CN104093303B - 凤果花叶病毒抗性番茄植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及番茄植物(番茄(Solanum lycopersicum L.))，其包含赋予对凤果花叶病毒(PepMV)的抗性的遗传决定因子，其中抗性特征在于存在至少QTL1，其位于在物理位置32,363,349bp和34,505,939bp之间，优选位置33,558,627bp和34,505,939bp之间的连锁群(LG)6，或其PepMV‑抗性‑赋予部分，和/或QTL2，其位于在物理位置60,667,821bp和62,460,220bp之间，优选位置61,387,356bp和62,253,846bp之间的连锁群(LG)7，或其PepMV‑抗性‑赋予部分，和/或QTL3，其位于在物理位置60,998,420bp和62,512,587bp之间，优选位置61,494,664bp和62,385,023bp之间，更优选位置61,723,339bp和62,385,023bp之间的连锁群(LG)9，或其PepMV‑抗性‑赋予部分。本发明也涉及获得所述遗传决定因子的源，其代表性的种子以登录号No.NCIMB41927，NCIMB41928，NCIMB42068和NCIMB42069保藏在NCIMB。本发明还涉及种子和植物后代及其果实及加工的果实。此外，本发明涉及与PepMV抗性赋予QTL连锁的分子标志物和其用途。

Description

凤果花叶病毒抗性番茄植物
本发明涉及番茄植物(番茄(Solanum lycopersicum L.))，其包含赋予对凤果花叶病毒(Pepino Mosaic Virus,PepMV)的抗性的遗传决定因子。本发明还涉及标志物和标志物用于鉴定导致PepMV抗性的遗传决定因子的存在的用途。本发明也涉及该植物的种子和后代及用于获得该植物的繁殖材料。此外本发明涉及包含遗传决定因子的植物，种子和繁殖材料在育种程序中作为种质的用途。
商业植物生产，包括番茄生产，被许多条件影响。栽培者对特定变种的选择是决定因素，并形成可达到的结果的遗传基础。此外，有许多影响结果的外部因素。生长条件如气候，土壤，及输入如肥料的使用起到主要作用。除此之外，害虫和疾病的存在也影响可达到的总产率。
已在很早以前，在番茄栽培的早些年认识到番茄中的许多疾病。育种者已同时鉴定了来自各种来源的多数这些疾病的抗性，并在它们的产品中合并了它们。这些的例是对烟草花叶病毒(TMV)(可感染广范围的植物和其他作物)；Fusarium oxysporumf.sp.lycopersicum，及黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)或"番茄叶霉菌"的抗性。现今针对那些疾病的抗性多少是全部商业番茄变种中的标准。无论何时新株或相关的疾病出现，对新源的抗性的搜索从头开始。疾病及存在的对可能相关的形式的抗性的知识辅助相对快速测定新抗性源。但是，对于一些疾病且尤其对于害虫，其是非常难或直到现在还不可能开发具有高水平的抗性的物质。尤其在抗性机理非常复杂并依赖于几种彼此相互作用的基因时，开发良好水平的抗性的挑战可为真正地高。
此外，有时完全新疾病呈现出不与任何已知道的疾病相关。对于这些，仍无指示什么最可能是可发展抗性的种质。也不知道抗性机理，这也使新抗性的发展更复杂。作为另外的复杂因素，需要良好生物-测定以比较抗性植物与敏感的材料。当对新病原体知道很少时，首先要确定其可感染番茄植物的方式。不与栽培者田地条件关联的生物-测定可导致矛盾的或不令人满意的结果。在测试期间太弱或太强接种不会对为在实践中开发抗性番茄植物的工作产生有用的物质。最后，最后测试是是否抗性在栽培者的条件下保持。
在1999年，在欧洲，尤其在温室商业番茄生产中出现新病毒。此病毒可通过整个田地极其快速扩散，及相邻栽培者容易受影响。病毒不久被鉴定为凤果花叶病毒，属于Potex组，其特征在于高度感染性和持续性。
凤果花叶病毒(PepMV)在1974年首次在人参果或梨瓜(Solanum muricatum)，南-美作物，在来源于秘鲁的植物上鉴定。其在当时被确定为可感染番茄，及相关的野生物种，但不显示症状。
尚未确定病毒如何可突然在欧洲番茄生产中出现，并随后也出现在例如加拿大及美国。几种不同PepMV基因型被鉴定及区分，其中有：LP，来自秘鲁的原种；EU，来自欧洲温室；来自智利的CH1和CH2；及US1和US2。
相比从人参果作物获取的分离物，存在于商业番茄作物的PepMV分离物在番茄中具有更强毒力，提示病毒已遗传上适应了。通过在番茄作物中完成的且正在起作用的通常活性，PepMV非常容易机械地扩散。因此，通常可随后见到成行的感染的植物。工具，衣服，等停留也能传播病毒几周，及PepMV可停留在干植物材料上久至3个月。一旦其感染了番茄生产，就非常难以摆脱病毒。
PepMV症状是各种各样的，且大大地依赖于感染期间的植物阶段，植物变种，植物活力和生长条件。有时症状难以可见，但主要症状表现包括具有'荨麻头'-浅灰色的，尖的植物顶部-，矮小的头，黄萎病叶或叶斑，及不均匀成熟，形成大理石样斑纹及形成果实斑点的植物。症状在秋季和冬季期间，在低光条件和更低温度下最明显。
由于PepMV的番茄生产损失也可依赖于环境显著地改变。在重度感染的作物中，损失很可能达到至多20％。其他病原体，例如轮枝孢属物种(Verticilium spp.)的存在也可强烈影响产率减小。
由于PepMV非常容易扩散，已在许多国家及由许多栽培者实施严格的卫生学流程。自从推定PepMV也可通过感染的种子传播，用于种子生产和种子清洁的卫生学流程也是非常严格的。
在欧洲，当其被进口或交易时番茄种子需无PepMV。EU成员被要求进行测量，以确定番茄种子上不存在病毒。
自从发现在病毒感染了商业生长之后非常难根除，现今许多栽培者依赖于'杂交-保护'：用弱PepMV分离物接种作物，以预防由攻击性的分离物导致的严重的症状。但是，此系统带来几个风险。特定弱与特定攻击性的分离物的组合，尤其当它们来源手不同基因型时，可增强而非减少症状(Hanssen等人,Plant Pathology59,13～21(2010))。由于无法预知在特定区或特定季节将出现哪种攻击性的分离物，可能有害组合不可预防。此外，甚至不是总是清楚哪种弱分离物被使用，因为鉴定较难。
组合病毒基因型的另一风险是株之间遗传重组的可能性，其可导致新的和潜在地甚至更毁坏性的病毒分离物(Hanssen等人,European Journal of Plant Pathology121,131-146(2008)；Hasiów-Jaroszewska et al.,Acta Biochimica Polonica57,385-388(2010))。
尽管在番茄中对PepMV的抗性源的找寻自始一直很密集，直到现在无可利用的抗性番茄(Solanum lycopersicum)植物。抗性的遗传改造，及用于筛选的生物-测定，如此复杂，尚不知道对具有PepMV抗性的栽培的番茄材料的报道或提示。耐久抗性仅见于赭黄茄(Solanum ochranthum)，其无法与栽培的番茄杂交。
【发明内容】
本发明旨在提供番茄植物(番茄(Solanum lycopersicum L.))，其携带导致对凤果花叶病毒的抗性的遗传决定因子。
本发明旨在提供贡献于番茄植物(番茄(Solanum lycopersicum))中凤果花叶病毒抗性的QTL。
本发明的另一目的是提供可鉴定导致PepMV抗性的遗传决定因子的标志物。
本发明由此提供番茄植物(番茄(Solanum lycopersicum))，其包含赋予对凤果花叶病毒(PepMV)的抗性的遗传决定因子，其中抗性特征在于至少存在：
●QTL1或其PepMV-抗性-赋予部分，其位于在物理位置32,363,349bp和34,505,939bp之间，优选位置33,558,627bp和34,505,939bp之间的连锁群(LG)6上，和/或
●QTL2或其PepMV-抗性-赋予部分，其位于在物理位置60,667,821bp和62,460,220bp之间，优选位置61,387,356bp和62,253,846bp之间的LG7上，和/或
