掺杂石墨烯量子点在双光子生物成像领域有广泛的应用。

本发明的氮掺杂石墨烯量子点具有以下的优点：

1）制备方法简便；

2）本发明所述的氮掺杂石墨烯量子点由于边缘存在羧基和羟基，极易溶于水，且在水中可稳定存在至少长达24个月，整个实验过程中氮掺杂石墨烯量子点的水溶液未出现任何沉淀；

3）本发明所述氮掺杂石墨烯量子点具有非常大的双光子吸收截面，可达48,000GM，且在较宽的pH值范围内均有较强的荧光，可应用于不同酸碱性的生理环境的双光子荧光探针

4）本发明所述氮掺杂石墨烯量子点CCK-8方法测试未发现有毒性，可进入细胞，对活细胞的进行双光子成像；

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1.显示了按照实施例2的方法所制备的氮掺杂石墨烯量子点的原子力扫描电镜图像（a）、透射电子显微镜图像（b）及其尺寸分布图像（c）。

图2.是按照实施例2的方法所制备的氮掺杂石墨烯量子点的X射线光电子能谱图，表明了其元素组成。

图3.显示了按照实施例4的方法所制备的氮掺杂石墨烯量子点的双光子激发荧光图谱和其在不同pH中的荧光强度变化。

图4.a）是按照实施例2的方法所制备的氮掺杂石墨烯量子点作为双光子荧光探针对Hela细胞进行双光子成像的荧光照片（实施例5）；b）是氮掺杂石墨烯量子点对Hela细胞的毒性测试结果。

具体实施方式

实施例1

氮掺杂石墨烯量子点的制备

本发明所使用的粉末状石墨片购自alfa aser,325目。

将15ml浓硫酸加热到90℃，加入2.5g K₂S₂O₈、2.5g P₂O₅,和3g粉末状石墨片反应4.5小时。反应后产物加入500ml去离子水稀释，过滤、洗涤，然后放入真空干燥箱。将120ml浓硫酸加入到干燥后的预处理氧化石墨中，搅拌均匀，于0℃冰浴中，缓慢加入15g高锰酸钾，待体系稳定之后撤掉冰浴，改为水浴，于35℃搅拌2h。然后改为冰浴，缓慢加入1000ml水进行稀释，溶液变为紫黑色，常温搅拌2h后，用玻璃滴管滴入20ml30%的H₂O₂，所得产物离心去掉上清液后用10%HCl洗涤至完全除去硫酸根，再用去离子水洗至中性，最后得到的固体放入真空烘箱中进行干燥。

取100mg干燥后的氧化石墨烯加入30ml N,N-二甲基甲酰胺，经20min超声剥离后，转入到聚四氟乙烯反应釜中，于160℃下反应4.5小时后，自然冷却至室温。将上述过程中所得到的反应产物用0.22微米滤膜过滤除去黑色沉淀，得到淡黄棕色氮掺杂石墨烯量子点溶液，经旋转蒸发除去溶剂和游离的N,N-二甲基甲酰胺分解产物（二甲胺）后，得到氮掺杂石墨烯量子点固体。氮掺杂石墨烯量子点通过原子力扫描电镜、X射线光电子能谱、双光子激发荧光和透射电子显微镜表征确认。

经表征，所述氮掺杂石墨烯量子点的平均直径为2.5nm，平均厚度为0.9nm，C、O、N三种元素的摩尔百分比分别为85%、13%和2%。

实施例2

氮掺杂石墨烯量子点的制备

将15ml浓硫酸加热到90℃，加入2.5g K₂S₂O₈、2.5g P₂O₅,和3g粉末状石墨片反应4.5小时。反应后产物加入500ml去离子水稀释，过滤、洗涤，然后放入真空干燥箱。将120ml浓硫酸加入到干燥后的预处理氧化石墨中，搅拌均匀，于0℃冰浴中，缓慢加入15g高锰酸钾，待体系稳定之后撤掉冰浴，改为水浴，于35℃搅拌2h。然后改为冰浴，缓慢加入1000ml水进行稀释，溶液变为紫黑色，常温搅拌2h后，用玻璃滴管滴入20ml30%的H₂O₂，所得产物离心去掉上清液后用10%HCl洗涤至完全除去硫酸根，再用去离子水洗至中性，最后得到的固体放入真空烘箱中进行干燥。

