CN104107687A - 一种聚合物整体柱及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型移液器吸管大孔聚合物整体柱及其制备方法和应用。一种聚合物整体柱的制备方法，所述整体柱采用原位热引发聚合法制备，并以二醋酸纤维素作为致孔剂，具体包括步骤：（1）移液器吸管内壁的预处理；（2）移液器吸管内聚合物整体柱的制备；（3）整体柱的洗涤；本发明制备的吸管整体柱具有较大的通孔尺寸、较大的柱床体积，能配合移液器操作使用，在移液器的排液压力下即可完成SPE操作；本发明可实现快速、高效率富集待测目标组分的目的。

Description

一种聚合物整体柱及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种聚合物整体柱，更具体地涉及一种新型移液器吸管大孔聚合物整体柱及其制备方法和应用。 
背景技术
当前，高效液相色谱-紫外或质谱检测（HPLC-UV/MS）已成为体内药物分析的主要手段。然而，体内药物组分的快速、准确色谱分析一直面临体液样品（尤其是血样）前处理的这一瓶颈制约。近年来，药理学、临床药理学以及临床药物治疗检测等多个研究领域面临着数量日益庞大的生理体液样品的检测，发展针对体液内目标组分的快速、高效率的富集、净化手段就显得尤为重要。 
固相萃取（SPE）具有操作简单、使用灵活、回收率高、消耗溶剂少、易于自动化等优点，已广泛应用于样品的前处理过程。目前成熟的SPE技术大多采用在表面带有各种功能基团（如C18或C8）的硅胶（或高分子）颗粒填料。一般要将SPE柱装在专门的固相萃取仪上，利用抽真空方式使流动相流过SPE柱。在真空负压作用下，流动相穿过颗粒填料间隙通过SPE柱。流动相中的目标组分主要以扩散传质的方式向填料表面移动，并与其表面的功能基团发生相互作用而被吸附。随着流速的提高，扩散传质效果变差导致分离效率降低。因此，使用颗粒填料的SPE不能采用很高的操作流速以缩短SPE操作时间。另外，SPE填料粒径相对较大，颗粒间留有较大空隙，其较薄的填充厚度容易在填料内引起“管道效应”，使待富集目标组分随流动相快速流出SPE柱而未与固定相填料发生有效相互作用，这就影响到SPE的萃取效率。 
    与颗粒填料相比，聚合物或硅胶整体柱介质具有背压低、通透性好、对流传质速度快、制备容易等一系列优点，在色谱分离领域具有良好的应用前景，未来有望取代颗粒填充色谱柱实现快速、高效分离。基于上述整体柱介质的优点，近年来研究人员对整体柱在SPE领域的应用给予了极大关注。 
整体柱制备简便，尤其是可以按需要在任意形状的容器内制备不同形状的整体柱，以适应多种不同的用途。此外，整体柱内通透性好，流动相中的溶质以对流传质方式为主，溶质被吸附到固定相表面的效率受流速提高的影响较小。因此，整体柱SPE可以采用较高流速，快速处理大量的液体样品，大大缩短样品处理时间，同时其吸附目标物的效率又能保持在令人满意的状态。在较高流速下，流动相能达到整体柱内的所有空隙，因此将目标物洗脱下来时消耗的洗脱液体积较小，便于后续处理程序的操作。在此基础上，整体柱SPE装置可以做到自动化操作，实现对大批量样品溶液的快速前处理。 
与聚合物整体柱介质相比，硅胶整体柱有更多的介孔，因而内部整体表面积要更大。然而硅胶不能耐受高温环境、高pH值流动相，一般环境温度>60℃、流动相 pH>8.5时，硅胶材质本身稳定性下降，会导致其SPE效果降低，而高分子聚合物整体柱材料能耐受更高的环境温度、更宽的pH值范围，可以适应更为苛刻的流动相条件。此外，聚合物整体柱的制备方法要比硅胶材质更为简单、方便，而且带有不同功能基团的聚合物单体种类更多，可以通过简单的原位、一步聚合反应按需制备固相萃取整体柱装置。因此，聚合物整体柱材料的SPE有更多优势，也受到研究人员更多的关注。 
面对数量巨大、而单个样本体积小的人血液样品的SPE前处理，整体柱介质SPE不仅制备方法上有优势，而且相应的淋洗、洗脱等步骤消耗的溶液体积也相对较少。可以根据需要在小体积或微型装置中制备微型整体柱SPE装置，如在移液器吸管、毛细管、芯片通道等整体柱装置，对样品进行SPE前处理以实现对目标组分的高效、快速分离与富集。其中，移液器吸管整体柱可与移液器连接使用，凭借移液器的抽吸、排液压力（或借助其它辅助动力）即可实现对样品中目标物的分离与富集操作，而无需专门的真空固相萃取仪。此外，这种“离线（off-line）”SPE操作方式允许针对不同目标物的特性灵活选择SPE的各步骤操作条件，达到最佳萃取效果。未来也可以采用专门的机械手同时操作多个移液器吸管装置，实现对多个样品的同步固相萃取，可以极大加快样品前处理的速度。因此，对于微量的人血液样品前处理而言，移液器吸管整体柱具有极大优势。 
   现有技术中的聚合物吸管整体柱大多是在10～550μL移液器吸管内制备，而且柱床体积普遍较小，合成整体柱的聚合液体积为0.6～10μL，有的则是利用毛细管作用力将聚合液吸入到吸管尖端部位。较小柱床体积使得整体柱负载量受到限制，适合于液相色谱-质谱检测（HPLC-MS）的样品预处理，而不适用于应用更为普遍、检测器灵敏度相对较低的液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）检测手段。因此，现有的整体柱结构极大的限制了其在检测领域中的应用。 
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中整体柱体积小、通透性差的问题，提供一种聚合物整体柱的制备方法，该方法采用原位热引发聚合法、并采用超大分子量的二醋酸纤维素作为致孔剂来制备整体柱，所制备的整体柱具有柱床体积大、通透性好、背压低、对流传质速度快以及制备容易等优点，极大地拓宽了整体柱的应用范围。 