●QTL3或其PepMV-抗性-赋予部分，其位于在物理位置60,998,420bp和62,512,587bp之间，优选位置61,494,664bp和62,385,023bp之间，更优选位置61,723,339bp和62,385,023bp之间的LG9上。
由多于一种QTL组成的复杂抗性机理的鉴定是艰难及复杂的过程。尚不知道关于对此抗性的遗传背景的指示。此外，也无从公共渠道可利用的可靠的用于番茄(S.lycopersicum)的PepMV筛选方法。本发明的开发中另外的复杂因素因此是设计良好和可靠的用于番茄(S.lycopersicum)的生物-测定(其会产生与栽培者的条件良好相关的结果)的挑战。
导致本发明的研究此外还显示，本发明的导致PepMV抗性的遗传决定因子包含多于一种QTL及那些QTL位于番茄(Solanum lycopersicum)基因组的分离的染色体上。此是对于创建抗性植物而言另外的复杂因素。
在一实施方式中PepMV抗性特征在于至少存在：
●QTL1或其PepMV-抗性-赋予部分及QTL2或其PepMV-抗性-赋予部分，或者
●QTL1或其PepMV-抗性-赋予部分及QTL3或其PepMV-抗性-赋予部分，或者
●QTL2或其PepMV-抗性-赋予-部分及QTL3或其PepMV-抗性-赋予部分。
在一实施方式中，抗性特征在于存在QTL1或其PepMV-抗性-赋予部分，及QTL2或其PepMV-抗性-赋予部分，及QTL3或其PepMV-抗性-赋予部分。
2种或更多抗性-赋予QTL的组合导致对凤果花叶病毒的更高水平的抗性。
在一实施方式中，本发明涉及番茄(Solanum lycopersicum)植物，其携带包含QTL1，QTL2和QTL3中的一种或更多的遗传决定因子，该遗传决定因子赋予对凤果花叶病毒的抗性，且该QTL如包含在番茄植物中，其代表性的种子以下列保藏号保藏在NCIMB：NCIMB41927，NCIMB41928，NCIMB42068和NCIMB42069。
在一实施方式中，所述决定因子由从在NCIMB以登录号No.NCIMB41927保藏的种子生长的植物，和/或由从在NCIMB以登录号No.NCIMB41928保藏的种子生长的植物，和/或由从在NCIMB以登录号No.NCIMB42068保藏的种子生长的植物，和/或由从在NCIMB以登录号No.NCIMB42069保藏的种子生长的植物渐渗杂交。
在本发明的特定方面，渐渗杂交进番茄(Solanum lycopersicum)植物的QTL1，2和3中的一种或更多组成了其抗性赋予部分。
本文所用的"渐渗杂交"旨在表示利用杂交及在性状变得可见的第1代选择来将遗传决定因子导入不携带遗传决定因子的植物。对于显性性状，选择可起始于具有性状的植物和无性状的植物之间的杂交的F1。对于隐性性状，此适宜于F2。替代性地及对于多基因性状，优选地，在与QTL连锁的分子标志物的辅助下进行选择。标志物辅助的选择可在包含携带任意数的期望的QTL的植物的任何代或群中进行。
保藏号NCIMB41927或其后代种子，或保藏号NCIMB42068或其后代种子，可适宜地用作将QTL1(其位于LG6上)，和/或QTL2(其位于LG7上)渐渗杂交至番茄(Solanumlycopersicum)植物的源。在NCIMB41927和NCIMB42068中，QTL1连锁于SEQ ID NO:1，及SEQID NO:4，及SEQ ID NO:5；QTL2连锁于SEQ ID NO:2，及SEQ ID NO:6，及SEQ ID NO:7。保藏号NCIMB41928或其后代种子可用作渐渗杂交QTL2(其位于LG7上)，和/或QTL3(其位于LG9上)的源。在NCIMB41928中，QTL2连锁于SEQ ID NO:2，及SEQ ID NO:6，及SEQ ID NO:7；QTL3连锁于SEQ ID NO:3，及SEQ ID NO:8，及SEQ ID NO:9。
保藏号NCIMB42069或其后代种子可用作渐渗杂交QTL1(其位于LG6上)和/或QTL2(其位于LG7上)和/或QTL3(其位于LG9上)的源。在NCIMB42069中，QTL1连锁于SEQ ID NO:1，及SEQ ID NO:4，及SEQ ID NO:5；QTL2连锁于SEQ ID NO:2，及SEQ ID NO:6，及SEQ ID NO:7；QTL3连锁于SEQ ID NO:3，及SEQ ID NO:8，及SEQ ID NO:9。
SEQ ID编号定义于表2。
在一实施方式中，在番茄中赋予对凤果花叶病毒的抗性的一种或更多本发明的QTL以纯合形式存在。关于本发明的性状，携带抗性性状的植物可如下在从不携带性状的植物和携带所述的性状的植物之间的杂交后代之中适宜地鉴定：从作为初始杂交的结果的种子和自交步骤生长F2植物，及选择显示期望的性状的植物。选择植物可通过生物-测定在表型上进行，或可通过鉴定一种或更多贡献于性状的本发明的QTL或其抗性-赋予部分，由标志物辅助的选择进行。
1种或2种或全部3种本发明的QTL以隐性方式赋予抗性。对应表型性状(对PepMV的抗性)，因而也以隐性方式遗传。当全部3种QTL以隐性方式赋予抗性时，需生长大群的F2植物，以选择具有表型性状，和/或携带全部3种本发明的QTL的植物。或者，可起始选择更低水平的抗性和/或1种或2种本发明的QTL。赋予抗性的分离的遗传决定因子也可以中间方式，或以显性方式遗传。当涉及中间或显性遗传时，对表型性状的选择更容易。可出现用以获得最高水平的抗性的隐性和/或中间和/或显性QTL的组合。
选择可就表型，或就所述本发明的抗性-赋予QTL的存在进行。选择也可通过使用一种或更多分子标志物进行。分子标志物的使用需要更小筛选用群，及可在非常早期阶段进行。
在一实施方式中，本发明的番茄植物包含：
●QTL1或其抗性赋予部分，其在保藏NCIMB41927和/或NCIMB42068和/或NCIMB42069中连锁到由下列表征的分子标志物：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5(表2)，和/或
●QTL2或其抗性赋予部分，其在保藏NCIMB41927和/或NCIMB41928和/或NCIMB42068和/或NCIMB42069中连锁到由下列表征的分子标志物：SEQ ID NO:2，SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:7(表2)，和/或
●QTL3或其抗性赋予部分，其在保藏NCIMB41928和/或NCIMB42069中连锁到由下列表征的分子标志物：SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9(表2)。
在一实施方式中，本发明的番茄植物包含QTL1，其优选关联于由下列表征的分子标志物：SEQ ID NO:1，和/或SEQ ID NO:4，和/或SEQ ID NO:5；及QTL2，其优选关联于由下列表征的分子标志物：SEQ ID NO:2，和/或SEQ ID NO:6，和/或SEQ ID NO:7；及QTL3，其优选关联于由下列表征的分子标志物：SEQ ID NO:3，和/或SEQ ID NO:8，和/或SEQ ID NO:9。本发明的该植物的代表性的种子保藏为NCIMB42069。
根据本发明发现，QTL1位于番茄基因组的第6染色体的物理位置32,363,349bp和34,505,939bp之间，且可由分子SNP标志物的存在鉴定。此SNP标志物位于番茄(Solanumlycopersicum)基因组版本SL2.40的公共物理图谱的34,456,931bp，及特征在于SEQ IDNO:1(表2)。其他分子SNP标志物，其可用于给QTL1区分界，特征在于在33,558,627bp的SEQID NO:4和在34,505,939bp的SEQ ID NO:5(表2)。在保藏NCIMB41927和NCIMB42068和NCIMB42069的植物中，这些SNP标志物指示及连锁到QTL1，因此也指示那些保藏的植物中对PepMV的抗性。