取100mg干燥后的氧化石墨烯加入30ml N,N-二甲基甲酰胺，经30min超声剥离后，转入到聚四氟乙烯反应釜中，于180℃下反应4.5小时后，自然冷却至室温。将上述过程中所得到的反应产物用0.22微米滤膜过滤除去黑色沉淀，得到淡黄棕色氮掺杂石墨烯量子点溶液，经旋转蒸发除去溶剂和游离的N,N-二甲基甲酰胺分解产物（二甲胺）后，得到氮掺杂石墨烯量子点固体。氮掺杂石墨烯量子点通过原子力扫描电镜、X射线光电子能谱、双光子激发荧光和透射电子显微镜表征确认。

经表征，所述氮掺杂石墨烯量子点的平均直径为3nm，平均厚度为0.7nm，C、O、N三种元素的摩尔百分比分别为81.48%、16.24%和2.28%。

实施例3

氮掺杂石墨烯量子点的制备

将15ml浓硫酸加热到90℃，加入2.5g K₂S₂O₈、2.5g P₂O₅,和3g粉末状石墨片反应4.5小时。反应后产物加入500ml去离子水稀释，过滤、洗涤，然后放入真空干燥箱。将120ml浓硫酸加入到干燥后的预处理氧化石墨中，搅拌均匀，于0℃冰浴中，缓慢加入15g高锰酸钾，待体系稳定之后撤掉冰浴，改为水浴，于35℃搅拌2h。然后改为冰浴，缓慢加入1000ml水进行稀释，溶液变为紫黑色，常温搅拌2h后，用玻璃滴管滴入20ml30%的H₂O₂，所得产物离心去掉上清液后用10%HCl洗涤至完全除去硫酸根，再用去离子水洗至中性，最后得到的固体放入真空烘箱中进行干燥。

取100mg干燥后的氧化石墨烯加入30ml N,N-二乙基甲酰胺，经50min超声剥离后，转入到聚四氟乙烯反应釜中，于200℃下反应6小时后，自然冷却至室温。将上述过程中所得到的反应产物用0.22微米滤膜过滤除去黑色沉淀，得到淡黄棕色氮掺杂石墨烯量子点溶液，经旋转蒸发除去溶剂和游离的N,N-二乙基甲酰胺分解产物后，得到氮掺杂石墨烯量子点固体。氮掺杂石墨烯量子点通过原子力扫描电镜、X射线光电子能谱、双光子激发荧光和透射电子显微镜表征确认。

经表征，所述氮掺杂石墨烯量子点的平均直径为3.5nm，平均厚度为1.0nm，C、O、N三种元素的摩尔百分比分别为87%、10.5%和2.5%。

实施例4

氮掺杂石墨烯量子点在不同pH下的荧光强度分析

加入不同量的氨水或盐酸调节氮掺杂石墨烯量子点水溶液的pH值至1～13，然后分别取不同pH值的氮掺杂石墨烯量子点水溶液3ml在荧光光谱仪（LS55-荧光/磷光/发光分光光度计）上测试荧光强度。

实施例5

Hela细胞的双光子细胞成像

在本申请的实施例中，除非另外地说明，Hela细胞由国家纳米科学中心生物效应安全实验室提供。

本实施例中所使用的氮掺杂石墨烯量子点是按照实施例2的方法所制备的氮掺杂石墨烯量子点。

Hela细胞接种密度为5×10⁵个/皿，所选细胞培养液为HDMEM（购自Hyclone），在37℃、CO₂培养箱孵育12小时后，培养液更换为含有氮掺杂石墨烯量子点的HDMEM培养液（50μg氮掺杂石墨烯量子点/1ml培养基）在同样的条件下再培育2小时后，将细胞置于激光扫描共聚焦双光子显微镜（尼康，A1R Multiphoton Microscope）进行双光子成像，激发波长为800nm时，所得Hela细胞的荧光图像如图4所示，氮掺杂石墨烯量子点主要分布在细胞质和细胞膜上，表明氮掺杂石墨烯量子点作为双光子荧光探针成功应用于活体生物成像。