一种聚合物整体柱的制备方法，所述整体柱采用原位热引发聚合法制备，并以二醋酸纤维素作为致孔剂，按下列步骤进行： 
    S1：移液器吸管内壁的预处理
将移液器吸管经丙酮、甲醇充分润洗，经过硫酸铵水溶液处理，在水浴摇床上反应，经水、甲醇洗涤后在吸管内装入三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）溶液，以二苯甲酮为引发剂，紫外光照射引发聚合反应；停止反应后分别以丙酮、甲醇充分冲洗吸管内壁，得到内壁表面经过预处理的、带有双键的移液器吸管，备用；
    S2：移液器吸管内聚合物整体柱的制备
配制预聚混合单体溶液，加入引发剂和交联剂，并以二醋酸纤维素（CA）溶液作为致孔剂；取上述预聚混合单体溶液加入到步骤S1处理过的吸管中，采用原位热引发聚合法在吸管内合成聚合物整体柱；
    S3：整体柱的洗涤
    分别用丙酮、甲醇充分冲洗步骤S2所得整体柱，洗出未反应的单体、溶剂以及致孔剂，即得吸管整体柱；
其中，步骤S2中的二醋酸纤维素的分子量为10～500万。
本发明采用热引发聚合方式制备聚合物整体柱。在本发明的方法条件下，偶氮类或过氧化类引发剂适合用作引发剂合成整体柱。本发明采用了偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，其它偶氮类引发剂亦适用于本制备方法，如偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯等。此外，过氧化二酰、过氧化苯甲酰、过氧化二月桂酰、过氧化苯甲酰叔丁酯、过氧化甲乙酮等过氧化类引发剂亦适用于本发明的方法。 
优选地，所述二醋酸纤维素的分子量为30～150万；进一步优选地，所述二醋酸纤维素的分子量为30～80万。 
优选地，所述预聚混合单体溶液中总单体的物质的量与二醋酸纤维素溶液体积之间的比值为0.940~3.75mol/L；所述步骤S2中的所述二醋酸纤维素溶液的质量体积浓度为0.0100～0.100g/mL；所述二醋酸纤维素的添加量为0.500～2.00mL。 
进一步优选地，所述二醋酸纤维素溶液的质量体积浓度为0.0250g/mL；所述二醋酸纤维素的添加量为1.30mL。 
优选地，所述二醋酸纤维素溶液的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜或丙酮的一种或几种。 
 本发明采用溶解于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中的二醋酸纤维素为致孔剂体系。在此体系中二醋酸纤维素用于制备大的通孔，DMF用于制备小的介孔。二醋酸纤维素结合酸为53.5～55.5%，重均分子量（MW）为10万～500万左右。除DMF外，其它的二醋酸纤维素良溶剂亦可用于本发明的致孔剂体系，如N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）、二甲基亚砜（DMSO）、丙酮（acetone）等。 
优选地，所述预聚混合单体溶液为弱酸性功能单体、疏水性功能单体、碱性功能单体的一种或几种；进一步优选地，所述预聚混合单体溶液为甲基丙烯酸（MAA）、甲基丙烯酸丁酯（BMA）的一种或两种。 
MAA属于弱酸性功能单体，能提供弱阳离子交换作用。除MAA外，其它带双键的酸性（或弱酸性）功能单体亦适用于整体柱的合成，如带羧基、带磺酸基、硼酸基、羟基等管能基团的单体。更具体地例如：丙烯酸（acrylic acid,AA）、3,3-二甲基丙烯酸（3,3-dimethylacrylic Acid,DMAA）、三氟甲基丙烯酸（trifluoro-methacrylic acid,TFMAA）、亚甲基丁二酸（itaconic acid，ITA）、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸(2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid, AMPS)、4-乙烯基本硼酸（4-vinylbenzeneboronic acid,VBBA）、4-乙烯基苯甲酸（4-vinylbenzoic acid,VBA）、4-乙烯基苯酚（4-vinyl phenol,VPN）、甲基丙烯酸羟乙酯（2-hydroxyethyl methacrylate,HEMA）、甲基丙烯酸羟丙酯（Hydroxypropyl methacrylate,HPMA）等。 
BMA属于疏水性功能单体，其丁酯基团（-OCH2CH2CH2CH3）能提供疏水性相互作用力。除BMA外，其它带双键的具有疏水性羧酸酯类、苯环（或芳香环）类等功能基团的功能单体也适用于整体柱的合成，如甲基丙烯酸甲酯（methyl methacrylate, MMA）、甲基丙烯酸乙酯（ethyl methacrylate,EMA）、甲基丙烯酸己酯（hexyl methacrylate,HMAA）、甲基丙烯酸叔丁酯（tert-Butyl methacrylate，TBMA）、甲基丙烯酸异辛酯（2-ethylhexyl methacrylate,EHMA）、甲基丙烯酸异丁酯（isobutyl methacrylate,IBMA）、甲基丙烯酸己酯（hexyl methacrylate,HMA）、甲基丙烯酸月桂酯(lauryl methacrylate,LMA)、甲基丙烯酸十八烷基酯（stearyl methacrylate,SMA）、甲基丙烯酸异癸酯（isodecyl methacrylate,IDMA）、甲基丙烯酸缩水甘油酯（glycidyl methacrylate,GMA）、甲基丙烯酸苄基酯（benzyl methacrylate,BNMA）、甲基丙烯酸-9-蒽甲酯（9-anthracenylmethyl methacrylate,ANMMA）、甲基丙烯酸环己酯（cyclohexyl methacrylate,CMA）、甲基丙烯酸苯酯（phenyl methacrylate,PMA）、丙烯酸乙酯（ethyl acrylate,EAA）、丙烯酸苯酯（phenyl acrylate,PAA）、丙烯酸苄酯（benzyl acrylate,BNAA）、苯乙烯（styrene,St）等。 