贡献于PepMV抗性的第2QTL(QTL2)，定位于第7染色体物理位置60,667,821bp和62,460,220bp之间。QTL2可由位于番茄(Solanum lycopersicum)基因组版本SL2.40的公共图谱上物理位置61,550,890bp的SNP标志物的存在鉴定，及特征在于SEQ ID NO:2(表2)。其他分子SNP标志物，其可用于给QTL2区分界，特征在于在61,387,356bp的SEQ ID NO:6和在62,253,846bp的SEQ ID NO:7(表2)。在保藏NCIMB41927和NCIMB41928和NCIMB42068和NCIMB42069的植物中，这些SNP标志物指示及连锁到QTL2，因此也指示那些保藏的植物中对PepMV的抗性。
导致PepMV抗性的第3QTL(QTL3)，位于第9染色体物理位置60,998,420bp和62,512,587bp之间。此QTL的存在可由位于番茄(Solanum lycopersicum)基因组版本SL2.40的公共物理图谱上的61,603,006bp的SNP标志物检测，该SNP标志物特征在于SEQ ID NO:3(表2)。其他分子SNP标志物，其可用于鉴定QTL3区，特征在于在61,872,648bp的SEQ ID NO:8和在62,191,735bp的SEQ ID NO:9(表2)。在保藏NCIMB41928和NCIMB42069的植物中，这些SNP标志物指示及连锁到QTL3，因此也指示那些保藏的植物中对PepMV的抗性。
在一实施方式中，包含赋予对凤果花叶病毒(PepMV)的抗性的遗传决定因子的番茄植物，可通过鉴定QTL1或其PepMV-抗性-赋予部分，和/或QTL2或其PepMV-抗性-赋予部分，和/或QTL3或其PepMV-抗性-赋予部分的存在获得，其中QTL1～3定义为：
●QTL1，其位于在物理位置32,363,349bp和34,505,939bp之间，优选位置33,558,627bp和34,505,939bp之间的连锁群(LG)6上；
●QTL2，其位于物理位置60,667,821bp和62,460,220bp之间，优选位置61,387,356bp和62,253,846bp之间的LG7上；
●QTL3，其位于物理位置60,998,420bp和62,512,587bp之间，优选位置61,494,664bp和62,385,023bp之间，更优选位置61,723,339bp和62,385,023bp之间的LG9上。
在一实施方式中，本发明涉及番茄植物，其可由包括下列步骤的方法获得：
(a)使包含QTL1和QTL2的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB41927或NCIMB42068)，或包含QTL2和QTL3的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB41928)与不包含这些遗传决定因子的植物杂交，以获得F1群；
(b)任选地实施一轮或更多轮的自交和/或使来自F1的植物杂交，以获得再一代群；
(c)自群选择包含QTL1和/或QTL2的植物，或包含QTL2和/或QTL3的植物；
(d)使包含QTL1和/或QTL2的选择的植物与包含QTL2和QTL3的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB41928)杂交，或使包含QTL2和/或QTL3的选择的植物与包含QTL1和QTL2的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB41927或NCIMB42068)杂交；
(e)使步骤(d)中获得的植物自交，以获得分离的群；
(f)选择包含QTL1和QTL2，或QTL2和QTL3，或QTL1和QTL3，或QTL1和QTL2和QTL3的植物。
QTL1和/或QTL2可首先渐渗杂交，或QTL2和/或QTL3首先渐渗杂交至缺少任一种QTL的番茄(Solanum lycopersicum)植物，之后导入QTL2和/或QTL3，或QTL1和/或QTL2。随后就凤果花叶病毒抗性中涉及的1种或2种或3种所述的QTL进行选择。
在进一步实施方式中，本发明涉及携带导致针对凤果花叶病毒的抗性的遗传决定因子的番茄植物，其可由包括下列步骤的方法获得：
(a)使包含QTL1和QTL2的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB41927或NCIMB42068)，或包含QTL2和QTL3的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB41928)，或包含QTL1和QTL2和QTL3的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB42069)与不包含这些遗传决定因子的植物杂交，以获得F1群；
(b)实施一轮或更多轮的自交和/或使来自F1的植物杂交，以获得再一代群；
(c)任选地自包含QTL1，2和3中的1种或2种的群选择植物，之后与包含至少QTL1，2和3中的另一种QTL的植物杂交，并随后重复步骤(b)；
(d)选择包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
在进一步实施方式中，本发明的番茄植物可通过使包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的第1亲本植物与包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的第2亲本植物杂交及在随后代中选择任选地在进一步自交和/或杂交步骤之后包含QTL1和QTL2，或QTL1和QTL3，或QTL2和QTL3，或QTL1和QTL2和QTL3的植物而获得。
在进一步实施方式中，使从保藏为NCIMB41927的种子生长的植物或从保藏为NCIMB42068的种子生长的植物与从保藏为NCIMB41928的种子生长的植物杂交，使得到的F1自交，并随后实施就包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的植物的选择。在优选的方面，就优选纯合地包含全部3种QTL的植物进行选择，该植物对凤果花叶病毒是高度抗性或免疫的。
在优选的实施方式中，本发明涉及番茄植物，其可由包括下列步骤的方法获得：
(a)使包含QTL1和QTL2和QTL3的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB42069)与不包含所述的QTL的植物杂交，以获得F1群；
(b)实施一轮或更多轮的自交和/或使来自F1的植物杂交，以获得再一代群；
(c)任选地自包含QTL1，2和3中的1种或2种的群选择植物，之后与包含QTL1，2和3中的至少另一种QTL的植物杂交，并随后重复步骤(b)；
(d)选择包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
获得包括任意数的QTL1，2和/或3，优选QTL1和QTL2和QTL3，更优选纯合地全部QTL1和QTL2和QTL3的本发明的番茄(Solanum lycopersicum)植物的方法，可以本领域技术人员已知的各种方式实施。用于获得所述植物的源适宜地是包含QTL1或QTL2或QTL3的植物，包含QTL1和QTL2或QTL2和QTL3或QTL1和QTL3的植物，或包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。包含QTL1和QTL2的适合的源的代表性的种子以保藏号NCIMB41927或NCIMB42068保藏在NCIMB，及包含QTL2和QTL3的适合的源的代表性的种子保藏为NCIMB41928。
包含QTL1和QTL2和QTL3的适合的源的代表性的种子以保藏号NCIMB42069保藏在NCIMB。
需知，提供本发明的一种或更多遗传决定因子的亲本未必是从保藏的种子直接生长的植物。亲本也可为自该种子的后代植物，或由其他手段自鉴定为具有包含1种或2种或3种本发明的QTL的遗传决定因子的种子的后代植物。
对凤果花叶病毒的抗性是通过天然的感染或人工感染(诸如接种)的由凤果花叶病毒感染的导致的症状的减小或缺失。症状的减小或缺失是相比不携带本发明的遗传决定因子或一种或更多QTL的番茄(Solanum lycopersicum)植物减小或缺失，如根据例如实施例2测试的。