实施例6

Hela细胞的双光子细胞成像

本实施例中所使用的氮掺杂石墨烯量子点是按照实施例…的方法所制备的氮掺杂石墨烯量子点。

Hela细胞接种密度为5×10⁵个/皿，所选细胞培养液为HDMEM（购自Hyclone），在37℃、CO₂培养箱孵育12小时后，培养液更换为含有氮掺杂石墨烯量子点的HDMEM培养液（100μg氮掺杂石墨烯量子点/1ml培养基）在同样的条件下再培育12小时后，将细胞置于激光扫描共聚焦双光子显微镜（尼康，A1R Multiphoton Microscope）进行双光子成像，激发波长为800nm时，可以清楚观察到细胞的荧光图像，表明氮掺杂石墨烯量子点作为双光子荧光探针成功应用于活体生物成像。具体图像未给出。

Claims (10)

1.一种氮掺杂石墨烯量子点，其特征在于：

所述氮掺杂石墨烯量子点是包含连接于碳原子的羟基，羧基和烷胺基的石墨烯纳米片层；所述氮掺杂石墨烯量子点的平均直径为1.5～5nm，平均厚度为0.5～1nm，并且所述的氮掺杂石墨烯量子点包含的C、O、N三种元素的摩尔百分比分别为75～85%、24～12%和1～3%；

优选地，所述的烷胺基为-NR₂，且R为-CH₃或-C₂H₅；

优选地，所述的所述氮掺杂石墨烯量子点的平均直径为3nm。

2.根据权利要求1所述的氮掺杂石墨烯量子点，其特征在于，所述的氮掺杂石墨烯量子点包含有C、O、N三种元素，其摩尔百分比分别为81.48%、16.24%和2.28%。

3.根据权利要求1或2所述的氮掺杂石墨烯量子点，其特征在于，所述的氮掺杂石墨烯量子点具有如图2所示的X射线光电子能谱图和/或图3所示的红外吸收光谱。

4.一种制备权利要求1-3中任一项所述的氮掺杂石墨烯量子点的方法，其特征在于：该方法以石墨片为起始原料，以及该方法包括步骤：氧化、超声剥离、溶剂热氮掺杂及纯化。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的氧化步骤包括用浓硫酸、K₂S₂O₈和P₂O₅处理石墨片，反应后产物用水稀释，过滤，洗涤，然后干燥，得到氧化石墨烯。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的超声剥离步骤包括将经洗涤和干燥的氧化石墨烯加入到酰胺类有机溶剂中并超声处理20～50分钟，氧化石墨烯的浓度为1～6mg/mL；

优选地，所述的酰胺类溶剂是N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二乙基甲酰胺；和/或优选地，超声处理30分钟，以及氧化石墨烯的浓度为3.33mg/mL。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的溶剂热氮掺杂是以酰胺类溶剂作为氮源，将石墨片经氧化和超声剥离得到的氧化石墨烯在155～220℃下进行溶剂热处理4-8小时；

优选地，在160～200℃下进行溶剂热处理4-6小时，例如在200oC下进行溶剂热反应4.5小时；

优选地，所述的酰胺类溶剂是N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二乙基甲酰胺。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的纯化步骤包括经微孔滤膜过滤和干燥的步骤；

优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.2～0.45微米；

更优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.22微米。

9.权利要求1-3中任一项所述的氮掺杂石墨烯量子点在活细胞双光子成像中的应用；

优选地，所述的活细胞为Hela细胞。

10.一种活细胞的荧光成像方法，其包括步骤：

1）将活细胞与包含权利要求1-3任一项所述的氮掺杂石墨烯量子点的培养基共同培养2-12小时，且氮掺杂石墨烯量子点的浓度为80-120μg氮掺杂石墨烯量子点/1ml培养基；

2）在双光子显微镜下对培养得到的细胞进行观测；

优选地，在观测中的激发波长为800nm；和/或

优选地，所述的活细胞为Hela细胞；和/或

优选地，氮掺杂石墨烯量子点的浓度为100μg氮掺杂石墨烯量子点/1ml培养基。