含氨基团（伯、仲、叔、季氨基团）的、或具有氮原子杂环结构的带双键的碱性功能单体亦适合于采用本法制备吸管整体柱。碱性功能单体既可以单独使用，也可以与其它疏水性功能单体联合使用。碱性功能单体举例如下：丙烯酰胺（acrylamide,AAM）、甲基丙烯酰胺（methacrylamide）、甲基丙烯酸二甲氨乙酯（2-(dimethylamino)ethyl methacrylate,DMAEMA）、甲基丙烯酸二乙氨乙酯（2-(diethylamino)ethyl methacrylate,DEMA）、丙烯酸 N,N-二乙基氨基乙酯（2-(diethylamino)ethyl acrylate,DEA）、4-乙烯基苯胺（4-vinyl aniline）、4-乙烯基吡啶（4-vinyl pyridine,4-VP）、2-乙烯基吡啶（2-vinyl pyridine,2-VP）、1-乙烯基咪唑（1-vinylimidazole）等。 
优选地，所述预聚混合单体为甲基丙烯酸与甲基丙烯酸丁酯的混合物；进一步优选地，所述预聚混合单体中甲基丙烯酸与甲基丙烯酸丁酯的摩尔比为1:3～3:1。 
更优选地，所述预聚混合单体溶液为由甲基丙烯酸丁酯（BMA）、甲基丙烯酸（MAA）、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、偶氮二异丁腈（AIBN）、二醋酸纤维素（CA）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）等组成； 
其中，所述预聚混合液组成为：BMA 0～120μL、MAA 0～75μL、EDMA 215～317μL、CA的DMF溶液0.500～2.00mL(溶液的质量体积浓度为0.0200~0.100g/mL)、AIBN为单体总质量的1%～6%。取液体积为95μL，反应在T=60~80℃的烘箱（或水浴）中进行60～100min。
本发明采用溶解于DMF中的二醋酸纤维素为致孔剂体系。在此体系中二醋酸纤维素用于制备大的通孔，DMF用于制备小的介孔。二醋酸纤维素结合酸为53.5-55.5%，重均分子量（MW）为10万～500万左右。除DMF外，其它的二醋酸纤维素良溶剂亦可用于本发明的致孔剂体系，例如：N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）、二甲基亚砜（DMSO）、丙酮（acetone）等。 
在本发明中，步骤S1中对移液器吸管内壁进行预处理，目的是在吸管内壁键合上双键。之后在吸管内进行聚合反应时，合成的整体柱与管壁以共价相联接，使整体柱体牢固地固定于吸管内壁上，确保固相萃取效果。 
优选地，本发明中步骤S1中的TRIM溶液用量为100～160μL，引发剂二苯甲酮的添加量为40～80mg。 
优选地，步骤S1中的TRIM预聚溶液组成：TRIM 100～160μL，BP 40～80mg，混合溶剂1.0～2.0mL。混合溶剂为正十二醇80%和正丁醇20%组成，或适当比例的正十二醇和丙酮组成，或由适当比例的正葵烷和丙酮组成（此时宜采用λ=254nm紫外光，功率不低于60W）。通常可采用λ=365nm（或254nm）紫外光引发聚合，功率不低于40W，反应时间t=20min。聚合反应在带有石英窗口的特制反应器中进行，并且反应过程中反应器内保持低的正压氮气氛围。 
优选地，步骤S2中的引发剂为偶氮二异丁腈，其添加量为预聚混合单体总质量的1%～6%；交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯（质量分数≥98.0%)），其用量为215～317μL。 
优选地，步骤S2中的交联剂选择乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），EDMA的分子上的多个双键参与聚合反应，将高分子链交联起来形成网络状结构，以维持聚合物整体柱结构的刚性。除EDMA外，其它带有多个双键（≥2个）的交联剂亦适用于聚合物整体柱的制备，如二丙烯酸乙二醇酯（ethylene glycol diacrylate,EGDA）、二甲基丙烯酸甘油酯（glycerol dimethacrylate,GDMA）、二丙烯酸二乙二醇酯（di(ethylene glycol) diacrylate，DEGDA）、二甲基丙烯酸二乙二醇酯（di(ethylene glycol) dimethacrylate,DEGDMA）、二丙烯酸1,6-己二醇酯（1,6-hexanediol diacrylate,HDA）、二甲基丙烯酸1,6-己二醇酯（1,6-Hexanediol dimethacrylate,HDMA）、二甲基丙烯酸新戊二醇酯（neopentyl glycol dimethacrylate,NGDMA）、二丙烯酸新戊二醇酯 （neopentyl glycol