在本发明的优选的方面，QTL1的纯合存在和QTL2的纯合存在和QTL3的纯合存在导致最高水平的抗性或免疫。最高水平的抗性或免疫以隐性方式遗传。
本发明的抗性优选是免疫。免疫被定义为在接种或感染之后病毒粒子不，或不显著地，在植物中蓄积的抗性系统。免疫可通过对病毒粒子的ELISA测定测量，该测定为本领域技术人员所熟知。免疫在ELISA测定中给出低或负分值。低或负分值指示与非-病毒-感染的植物相当的病毒滴度。免疫由至少QTL1和QTL2和QTL3以纯合形式存在适宜地赋予。
此外本发明涉及要求保护的番茄植物的细胞。该细胞可为分离的形式或可为完全番茄植物或其部分的部分，仍构成本发明的细胞，因为该细胞在其遗传构成中携带导致定义本发明的番茄植物的抗性特征的遗传信息。本发明的番茄植物的各细胞携带导致所述性状的表型表达的遗传信息。本发明的该细胞也可为可用于再生本发明的新番茄植物的可再生的细胞。
本发明也涉及要求保护的植物的组织。组织包含在它们的遗传构成中携带导致定义本发明的番茄植物的抗性特征的遗传信息的细胞。组织可为未分化的组织或已分化的组织。未分化的组织是例如茎端，花药，花瓣，花粉和可用于微繁殖以获得生长为本发明的新植物的新小植株。组织也可生长自本发明的细胞。
本发明根据其再一方面涉及要求保护的植物的种子。尽管种子不显示本发明的番茄植物的遗传性状，它们包含导致当植物自种子生长时，使此植物为本发明的植物的抗性特征的遗传信息。
本发明也涉及本发明的植物后代，细胞，组织和种子。该后代可本身是植物，细胞，组织或种子。
如本文所用词汇"后代"旨在表示来自与包含导致PepMV抗性的遗传决定因子的本发明的植物杂交的第1个和全部进一步后代。本发明的后代是任何与携带导致PepMV抗性的性状的本发明的植物杂交的后代。在一实施方式中，本发明的后代植物携带构成导致对凤果花叶病毒(PepMV)的抗性的本发明的遗传决定因子的QTL1，QTL2和QTL3中的一种或更多。优选地，后代包含QTL1，QTL2和QTL3的2种或更多，更优选本文定义的QTL1，QTL2和QTL3的全部3种。
后代植物优选显示至少一些水平的对凤果花叶病毒的抗性，尤其是高水平的抗性和更尤其是针对凤果花叶病毒的免疫。
"后代"也包括携带导致本发明的PepMV抗性性状的遗传决定因子且从其他植物或本发明的植物的后代由植物性繁殖或增殖得到的植物。
本发明由此还涉及要求保护的植物的种子及适宜于有性繁殖的植物部分。该部分例如选择自：小孢子，花粉，子房，胚珠，胚囊和卵细胞。此外，本发明涉及适宜于营养繁殖的植物部分，尤其是插枝，根，茎，细胞和原生质体。
根据其再一方面，本发明提供要求保护的植物的组织培养物。组织培养物包含可再生的细胞。该组织培养物可源于叶，花粉，胚胎，子叶，下胚轴，分生组织细胞，根，根端，花药，花，种子和茎。组织培养物可再生为携带本发明的遗传决定因子的植物。适宜地，再生的植物表达凤果花叶病毒抗性的表型。
本发明此外涉及杂交体种子及涉及产生杂交体种子的方法，所述方法包括使第1亲本植物与第2亲本植物杂交，及收获得到的杂交体种子，其中所述第1亲本植物和/或所述第2亲本植物是要求保护的植物。
本发明也涉及携带本发明的PepMV抗性性状的近交及加倍的单倍体。
在一实施方式中，本发明涉及本发明的番茄植物，其由常规繁殖，或遗传修饰，尤其是由顺式发生或反式发生携带导致PepMV抗性的本发明的遗传决定因子，及通过自适合的源导入负责性状的遗传信息而获取了所述决定因子。顺式发生是植物用来自作物植物本身或来自性相容的供体植物的编码(农业)性状的天然的基因来进行遗传修饰。反式发生是植物用来自非-可杂交的物种的基因或合成基因的遗传修饰。
在一实施方式中，获取本发明的遗传决定因子的来源由自下列生长的植物形成：种子，其中代表性的样品以登录号No.NCIMB41927保藏，或以登录号No.NCIMB41928保藏，或以登录号No.42068保藏，或以登录号No.NCIMB42069保藏，或保藏的种子，或其有性后代或营养性后代，或包含遗传决定因子的另一源，或这些源的组合。
在优选的实施方式中，本发明涉及非-转基因番茄(Solanum lycopersicum)植物。为获得抵抗凤果花叶病毒的本发明的植物，用于获取本发明的一种或更多QTL1，QTL2或QTL3的源适宜地是携带QTL1和/或2和/或3(如包含在NCIMB41927和/或NCIMB41928和/或NCIMB42068和/或NCIMB42069中的)的番茄(Solanum lycopersicum)植物，或替代性地携带一种或更多所述的QTL且可与番茄(Solanum lycopersicum)杂交的茄属(Solanum)物种的植物。任选地，在与相关的物种杂交之后，可实施技术诸如胚胎拯救，回交或本领域技术人员知道的其他技术，以获得种间杂交的种子，该种子可用作用于显示对凤果花叶病毒的抗性的非-转基因番茄(Solanum lycopersicum)植物的进一步发育的源。
本发明也涉及本发明的植物的种质。种质由生物的全部遗传的特征构成，及根据本发明包括至少本发明的性状。种质可用于开发PepMV抗性番茄植物的育种程序。
本发明也涉及由本发明的植物产生的番茄果实。本发明还涉及食品，包含要求保护的番茄植物的果实，或其部分。本发明也涉及经处理形式的食品。
在一方面，本发明涉及产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的方法，包括：
(a)使包含QTL1和QTL2的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB41927和NCIMB42068)，或包含QTL2和QTL3的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB41928)与不包含遗传决定因子的植物杂交，以获得F1群；
(b)任选地实施一轮或更多轮的自交及或使来自F1的植物杂交，以获得再一代群；
(c)自该群选择包含QTL1和/或QTL2的植物，或包含QTL2和/或QTL3的植物；
(d)使包含QTL1和/或QTL2的选择的植物与包含QTL2和QTL3的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB41928)杂交，或使包含QTL2和/或QTL3的选择的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB41927和NCIMB42068)与包含QTL1和QTL2的植物杂交；
(e)自交步骤(d)中获得的植物，以获得分离的群；
(f)选择包含QTL1和QTL2，或QTL2和QTL3，或QTL1和QTL3，或QTL1和QTL2和QTL3的植物。
本发明还涉及产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的方法，包括：
(a)使包含QTL1和QTL2的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB41927或NCIMB42068)，或包含QTL2和QTL3的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB41928)，或包含QTL1和QTL2和QTL3的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB42069)，与不包含遗传决定因子的植物杂交，以获得F1群；
(b)实施一轮或更多轮的自交和/或使来自F1的植物杂交，以获得再一代群；
(c)任选地自包含QTL1，2和3中的1种或2种的群选择植物，之后与包含QTL1，2和3中的至少另一种QTL的植物杂交，并随后重复步骤(b)；
(d)选择包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
在一方面本发明中涉及通过如下步骤产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的方法：使包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的第1亲本植物与包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的第2亲本植物杂交及在随后代中选择(任选地在进一步自交和/或杂交步骤之后)包含QTL1和QTL2，或QTL1和QTL3，或QTL2和QTL3，或QTL1和QTL2和QTL3的植物。
在优选的方面，本发明涉及产生番茄植物的方法，包括：
(a)使包含QTL1和QTL2和QTL3的植物(其代表性的种子保藏为NCIMB42069)与不包含所述的QTL的植物杂交，以获得F1群；
(b)实施一轮或更多轮的自交和/或使来自F1的植物杂交，以获得再一代群；
(c)任选地自包含QTL1，2和3中的1种或2种的群选择植物，之后与包含QTL1，2和3中的至少另一种QTL的植物杂交，并随后重复步骤(b)；
(d)选择包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
本发明另外地提供向包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物导入期望的性状的方法，包括：
(a)使包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物(其代表性的种子以保藏号NCIMB41927和NCIMB41928和NCIMB42068和NCIMB42069保藏在NCIMB)与包含期望的性状的第2番茄植物杂交，以产生F1后代；
(b)选择包含对凤果花叶病毒的抗性和期望的性状的F1后代；
(c)使选择的F1后代与亲本之一杂交，以产生回交后代；
(d)选择包含期望的性状和对凤果花叶病毒的抗性的回交后代；以及
(e)任选地连续重复步骤(c)和(d)一次或更多次，以产生包含期望的性状和对凤果花叶病毒的抗性的选择的第4或更后回交后代。本发明包括由此方法产生的番茄植物和由其获得的番茄果实。
包含本发明的遗传决定因子的植物的选择可替代性地在所述方法的任何杂交或自交步骤后进行。
在一实施方式中，包含遗传决定因子的植物是近交系，杂交体，加倍的单倍体，或分离的群的植物。
本发明还提供产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的方法，其通过使用加倍的单倍体产生技术产生包含所述的导致对凤果花叶病毒的抗性的遗传决定因子的加倍的单倍体系。
本发明此外涉及杂交体种子及产生杂交体种子的方法，所述方法包括使第1亲本植物与第2亲本植物杂交，及收获得到的杂交体种子，其中所述第1亲本植物和/或所述第2亲本植物是要求保护的植物。
在一实施方式中，本发明涉及产生杂交体番茄植物的方法，包括使第1亲本番茄植物与第2亲本番茄植物杂交，及收获得到的杂交体番茄种子，其中第1亲本番茄植物和/或第2亲本番茄植物包含本发明的导致对凤果花叶病毒的抗性的遗传决定因子，尤其是本文所述的遗传决定因子。
本发明也涉及产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的方法，其通过使用在其基因组中包含导致对凤果花叶病毒的抗性的遗传决定因子的种子用于生长所述的番茄植物。种子适宜地是这样的种子，其代表性的样品以保藏号NCIMB41927或NCIMB41928或NCIMB42068或NCIMB42069保藏在NCIMB。
本发明也涉及种子生产的方法，包括使包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物生长，允许植物产生种子，及收获那些种子。种子的产生适宜地通过杂交或自交进行。
在一实施方式中，本发明涉及通过使用组织培养产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的方法。本发明此外涉及通过使用营养繁殖产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的方法。
在一实施方式中，本发明涉及产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的方法，其通过使用遗传修饰方法向番茄植物导入导致对凤果花叶病毒的抗性的本发明的遗传决定因子。遗传修饰包含转基因修饰或反式发生(其使用来自非-可杂交的物种或合成基因的基因)，及顺式修饰或顺式发生(其使用来自作物植物本身或来自性相容的供体植物的编码(农业)性状的天然的基因)。
本发明也涉及开发包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的繁殖方法，其中使用包含导致对凤果花叶病毒的抗性的遗传决定因子的种质。所述包含遗传决定因子的植物的代表性的种子以保藏号NCIMB41927和NCIMB41928和NCIMB42068和NCIMB42069保藏在NCIMB。
在进一步实施方式中，本发明涉及产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的方法，其中将包含赋予所述对凤果花叶病毒的抗性的本发明的遗传决定因子的植物的后代或繁殖材料用作将对凤果花叶病毒的抗性渐渗杂交至另一番茄植物的源。所述包含遗传决定因子的植物的代表性的种子以保藏号NCIMB41927和NCIMB41928和NCIMB42068和NCIMB42069保藏在NCIMB。
本发明优选提供显示对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物，该植物可由本文描述的任何方法获得。
本发明也涉及产生番茄果实的方法，包括使本文所述的PepMV抗性番茄植物生长，及允许它们产生番茄果实和任选地收获果实。
本文所用的术语'遗传决定因子'包括一种或更多QTL，或本文所述的基因或等位基因。这些术语互换使用。
在一方面，本发明涉及存在于番茄(Solanum lycopersicum)基因组中的分子SNP标志物，该分子SNP标志物在番茄(Solanum lycopersicum)中与赋予对凤果花叶病毒的抗性的QTL遗传连锁，及该分子SNP标志物特征在于是SEQ ID NO:1～9之任一个。SEQ ID NO:1～9定义于表2。
在再一方面，本发明涉及由定义于表2的SEQ ID NO:1～9之任一个表征的分子标志物用于在番茄(Solanum lycopersicum)植物中鉴定凤果花叶病毒抗性赋予QTL的用途。
遗传决定因子或QTL可通过使用分子标志物鉴定。遗传决定因子或QTL可替代性地通过遗传图谱上的位置，或通过指示连锁群或染色体上的位置来鉴定。当遗传决定因子或QTL不再连锁于特定分子标志物，但其遗传图谱上定义的染色体位置未改变时，此遗传决定因子仍与其连锁到分子标志物时相同。因此，其赋予的遗传性状也仍相同。
'遗传性状'是由遗传决定因子赋予的性状或特征。遗传性状可在表型上鉴定，例如通过实施生物-测定。但是，不可实施表型测定的植物阶段也携带导致遗传性状的遗传信息。可使用'性状'或'表型性状'代替'遗传性状'。此外，在隐性性状的情况中，杂合植物也携带当以纯合形式存在时导致PepMV抗性性状的遗传信息。该植物是抗性等位基因的来源，由此也是本发明的部分。
在分子标志物缺失下，或在已发生遗传决定因子和标志物之间的重组，从而标志物不再可预测的情况下，可通过等位性测试测定遗传决定因子的等位性。为了实施等位性测试，使对于知道的本发明的决定因子纯合的测试植物与对其遗传决定因子也纯合的待测试的材料杂交。当杂交F2中不存在待观察的性状的分离时，遗传决定因子已被证明等位或相同。
当多于一种基因负责特定性状，且进行等位性测试以测定等位时，做测试的本领域技术人员需保证，为适当地工作，对于测试，全部关联基因纯合地存在。
遗传图谱可根据组建它们的方法而改变。本领域技术人员知道如何比较及组合遗传图谱，其中可消除或最小化遗传图谱之间的差异。来自一个遗传图谱的信息可因此转移或翻译到另一遗传图谱。本文所用的位置是基于2011年1月发布的SL2.40版的番茄基因组的公共物理图谱的物理位置(http://solgenomics.net/genomes/Solanum_lycopersicum/genome_data.pl)。
基于本发明的遗传决定因子的对凤果花叶病毒的抗性包含对于一种或更多知道的PepMV基因型的抗性。知道的基因型包括本领域技术人员已知的LP，EU，CH1，CH2，US1和US2。对凤果花叶病毒的抗性可还包含对目前尚未鉴定的PepMV基因型的抗性。尚未鉴定的PepMV基因型可为目前感染植物，但尚未被表征属于凤果花叶病毒的基因型。其也可为自已存在的株发展而来的新PepMV基因型，或也将会被分类为凤果花叶病毒的另一基因型。