diacrylate,NGDA）、二甲基丙烯酸四乙二醇酯（tetraethylene glycol dimethacrylate,TGDMA）、二甲基丙烯酸1,3-丁二醇酯（1,3-butanediol dimethacrylate,1,3-BDMA）、二丙烯酸1,3-丁二醇酯（1,3-butanediol diacrylate,1,3-BDA）、二甲基丙烯酸1,4-丁二醇酯（1,4-butanediol dimethacrylate,1,4-BDMA）、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（trimethylolpropane trimethacrylate,TRIM）、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯（trimethylolpropane triacrylate,TRIA）、N,N′-双丙烯酰基-1,2-乙二胺（N,N′-ethylenebis(acrylamide),EBAM）、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（N,N′-Methylenebis(acrylamide),MBAM）、聚乙二醇二丙烯酸酯（poly(ethylene glycol) diacrylate,PEGDA）、季戊四醇三丙烯酸酯（pentaerythritol triacrylate,PETRA）、季戊四醇四丙烯酸酯（pentaerythritol tetraacrylate,PETEA）、二乙烯基苯（divinylbenzene,DVB）、N,N′-1,4-亚苯基二丙烯酰胺（phenylene diacrylamide,PNDAM）、3,5-二（丙烯酰胺）苯甲酸（3,5-bis(acryloylamido)benzoic acid,BAMBA）、N,O-二丙烯酰苯丙氨醇（N,O-bisacryloyl phenylalaninol,BAPNA）等。 
本发明的另一目的在于提供上述聚合物整体柱的制备方法制备的聚合物整体柱在检测血液或尿液中、动物组织匀浆提取液中的目标成分的应用。 
本发明的另一目的在于提供上述二醋酸纤维素作为制备聚合物整体柱的致孔剂的应用。 
优选地，所述二醋酸纤维素的分子量为30～150万。 
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 
（1）本发明采用超大分子量的二醋酸纤维素的N,N-二甲基甲酰胺溶液作为致孔剂，在整体柱内形成大的通孔（达到5～10μm）这个尺寸大于目前文献报道的致孔剂所产生的通孔尺寸。 
（2）本发明由于二醋酸纤维素的使用，确保了移液器吸管整体柱良好的通透性，将其安装到移液器上使用时，仅凭移液器的排液压力即可完成整个固相萃取（SPE）操作步骤，而无需另外的装置、或辅助动力。 
（3）本发明采用原位热引发聚合法制备柱床体积较大的吸管整体柱，采用热引发聚合反应能确保较大体积聚合液反应完全，得到合格的整体柱，本发明合成整体柱所采用预聚混合液体积达到95μL，远大于已有文献报道的吸管整体柱（0.6～10μL）。确保了整体柱足够的富集容量，不仅适合HPLC-MS检测，也满足后续HPLC-UV检测灵敏度的要求；采用原位热引发聚合法反应能确保较大体积聚合液反应完全，得到合格的整体柱。 
采用本发明所述的制备方法制备得到的吸管整体柱具有较大的通孔尺寸、较大的柱床体积，能配合移液器操作使用，在移液器的排液压力下即可完成SPE操作，而无需再借助外在辅助动力或其它专用固相萃取操作装置。本发明可实现高效率富集待测目标组分的目的。 
附图说明
图1为实施例1制备的聚合物吸管整体柱照片； 
图2为实施例1制备的聚合物吸管整体柱照片；
图3为实施例1制备的聚合物整体柱横截面表面形貌扫的描电子显微镜（SEM）表征图；
图4为实施例1制备的聚合物整体柱横截面表面形貌扫的描电子显微镜（SEM）表征图；
图5为由压汞仪测定的整体柱内孔径分布图；
图6为聚合物吸管整体柱对CNX结合容量的测定图；
图7为血清分析方法专属性考察图；
图8 为人血清工作曲线图；
图9为尿样分析方法专属性考察图。
图10为人尿样工作曲线图。 
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，实施例中所涉及的材料、方法均为本领域常用的材料和方法。 
本发明中的试验材料与试剂来源如下： 
    柯诺辛碱（Corynoxine，CNX）由广东药学院中药学院曾常青老师课题组提供），空白人血清由广东药学院门诊部提供，空白人尿由自愿者提供。
甲基丙烯酸( methacrylic acid，MAA，分析纯) 、N,N-二甲基甲酰胺（DMF，分析纯）、偶氮二异丁腈（azodiisobutyronitrile，AIBN，分析纯）、正十二醇（分析纯）、正丁醇（分析纯）购自天津科密欧化学试剂有限公司，二甲基丙烯酸乙二醇酯( ethyleneglycol dimethacrylate，EDMA，质量分数≥98.0%) 购自Acros Organics 公司，甲基丙烯酸丁酯（butyl methacrylate ，BMA，GR）和二苯甲酮（BP，分析纯）购自阿拉丁化学试剂公司（Aladdin Reagent，上海），三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（Trihydroxymethylpropyl trimethylacrylate，TRIM，含量>90.0%）购自东京化学试剂有限公司（Tokyo Chemical Industry Co. Ltd，TCI，日本）。BMA、EDMA、TRIM使用前经中性氧化铝层析柱除去阻聚剂，MAA直接使用，AIBN 经乙醇重结晶提纯。甲醇（色谱纯）购自美国默克公司。磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O，分析纯）、浓H3PO4（分析纯）和过硫酸铵（(NH4)2SO4，分析纯）购自广东光华化学厂有限公司。二醋酸纤维素（MW10～500万左右）购自上海化学试剂厂。1000μL移液器吸管（无色聚丙烯材质）。 
pH7.4磷酸盐缓冲液的配制：称量分析纯0.45649g的K2HPO4·3H2O，加入200 mL水，搅拌溶解，以浓H3PO4调节pH值至7.4。水为超纯水，其它试剂除特别说明外均为分析纯。 
实施例1
本实施例以具有疏水性、弱碱性的中药活性单体柯诺辛为模型药物，来考察所制备的吸管整体柱对甲醇/水溶液中的目标药物组分的SPE富集效果。
1.1 工作液制备 
精密称取柯诺辛碱4.05mg于4mL的EP管中，溶于2mL 60%甲醇/水溶液中，用0.22μm针筒过滤器过滤，即得2.02mg∕mL柯诺辛储备液。由此储备液分别用60%甲醇/水溶液稀释得到不同浓度的工作液，其中24.2μg/mL的工作液用于吸管整体柱SPE条件的考察，其它用于整体柱吸附性能考察。浓度大于2.02mg∕mL的柯诺辛工作液另外单独配制，即：分别精密称取柯诺辛碱3.03mg和4.05mg，各溶于1mL 60%甲醇/水中，0.22μm针筒过滤器过滤，即得3.04mg∕mL和4.05mg/mL柯诺辛工作液。
1.2 吸管整体柱的制备 
S1：移液器吸管内壁的预处理
对移液器吸管内壁进行预处理，目的是在吸管内壁键合上双键。之后在吸管内进行聚合反应时，合成的整体柱与管壁以共价相联接，使整体柱体牢固地固定于吸管内壁上，确保固相萃取效果。
移液器吸管为聚丙烯材质（无色、无添加剂）。将移液器吸管经丙酮、甲醇充分润洗,加入一定量硫酸铵水溶液（20%），在T=75℃水浴摇床上反应40min，在聚丙烯内壁表面引入羟基基团（-OH）。分别经过水、甲醇洗涤后，在吸管内装入一定体积的三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）溶液，以二苯甲酮（BP）为引发剂，紫外光照射引发聚合反应，在吸管内壁形成TRIM聚合物层。TRIM层表面多余的双键可用于参加之后的热引发共聚反应，以共价键将合成的整体柱固定于吸管内壁表面。停止反应后分别以丙酮、甲醇充分冲洗吸管内壁，得到内壁表面经过预处理的、带有双键的移液器吸管，备用。 
TRIM预聚溶液组成：TRIM  140μL，BP 40mg，混合溶剂1.0mL。混合溶剂为正十二醇80%和正丁醇20%组成。聚合反应在带有石英窗口的特制反应器中进行，并且反应过程中反应器内保持低的正压氮气氛围。 
S2：移液器吸管内聚合物整体柱的制备 
以甲基丙烯酸丁酯（BMA）、甲基丙烯酸（MAA）、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、偶氮二异丁腈（AIBN）、二醋酸纤维素（CA）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）组成预聚混合单体溶液。取一定体积的上述预聚混合单体溶液加入到步骤S1处理过的吸管中，采用热引发聚合法在吸管内合成具有疏水性和弱阳离子交换混合作用的聚合物整体柱。
预聚混合单体溶液的组成为：BMA 60μL、MAA 33μL、EDMA 215μL、CA的DMF溶液1.30mL(溶液的质量体积浓度为0.0250g/mL)、AIBN为单体总质量的4%。取液体积为95μL，反应在T=60℃的烘箱（或水浴）中进行80min。 
S3：分别用丙酮、甲醇充分冲洗步骤S2所得整体柱，洗出未反应的单体、溶剂以及致孔剂，即得整体柱； 
    其中，步骤S2中的二醋酸纤维素的分子量为50万。
1.3 大孔吸管整体柱的孔结构表征 
     图1、图2为制备的聚合物吸管整体柱照片；
     从图3、图4中可以看出整体柱内部呈现堆积粒子状态，这些堆积粒子之间的孔隙较大，最大将近10μm左右。
 图5为由压汞仪测定的整体柱内孔径分布图；从图5中可看出孔径主要分布为5.0～10μm左右，其中又以6.5～7.0μm的居多。较大的孔径确保了整体柱内的通透性，使得液体通过整个柱床体积的阻力大大减小。 
综上所述，本发明的制备方法所制备得到的聚合物整体柱具有较大的孔径，通透性强，且整体柱背压减小，当将吸管整体柱安装到移液器上后，仅凭借移液器的排液压力就可完成固相萃取（SPE）操作。因此，就大大简化了SPE操作，专门的SPE装置、或其它外在辅助驱动力将不再成为必需。这样不仅能大幅降低分析成本，而且还能显著提高SPE操作速度，缩短样品的整个分析时间。 
同时，本实施例中整体柱的制备采用了甲基丙烯酸丁酯（BMA）和甲基丙烯酸（MAA）两种功能单体。其中，BMA的丁酯基团能提供疏水相互作用力，MAA的羧基基团能提供弱阳离子交换功能。这两种基团的存在使得整体柱能同时提供疏水和弱阳离子交换两种作用力，可与具有疏水性、弱碱性的药物组分发生较强相互作用，实现对它们的高效率富集。羧基基团（-COOH）的亲水性给予整体柱表面一定亲水能力，能促使生理体液与整体柱表面充分接触，使整体柱表面的功能基团与目标组分分子充分产生相互作用，达到高效富集的目的。 
1.4 色谱检测条件 
色谱柱为菲罗门（Phenomenex）C18 Luna柱（250mm×4.6mm，5um），流速为1.0 mL/min，检测波长为247nm，流动相为甲醇-水（70:30），进样体积为20μL（采用20μL定量环），温度T=28°C。