【保藏】
包含本发明的导致对凤果花叶病毒的抗性的遗传决定因子的番茄(Solanumlycopersicum)11R.412000和11R.446400的种子，在2012年1月13日，分别以保藏号No.NCIMB41927和NCIMB41928，保藏在NCIMB Ltd,Ferguson Building,CraibstoneEstate,Bucksburn,Aberdeen AB219YA,UK。
包含QTL1和QTL2的番茄(Solanum lycopersicum)12R.4211014的种子，及包含本发明的遗传决定因子(包含QTL1和QTL2和QTL3(该QTL导致对凤果花叶病毒的抗性))的番茄(Solanum lycopersicum)T12R.107的种子，在2012年10月10日，分别以保藏号No.NCIMB42068和NCIMB42069，保藏在NCIMB Ltd,Ferguson Building,CraibstoneEstate,Bucksburn,Aberdeen AB219YA,UK。
保藏的种子不符合获得植物变种保护所需要的DUS标准，因此不被认为是植物变种。
本发明还会在以下实施例中例证。
【实施例】
【实施例1：本发明的番茄植物的产生】
在导致本发明的研究中，在申请人的种质中，通过对凤果花叶病毒抗性实施生物测定(见实施例2)来鉴定就凤果花叶病毒免疫的秘鲁蕃茄(S.peruvianum)植物。由连续生物-测定重复确认抗性的免疫水平。秘鲁蕃茄(S.peruvianum)中免疫的鉴定是非常惊人的，由于尽管已在各种研究中筛选许多登录，尚未给出关于秘鲁蕃茄(S.peruvianum)中免疫或高度抗性植物的早先报道。
在生物-测定中尚未鉴定出含有针对PepMV的免疫的其他秘鲁蕃茄(S.peruvianum)植物。单免疫植物自身-不相容，由此无法获得自交的种子。由于对PepMV免疫的遗传被预期复杂，与另一秘鲁蕃茄(S.peruvianum)植物杂交，之后自交及就抗性选择被认为是就维持免疫而言太有风险的方法。因此植物仅增长及通过插枝营养性地维持。
使自身-不相容的免疫秘鲁蕃茄(S.peruvianum)源植物与番茄(Solanumlycopersicum)系杂交。实施胚胎拯救，以获得此种间杂交的F1后代。就对凤果花叶病毒的抗性筛选F1，但该群被发现敏感。
F1还是自身-不相容的，及实施各种F1植物的互交，以获得可用于进一步开发的F2群。
就PepMV抗性重复测试大量的F2植物，通过对各植物进行10次插枝，以获得同一基因型。PepMV抗性测试鉴定出仅2个高度抗性F2植物。但是，那些植物中抗性水平仍小于原秘鲁蕃茄(S.peruvianum)源的水平。
为了更接近栽培的番茄类型，使高度抗性植物与番茄(Solanum lycopersicum)系回交，及再次实施胚胎拯救以获得BC1群。使BC1自交及自这些获得约15BC1S1群。对PepMV高度抗性的植物，自各群筛选75个和150个之间的植物，如在实施例2中描述。
最终选择7个BC1S1植物有良好水平的抗性，和对这些植物制造BC2。需实施胚胎拯救，以获得此BC2代。BC2再次自交和自此衍生166个BC2S1家族而用于进一步筛选及选择。自那些家族中的每一个，就抗性筛选150个植物。各筛选由2步骤组成，如描述于实施例2。当家族被认为含有良好数的抗性植物时，需用更强，欠稀释的，接种物再次重复筛选。用此方式可鉴定最高抗性。
在各回交及自交步骤之后，实施生物-测定，以鉴定高度抗性植物及确认高水平的抗性。
在第1代期间，PepMV抗性被证明与植物的短小生长强烈连锁。此副作用呈现为自抗性源连锁拖累的结果。由于短小生长是明显负面特征，此连锁拖累使抗性不可应用于在繁殖中直接使用。其还使其难以实施生物-测定，由于植物呈现为弱，使经延长的时间保持它们成为挑战。自选择的短小植物获得种子被证明甚至更复杂。
此外，显然，抗性的遗传构成非常复杂。即使已长时间在番茄中搜索对PepMV的抗性，至今尚未产生对病毒具有高水平的抗性的栽培的番茄(S.lycopersicum)植物。对在栽培的番茄中合并对此广布病毒的高抗性水平的可行性问题因此仍待回答。与困难的生物-测定组合的抗性遗传背景的复杂性使其非常难以为番茄(Solanum lycopersicum)鉴定含有必要的高水平的抗性或免疫的期望的后代植物。
因此实施在实施例3中描述的QTL图谱，以首先澄清抗性的遗传构造。随后起始于BC2代，与表型筛选组合而进行标志物辅助的回交及选择，以检测会导致需要的高水平的抗性的植物。短小生长被确定连锁于第6染色体上的QTL(QTL1)。
通过使用用于3种QTL的标志物，在BC2S1中，可开发2个家族为具有足够高水平的抗性，各纯合地含有QTL中的2种，并在第6染色体上不再有会导致短小生长的连锁拖累。将自这些系的种子保藏为NCIMB41927和NCIMB41928。
如上述进一步回交，筛选及选择导致进展的BC4S1群。自那些群之一，选择纯合地包含2种QTL，即QTL1和QTL2的另一植物及保藏为NCIMB42068。
BC4S1群还包含纯合地具有QTL1和QTL2和QTL3的，具有高水平的抗性或免疫的番茄(S.lycopersicum)植物。将纯合地包含全部3种QTL的这些植物的后代保藏为NCIMB42069。
【实施例2：对凤果花叶病毒抗性的生物-测定】
凤果花叶病毒包括非常攻击性的基因型，但其行为和症状表现可为无法预测的。因此，开发抗性植物，以实施具有足够的重复性的非常充分的测定，以在栽培者的条件中确保良好性能是极其重要的。
自待测试的植物，制造几个插枝，以对相同的基因型的几个植物进行测定。此方法防止'逃逸'的选择，即植物由于一些原因而被鉴定为抗性，但此推定的抗性仅是由于环境，而非因为植物含有导致抗性的遗传决定因子。因此，以最佳方式，由一起形成同一基因型群的插枝形成测定抗性的重复，这使得生物-测定的结果高度可靠。
用于实施生物-测定的接种物从感染的番茄叶得到。用具有相对低病毒滴度的接种物起始生物-测定，其中接种物例如被稀释300倍。由本领域所知的标准方法进行机械接种。选择以此水平对PepMV显示表型抗性的植物。它们包括包含导致PepMV抗性的一种或更多QTL的遗传决定因子。
具有表型抗性的植物优选是在生物-测定中不显示任何PepMV症状的植物。营养性植物部分的症状可不同及包含'荨麻头'(浅灰色的,尖的植物顶部)，矮小的头，扭曲的叶，黄萎病叶，马赛克斑，成斑或叶斑。筛选的植物也可相比包括在中生物-测定中的敏感的对照及被认为具有特定水平的抗性那些植物而显示减少的易感性。敏感的对照可例如选自至今本领域所知的任何番茄变种。显示减少的易感性，但不是抗性或高度抗性或免疫的植物不纯合地包含QTL1和QTL2和QTL3。
由优选具有高水平的抗性及未显示症状的选择的植物一次制得更多插枝，以再次起始年轻植物阶段。以此方式，再次有用作获得最可靠的生物-测定的重复的同一基因型。选择的植物用具有高病毒滴度的接种物再接种，为此接种物例如被稀释30倍。以此方式，鉴定含有导致PepMV抗性的最佳遗传决定因子的最强植物。优选由纯合地存在QTL1和QTL2和QTL3达到最高水平的抗性或免疫。
作为扩展的生物-测定的必要的部分，实施ELISA测定以测定选择的植物不仅是无症状的，但病毒也不在植物中增殖。病毒的蓄积会最终导致症状或植物衰弱，由此该植物不是作为耐久抗性源有用的。因此，通过ELISA测定确认选择的植物是真正无病毒是必要的。实施测定病毒存在的ELISA测定是本领域技术人员知道的标准方法。
具有分值<0.1的植物(其在ELISA测试中具有少于0.1的吸收)，被确认为本发明的抗性植物。这些植物具有类似于非-接种的对照的吸收。使用高浓度接种物(其已被例如30倍稀释)具有少于0.1的吸收的植物(这是类似于非-接种的对照的吸收)具有特征在于高度抗性或免疫的抗性机理。
当使用更低浓缩的接种物，例如300倍稀释的接种物时，选择在ELISA测试中具有少于0.1的吸收的抗性植物及回交，以起始下一循环。在生长时期期间持续症状观察和使用各种接种物浓度的ELISA测试，以确保植物具有耐久抗性。