在上述色谱条件下考察流动相条件对柯诺辛（CNX）色谱峰的影响。以不同比例的甲醇-水为流动相进行测定，随着甲醇含量的下降，出峰时间延长，峰展宽。考虑到CNX在60～70%的甲醇/水溶液中最为稳定，故选择70%的甲醇/水溶液为流动相。此时出峰时间为t=15.2min，主色谱峰与其它异构化杂质峰完全基线分离，不被干扰。 
1.5 吸管整体柱的固相萃取（SPE）操作性能 
1.5.1 吸管整体柱SPE操作条件的确定
吸管整体柱SPE操作程序为：
1）活化：吸管整体柱首先分别用甲醇、水充分润洗活化；2）上样：取柯诺辛工作液一定体积加入到整体柱吸管中，此时将吸管连接到移液器上，手动操作移液器排液，使工作液缓慢流过整体柱床，全部排出吸管；3）淋洗：取下整体柱吸管，加入一定体积水，再次将其连接到移液器上，手动操作移液器排液，使溶液缓慢流过整体柱床，全部排出吸管；4）洗脱：取下整体柱吸管，加入一定体积甲醇，将其连接到移液器上，手动操作移液器排液，使溶液缓慢流过整体柱床，全部排出吸管，将吸附在整体柱上的CNX洗脱下来。
以24.2μg/mL的CNX工作液考察吸管整体柱的吸附性能。分别接收上样流出液、淋洗流出液、洗脱流出液，进HPLC检测，记录其色谱峰面积，并分别与24.2μg/mL的CNX工作液的色谱峰面积进行比较，计算各流出液中CNX含量占总含量的百分比率，以此为考察指标。 
表1为实验测得的各流出液中CNX占总含量的百分比率。从表中可看出以工作液100、或200μL体积上样，在上样流出液中均未发现CNX。200μL体积上样后，采用水200μL连续淋洗2次，流出液中均未发现CNX。采用200μL甲醇连续洗脱3次，其中第一次洗脱流出液里检测到的CNX比率为95.20%，第二次则仅检测到2.12%，第三次则未发现。这说明二次的200μL甲醇洗脱就可以把绝大部分CNX次脱下来，第三次洗脱已经没有CNX存在了（或CNX含量很低，HPLC-UV未检出）。甲醇可以有效洗脱富集在整体柱上的柯诺辛。 
由上述实验结果可确定SPE操作的最佳条件为：上样200μL（CNX的60%甲醇/水溶液），水淋洗200μL×2次，洗脱为甲醇200μL×2次，计400μL。 
表1 各流出液中CNX占总含量的百分比率（%）
注：“-”表示未测定
1.5.2 吸管整体柱最佳SPE操作条件
根据前述实验结果可确定最佳SPE操作条件：1）活化：吸管整体柱分别用甲醇1.0 mL、水2.0 mL充分润洗活化；2）上样：柯诺辛工作液200μL；3）淋洗：水 200μL×2次；4）洗脱：甲醇200μL×2次，洗脱液全部接收于同一EP管中；5）溶样处理：洗脱液室温氮气吹干，残渣再用200μL70%甲醇-水溶解，供HPLC测定。
1.5.3 整体柱最大吸附量的估测 
    连续以不同浓度（c）的CNX工作液200μL上样进行SPE操作，测定最终得到的供试品色谱峰面积（A），作A～c曲线图（见图6）。
从图6中可看出，随着上样浓度的增大，最终洗脱回收得到的CNX峰面积也相应增大，最后上样浓度达到4.05mg/mL时（由于标准品数量有限，实验中仅测定到此浓度），洗脱峰面积也将近平台。以4.05mg/mL浓度对应的洗脱回收峰面积（A 洗）与该浓度工作液的色谱峰面积（A 工）比值估算整体柱最大负载量为： 
其中聚合物整体柱干重为m 干重=14.36mg。 
当上样浓度c=1.77mg/mL时，上样流出液中开始出现微量CNX，其占总含量的百分比率为0.05%。以此浓度估算整体柱的最大吸附量为： 
实施例2：整体柱用于人血清样的检测
本实施例以具有疏水性、弱碱性的中药活性单体柯诺辛（CNX）为模型药物，来考察所制备的吸管整体柱对人血清中的目标药物组分的SPE富集效果。
2.1 人血清样的配制 
2.1.1 CNX工作液的配制
CNX工作液的配制与“项1.1”相同。
2.1.2 人血清标液的配制与前处理 
取200μL 空白人血清，加入20μL不同浓度的柯诺辛工作溶液，配制成所需浓度的含药人血清标准溶液。于此血清样或血清标准溶液中加入600μL的甲醇，涡旋振荡沉淀蛋白，高速（10000转）离心10min，取上清液，加水400μL混匀，供下一步SPE操作。空白人血清处理程序与上述相同，除了不加入柯诺辛溶液。
    本发明制备的聚合物整体柱具有疏水和弱阳离子交换双重作用功能，能与有强疏水性和弱碱性的CNX分子发生强相互作用，实现对CNX的高效富集功能。为防止人血清中的蛋白质等生物大分子被整体柱非特异性吸附，在血清样中加入3倍体积的甲醇液沉淀蛋白，高速离心后取上清液上样。考虑到此时上清液中甲醇含量较高，而甲醇又是CNX的良好洗脱剂，因此离心上清液中再补加400μL水，降低甲醇含量，增强整体柱对CNX的富集作用。此时，上样流出液中未检出CNX，而且随后连续2次200μL水淋洗的流出液中也未检出CNX。这表明，CNX全部被牢固地保留在整体柱上。在后续的低、中、高（13.32、61.94、133.2μg/mL）三个浓度人血清样的日内、日间检测过程中，对各批次血样中的第一个样的SPE操作上样流出液、淋洗液和洗脱液进行检测。上样流出液和淋洗液中均未检出CNX。 
2.2 吸管整体柱的制备 
吸管整体柱的制备与“项1.2”同。
2.3 色谱测定条件 
色谱条件与“项1.4”同。
2.4 吸管整体柱SPE操作条件 
SPE操作条件与“1.5.2”相同。
2.5 分析方法专属性考察 
为考察分析方法的专属性，图7中列出了经过吸管整体柱SPE处理后的CNX工作液（谱图A）、含药血清标准溶液（谱图B）、空白血清（谱图C）的色谱图和未经SPE处理的空白血清色谱图（谱图D）。