在许多条件下，在生物-测定期间，在年轻植物中不可见病毒症状。在这些情况中，ELISA测定仅是在具有减少的易感性，或具有抗性，或高度抗性，或免疫的此阶段的植物进行选择的基础。ELISA测定优选在接种插枝之后至少14天或至少18天或至少21天，或任选地在番茄植物的生长时期期间在更长时间之后实施。
由于凤果花叶病毒的性质和抗性的复杂性，在生物-测定中使用的最佳接种物浓度可改变。最佳浓度根据存在于用作获得接种物的源的植物的病毒的强度和浓度改变。最佳浓度也依赖于存在于待测试的植物的QTL数。例如，为选择具有仅1种或2种本发明的QTL的植物，应使用更低浓度的接种物。接种用接种物的稀释可为3倍，30倍，300倍，3000倍，30,000倍或发现适宜于生物-测定实施的条件的任何其他浓度。当可在ELISA测定中测定敏感的对照和抗性植物之间的病毒滴度的明显的差异时，浓度是适合的。
有必要总是包括抗性和敏感的对照植物作为参照进行检查是否使用的接种物浓度对于在生物-测定中使用是适当的，。PepMV生物-测定的可靠性的本质在于：依次包括至少2种不同接种物浓度，其中第2接种物具有更高浓度；使用许多同一基因型(优选通过插枝)，以确认抗性的存在；及在于通过ELISA测定确认病毒减少或病毒缺失或类似于非-接种的对照植物的吸收，以选择具有减少的易感性或抗性或高抗性或免疫的植物。
表1：使用300倍接种物稀释对各种BC2S1家族的PepMV抗性的分离
自表得出，显示的BC2S1家族就抗性(<0.1)和敏感的植物(>1.0)分离。在此阶段，无BC2S1家族纯合地具有全部3种QTL，因此仍观察到抗性的分离。选择在此阶段最强的植物，并随后用30倍稀释的接种物接种。但是，在此阶段不存在纯合地具有全部3种QTL的植物。即使在生物-测定中鉴定抗性植物，结果在此阶段，在用ELISA确认之后，无一被确认高度抗性或免疫。
在进一步推进后，可开发纯合地包含QTL1和QTL2和QTL3的BC4S1番茄(S.lycopersicum)植物。这些番茄植物在就PepMV抗性的生物-测定中高度抗性或免疫。这些植物还在ELISA测试中具有少于0.1的吸收，类似于非-接种的对照。
【实施例3：QTL作图及标志物开发】
将由自实施例1获得的184个BC1S1植物组成的大群用于对凤果花叶病毒的抗性作图。在第1轮中分析880个SNP标志物，及另外的559个SNP标志物包括在第2轮中。这些SNP标志物中的281个在第1轮中是多态性的，及在第2轮中，可增加387个多态SNP，产生用于对184个BC1S1植物，就PepMV抗性进行QTL分析的总671个标志物。
显著地，定位了贡献于抗性的3种QTL，定位于3个分离染色体上。与QTL最接近地关联的分子SNP标志物显示于表2。
为定位QTL，将番茄(Solanum lycopersicum)基因组的以公共渠道可利用的图谱SL2.40用作本文提及的全部位置的参照。
解释8.8％的变异的第1QTL位于第6染色体，具有5.34的LOD分值。QTL的位置被测定在物理位置32,363,349bp和34,505,939bp之间，优选位置33,558,627bp和34,505,939bp之间。在BC1S1群和随后后代中，此QTL最接近地与在位置34,456,931的SNP标志物连锁，其序列作为SEQ ID NO:1(见于表2)。优选的QTL区的边缘由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的存在鉴定。
解释12.1％的变异及具有7.12的LOD分值的第2QTL被鉴定位于第7染色体，物理位置60,667,821bp和62,460,220bp之间，优选位置61,387,356bp和62,253,846bp之间。在BC1S1群和自此群发展的随后后代中，QTL2被连锁于在位置61,550,890的SNP。分子SNP标志物的序列作为SEQ ID NO:2(见于表2)。优选的QTL区的边缘由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的存在鉴定。
第3QTL解释19.7％的变异。此QTL的LOD分值是11.03。QTL3位于第9染色体物理位置60,998,420bp和62,512,587bp之间，优选位置61,494,664bp和62,385,023bp之间，更优选位置61,723,339和62,385,023之间。QTL3在BC1S1和随后后代中连锁于在位置61,603,006上的分子SNP标志物。序列见于表2。QTL3还由SNP标志物SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的存在定义。
SEQ ID NO:1包含在第6染色体正向链上在位置34,456,931处从核苷酸A(野生型)至G的SNP的存在。该位置也可在表2中显示的核苷酸序列中第16位置(加粗)指示。
SEQ ID NO:2包含在第7染色体正向链上在位置61,550,890处从核苷酸C(野生型)至G的SNP的存在。该位置也可在表2中显示的核苷酸序列中第16位置(加粗)指示。
SEQ ID NO:3包含在第9染色体正向链上在位置61,603,006处从核苷酸C(野生型)至T的SNP的存在。该位置也可在表2中显示的核苷酸序列中第16位置(加粗)指示。
SEQ ID NO:4包含在第6染色体正向链上在位置33,558,627处从核苷酸T(野生型)至C的SNP的存在。该位置也可在表2中显示的核苷酸序列中第16位置(加粗)指示。
SEQ ID NO:5包含在第6染色体正向链上在位置34,505,939处从核苷酸C(野生型)至T的SNP的存在。该位置也可在表2中显示的核苷酸序列中第16位置(加粗)指示。
SEQ ID NO:6包含在第7染色体正向链上在位置61,387,356处从核苷酸T(野生型)至C的SNP的存在。该位置也可在表2中显示的核苷酸序列中第16位置(加粗)指示。
SEQ ID NO:7包含在第7染色体正向链上在位置62,253,846处从核苷酸C(野生型)至A的SNP的存在。该位置也可在表2中显示的核苷酸序列中第16位置(加粗)指示。
SEQ ID NO:8包含在第9染色体正向链上在位置61,872,648处从核苷酸C(野生型)至T的SNP的存在。该位置也可在表2中显示的核苷酸序列中第16位置(加粗)指示。
SEQ ID NO:9包含在第9染色体正向链上在位置62,191,735处从核苷酸G(野生型)至C的SNP的存在。该位置也可在表2中显示的核苷酸序列中第16位置(加粗)指示。
表2：基于公共SL2.40图谱的在保藏号NCIMB41927，NCIMB41928，NCIMB42068和NCIMB42069中连锁于QTL1，QTL2和QTL3的分子SNP标志物，该QTL在番茄(Solanumlycopersicum)中赋予PepMV抗性。
SNP序列 表示
SEQ ID NO:1 GATGATCCCCCAATGGTCAAGAAATCTTGCA QTL1
SEQ ID NO:2 CACTGGTGAAAAAGTGGCAATTAAAAAAATT QTL2
SEQ ID NO:3 CTCTCAAGTTCCAGATACCGCTTCTGAGGGA QTL3
SEQ ID NO:4 TCTCGTTCGTGTTCTCGTCTCCTCTAATCTC QTL1
SEQ ID NO:5 GGACATTGAGCAGATTTCTTACTGGCTTCTG QTL1
SEQ ID NO:6 AGGATATGCAGCGGACGGGTTCCAAGGGCTT QTL2
SEQ ID NO:7 CTGAATGGAGAAGGAAGGCCTGCCAGTGTTG QTL2
SEQ ID NO:0：8 TCTTTCTTGGCTGTTTAACTCGCGATGAACG QTL3
SEQ ID NO:0：9 AAGAAAGG1111GGTCTTTCGCAAAAGGCAG QTL3
SNP序列在NCIMB41927(QTL1和QTL2)，NCIMB42068(QTL1和QTL2)，NCIMB41928(QTL2和QTL3)，NCIMB42069(QTL1和QTL2和QTL3)中连锁到相应QTL。可将SNP序列用作在所述保藏的植物中的PepMV抗性的分子标志物。
【实施例4：抗性的转移】