    图7中A、B、C、D分别表示： 
A：CNX 工作液 (24.2μg/mL)经过吸管整体柱SPE；B：CNX 人血清标准溶液 (24.2μg/mL) 经过吸管整体柱SPE；C：空白人血清经过吸管整体柱SPE；D：空白人血清未经过吸管整体柱SPE。色谱条件：C18色谱柱，λ=247nm，流动相甲醇/水（70:30），v=1.0 mL/min，T=28℃。
对比谱图C和D可看出，经过蛋白沉淀后残余的血清基质成分几乎全部能通过整体柱的SPE过程除掉，从而得到“清洁”的供试品。因此，含药血清标准溶液色谱图（谱图B）与工作液色谱图（谱图A）也就基本上一致。对比谱图B和A可看出，血清样中的CNX的主峰位置基本与和工作液中的CNX峰一样，也与异构化的杂质基线分离，不被干扰。这说明了吸管整体柱SPE联合HPLC-UV分析方法测定人血清中CNX时有良好的方法专属性。 
2.6  血清工作曲线测定 
    配制浓度范围5.440～152.4 μg/mL的标准血清工作液，测定工作曲线（见图8），一元线性回归方程为A=38.68-10.86c，相关系数r=0.9996。
2.7 分析方法有效性和回收率 
2.7.1 测定方法
    按照项“2.1.2”中的方法配制低、中、高（13.32、61.94、133.2μg/mL）三个浓度人血清控样，并做前处理。按项“2.4”进行SPE操作，最终得到的供试品样进色谱检测。
当日内随机测定低、中、高浓度血样各三批（3个样/批），计算日内精密度和准确度。每日测定低、中、高浓度血样各一批（3个样/批），连续测定三日，计算日间精密度和准确度。 
每个供试品样进色谱检测三次，计算峰面积平均值（），并代入工作曲线方程，求出测定浓度c测。以c测与相应样品理论浓度c理的比值计算方法相对回收率，以每个供试品样色谱峰面积平均值（）与未经固相萃取的相同浓度工作液色谱供试品样峰面积测定值（）之比计算绝对回收率。未经固相萃取的相同浓度工作液的配制与相应人血清样的配制方法相同，仅是采用甲醇代替空白人血清。室温下，将其直接N2吹干，再重新用200μL 70%的甲醇/水溶液溶解，得到未经固相萃取的色谱供试品样。 
2.7.2人血清控样的测定 
表2列出了采用吸管整体柱SPE联合HPLC-UV检测低、中、高(13.3、61.9、133μg/mL)三个浓度人血清控样的测定结果。从测定结果可看出测定精密度符合体内药物分析要求 (RSD％＜15％)，相对回收率>90％，绝对回收率>80％。 
表2  CNX人工血清样测定的日内和日间精密度和回收率 (n=3) 
 实施例3 整体柱用于人尿样的检测
本实施例以具有疏水性、弱碱性的中药活性单体柯诺辛（CNX）为模型药物，来考察所制备的吸管整体柱对人尿样中的目标药物组分的SPE富集效果。
3.1 人尿样的配制 
3.1.1 CNX工作液的配制
CNX工作液的配制与“项1.1”相同。
3.1.2 人尿样标液的配制 
取200μL 空白人尿样，加入20μL不同浓度的柯诺辛工作溶液，配制成所需浓度的含药人尿样标准溶液。
3.1.3 人尿样的前处理 
正常人尿液pH值不固定，含有大量水、无机盐、尿素以及其它极性代谢物等，蛋白质等生物大分子没有或极少。因此尿样在进行SPE处理前，加入pH=7.4的缓冲液以维持溶液呈弱碱性。对24.2μg/mL的CNX工作液的SPE操作实验已证明，在60%的甲醇/水溶液中上样，CNX依然能被完全保留在整体柱上，因此尿样中同时又加入一定量甲醇以减轻其中其它疏水性成分在整体柱表面的吸附。
3.2 吸管整体柱的制备 
吸管整体柱的制备与“实施例1中的1.2”同。
3.3 色谱测定条件 
色谱条件与“实施例1中的1.4”同。
3.4 吸管整体柱SPE操作条件 
SPE操作条件与“实施例1中的1.5.2”相同。
3.5 分析方法专属性考察 
图9中列出了经过吸管整体柱SPE处理后的CNX标准工作液（谱图A）、含药尿样标准溶液（谱图B）、空白尿样（谱图C）的色谱图和未经SPE处理的空白尿样色谱图（谱图D）。
    图9中A、B、C、D分别表示： 
A: CNX 标准工作液 (14.5μg/mL) 经过吸管整体柱SPE处理；B: CNX 标准尿样(14.5μg/mL) 经过吸管整体柱SPE处理；C: 空白尿样经过吸管整体柱SPE处理；D:空白尿样未经过吸管整体柱SPE处理。色谱条件：C18色谱柱，λ=247nm，流动相甲醇/水（70:30），v=1.0 mL/min，T=28℃。
对比谱图C、D和B可看出，尿样中的基质成分大部分能通过整体柱的SPE过程除掉，从而得到相对“清洁”的供试品，而且剩余的基质成分在死时间完全出峰，对CNX的主峰无干扰。对比谱图A和B可看出，CNX的主峰与异构化的杂志基线分离，不被干扰。这说明了吸管整体柱SPE联合HPLC-UV分析方法测定人尿样中CNX时有良好的方法专属性。 
3.6 尿样工作曲线测定 
    配制浓度范围5.21～130.9 μg/mL的人尿样标准溶液，测定工作曲线（见图10）。得到一元线性回归方程为A=43.93c-99.89, 相关系数r=0.9996。
3.7 分析方法有效性和回收率 
3.7.1 测定方法
    按照项“3.1.2”和“3.1.3”中的方法配制低、中、高（（12.5、62.6、115.0μg/mL）三个浓度人尿样、并做前处理。按项“3.4”进行SPE操作，最终得到的供试品样进色谱检测。
当日内随机测定低、中、高浓度血样各三批（3个样/批），计算日内精密度和准确度。每日测定低、中、高浓度血样各一批（3个样/批），连续测定三日，计算日间精密度和准确度。 
每个供试品样进色谱检测三次，计算峰面积平均值（），并代入工作曲线方程，求出测定浓度c测。以c测与相应样品理论浓度c理的比值计算方法相对回收率，以每个供试品样色谱峰面积平均值（）与未经固相萃取的相同浓度工作液色谱供试品样峰面积测定值（）之比计算绝对回收率。未经固相萃取的相同浓度工作液的配制与相应人血清样的配制方法相同，仅是采用甲醇代替空白人血清。室温下，将其直接N2吹干，再重新用200μL 70%的甲醇/水溶液溶解，得到未经固相萃取的色谱供试品样。 
3.7.2 人尿样的测定 
对低、中、高（12.5、62.6、115μg/mL）三个浓度人尿液控样采用吸管整体柱SPE联合HPLC-UV法进行测定。表3列出了测定结果。从测定结果可看出测定精密度较好，日内、日间测定的 RSD%为1.3～6.3%，日内、日间测定相对回收率为86～110%，绝对回收率为95.2～101%。
表3  CNX人工血清样测定的日内和日间精密度和回收率 (n=3) 
 本发明中，我们采用原位热引发聚合法在1000μL移液器吸管中制备了具有较大尺寸通孔（5～10μm）和较大体积的聚合物整体柱（95μL聚合液）。整体柱的制备采用了溶于N,N-二甲基甲酰胺的超大分子量二醋酸纤维素（MW30~80万）为致孔剂，在整体柱内形成大的通孔。这些大尺寸通孔大幅度降低了整体柱的背压，使得吸管整体柱安装到移液器上后，可以仅凭借移液器的排液压力即可完成固相萃取操作，而无需再借助外在辅助动力，从而实现对生理体液样品便捷、高效的前处理。较大体积的聚合物整体柱还可确保足够的富集量，以满足后续HPLC-UV检测的灵敏度要求。
在具体的整体柱制作方面，本发明采用甲基丙烯酸丁酯和甲基丙烯酸两种功能单体来制备聚合物吸管整体柱。采用此两种单体制备的整体柱可以提供疏水性、弱阳离子交换两种作用力，能有效地同生理体液中的疏水性、弱碱性药物组分发生相互作用，达到高效率富集目标分子的目的。 
本发明通过实验验证了吸管整体柱对人生理体液（血清、尿液）中柯诺辛的固相萃取效果。实验结果表明，该吸管整体柱能高效率富集添加于体液内的柯诺辛碱，而且整体柱的富集能力完全满足后续HPLC-UV分析的要求。此外，吸管整体柱还能有效清除体液内的基质组分，为后续色谱分析提供“清洁”样品。 
    采用本发明的制备方法制备的吸管整体柱未来有望应用于对众多体液样品的快速、便捷固相萃取前处理，为HPLC-UV分析提供“清洁”的供试品，实现对体液样品的快速、准确分析。 
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但是本发明并不限制于为实现本发明所公开的具体实施方式，其他的任何未背离本发明的精神实质和原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方法，都包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (10)

1.一种聚合物整体柱的制备方法，其特征在于，所述整体柱采用原位热引发聚合法制备，并以二醋酸纤维素作为致孔剂，具体操作按下列步骤进行：
S1：移液器吸管内壁的预处理
将移液器吸管经丙酮、甲醇充分润洗，经过硫酸铵水溶液处理，在水浴摇床上反应，经水、甲醇洗涤后在吸管内装入三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯溶液，以二苯甲酮为引发剂，紫外光照射引发聚合反应；停止反应后分别以丙酮、甲醇充分冲洗吸管内壁，得到内壁表面经过预处理的、带有双键的移液器吸管，备用；
S2：移液器吸管内聚合物整体柱的制备
配制预聚混合单体溶液，加入引发剂和交联剂，并以二醋酸纤维素溶液作为致孔剂；取上述预聚混合单体溶液加入到步骤S1处理过的吸管中，采用原位热引发聚合法在吸管内合成聚合物整体柱；
S3：整体柱的洗涤
    分别用丙酮、甲醇充分冲洗步骤S2所得整体柱，洗出未反应的单体、溶剂以及致孔剂，即得吸管整体柱；
其中，步骤S2中的二醋酸纤维素的分子量为10～500万。
2.根据权利要求1所述的聚合物整体柱的制备方法，其特征在于，所述二醋酸纤维素分子量为30～150万。
3.根据权利要求2所述的聚合物整体柱的制备方法，其特征在于，所述二醋酸纤维素分子量为30～80万。
4.根据权利要求1所述的聚合物整体柱的制备方法，其特征在于，所述预聚混合单体溶液中总单体的物质的量与二醋酸纤维素溶液体积之间的比值为0.940~3.75mol/L；所述二醋酸纤维素溶液的质量体积浓度为0.0100～0.100g/mL。
5.根据权利要求4所述的聚合物整体柱的制备方法，其特征在于，所述二醋酸纤维素溶液的质量体积浓度为0.0250g/mL。
6.根据权利要求1所述的聚合物整体柱的制备方法，其特征在于，所述二醋酸纤维素溶液的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜或丙酮的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的聚合物整体柱的制备方法，其特征在于，所述预聚混合单体溶液为弱酸性功能单体、疏水性功能单体、碱性功能单体的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的聚合物整体柱的制备方法，其特征在于，所述预聚混合单体溶液为甲基丙烯酸、甲基丙烯酸丁酯的一种或两种。
9.权利要求1至8任一权利要求所述的聚合物整体柱的制备方法制备的聚合物整体柱在检测血液、或尿液、或动物组织匀浆提取液中的目标成分的应用。
10.二醋酸纤维素作为制备聚合物整体柱的致孔剂的应用。
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