使来自T12R.107的自交的植物(仍纯合地含有QTL1和QTL2和QTL3)与未携带任何本发明的抗性-赋予QTL的番茄植物杂交。自杂交获得的F1以杂合状态具有本发明的全部3种QTL。由于未预期足够的抗性水平，F1群未在表型上测试PepMV抗性，且由于杂合QTL会在接下来的F2代全部分离，在F1中另外地选择不与此性状关联。
使F1自交及播种250个F2种子。理论上，64个植物中的1个被预期纯合地具有本发明的全部3种QTL。在幼苗阶段实施标志物分析，其中使用表2中提及的全部9种SNP标志物。使用全部9种标志物来确证抗性基因和标志物之间的潜在重组体不会在此阶段被选择。
幸运地，可通过标志物分析自F2幼苗鉴定3个植物纯合地含有QTL1和QTL2和QTL3，选择这些植物及保持用于进一步繁殖。
为了确认选择的植物的抗性，制造插枝及根据实施例2实施生物-测定。在使用3000倍稀释的接种物第1轮接种之后未观察到症状。在第2轮中，接种物被稀释300倍，及再次未发现凤果花叶病毒症状。作为敏感的对照，使用杂交体变种Mecano，其在早期植物阶段显示清楚的叶症状。
为了确保病毒未在选择的植物中蓄积，及再次在实施例2中描述的测定后，在第2轮接种中，在敏感的对照上出现症状之后，对选择的植物进行ELISA测试。ELISA测定显示与免疫源相当的吸收，由此确认，选择的植物中的病毒蓄积可忽略。在植物的生长时期期间，包括在座果期间，实施重复ELISA测定，以确保植物在生殖阶段期间也会保持抗性。

Claims (19)

1.产生被赋予对凤果花叶病毒(PepMV)的抗性的番茄植物(番茄(Solanumlycopersicum L.))的方法，其包括使番茄植物(番茄(Solanum lycopersicum L.))携带包含QTL1，QTL2和QTL3中的至少两种的遗传决定因子，其中
●QTL1位于连锁群(LG)6上的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5之间，
●QTL2位于连锁群(LG)7上的SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7之间，和
●QTL3位于连锁群(LG)9上的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:9之间，且
所述被赋予对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物(番茄(Solanum lycopersicum L.))的代表性的种子以下列保藏号保藏在NCIMB：NCIMB 41927，NCIMB 41928，NCIMB 42068和NCIMB 42069。
2.权利要求1的方法，其中
●QTL1位于连锁群(LG)6上、且连锁于SEQ ID NO:1，
●QTL2位于连锁群(LG)7上、且连锁于SEQ ID NO:2，和
●QTL3位于连锁群(LG)9上、且连锁于SEQ ID NO:3。
3.权利要求1的方法，其中QTL3位于连锁群(LG)9上的SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9之间。
4.权利要求1的方法，其中遗传决定因子包含：
●QTL1及QTL2，
●QTL1及QTL3，或
●QTL2及QTL3。
5.权利要求1的方法，其中遗传决定因子包含QTL1、QTL2及QTL3。
6.权利要求1～5之任一项的方法，其中所述方法包括下列步骤：
(a)使包含QTL1和QTL2的植物，其代表性的种子保藏为NCIMB 41927或NCIMB 42068，或包含QTL2和QTL3的植物，其代表性的种子保藏为NCIMB 41928，或包含QTL1和QTL2和QTL3的植物，其代表性的种子保藏为NCIMB 42069，与不包含所述遗传决定因子的植物杂交，以获得F1群；
(b)实施一轮或更多轮的自交和/或使来自F1的植物杂交，以获得再一代群；
(c)任选地自群选择包含QTL 1，2和3中的1种或2种的植物，之后与包含至少QTL 1，2和3中的另一种QTL的植物杂交，并随后重复步骤(b)；
(d)选择包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
7.权利要求1～5之任一项的方法，其中所述方法包括：使包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的第1亲本植物与包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的第2亲本植物杂交及在随后代中，任选地在进一步自交和/或杂交步骤之后，就包含QTL1和QTL2，或QTL 1和QTL3，或QTL2和QTL3，或QTL1和QTL2和QTL3的植物进行选择。
8.由权利要求1～7之任一项的方法产生的番茄植物用于产生番茄种子的用途，其中可自番茄种子生长的番茄植物包含一种或更多权利要求1～3之任一项中定义的QTL 1～3。
9.权利要求8的用途，其中可自番茄种子生长的番茄植物抵抗凤果花叶病毒。
10.由权利要求1～7之任一项的方法产生的番茄植物用于产生番茄植物的后代或权利要求8或9中提及的番茄种子用于产生番茄种子的后代的用途，其中所述番茄植物的后代或番茄种子的后代包含一种或更多权利要求1～3之任一项中定义的QTL 1～3。
11.权利要求10的用途，其中所述番茄植物的后代或番茄种子的后代抵抗凤果花叶病毒。
12.由权利要求1～7之任一项的方法产生的番茄植物用于产生被赋予对凤果花叶病毒(PepMV)的抗性的番茄植物(番茄(Solanum lycopersicum L.))的繁殖材料的用途，所述繁殖材料适合于产生被赋予对凤果花叶病毒(PepMV)的抗性的番茄植物(番茄(Solanumlycopersicum L.))或其种子，其中繁殖材料适宜于性繁殖，且尤其选自小孢子，花粉，子房，胚珠，胚囊和卵细胞，或适宜于植物性繁殖，且尤其选自插枝，根，茎，细胞，原生质体，或适宜于可再生的细胞的组织培养，且尤其选自叶，花粉，胚，子叶，下胚轴，分生组织细胞，根，根端，花药，花，种子和茎，其中自繁殖材料产生的植物包含一种或更多权利要求1～3之任一项中定义的QTL 1～3。
13.权利要求12的用途，其中自繁殖材料产生的植物抵抗凤果花叶病毒。
14.权利要求1～5之任一项的方法或权利要求8～13之任一项的用途，其中所述番茄植物、番茄种子、番茄植物的后代或番茄种子的后代、或繁殖材料包含下列中的至少2个：
●QTL1，其在保藏NCIMB 41927和/或NCIMB 42068和/或NCIMB 42069中连锁到由下列表征的分子标志物：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，
●QTL2，其在保藏NCIMB 41927和/或NCIMB 41928和/或NCIMB 42068和/或NCIMB42069中连锁到由下列表征的分子标志物：SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，和
●QTL3，其在保藏NCIMB 41928和/或NCIMB 42069中连锁到由下列表征的分子标志物：SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。
15.由权利要求1～7之任一项的方法产生的番茄植物用于产生番茄果实的用途。
16.下列物质在开发凤果花叶病毒抗性番茄植物的育种程序中作为种质的用途：
由权利要求1～7和14之任一项的方法产生的番茄植物，
权利要求10或11中提及的番茄植物的后代或番茄种子的后代，或
自权利要求8或9中提及的番茄种子或自权利要求12或13中提及的繁殖材料产生的番茄植物。
17.分子标志物，其存在于番茄(Solanum lycopersicum)基因组中，在番茄(Solanumlycopersicum)中，该分子标志物与赋予对凤果花叶病毒的抗性的QTL遗传连锁，且该分子标志物如SEQ ID NO:1～9之任一个所示且其中QTL如权利要求1～3之任一项中定义。
18.权利要求17的分子标志物，其中所述分子标志物是分子SNP标志物。
19.SEQ ID NO:1～9之任一个所示的分子标志物用于在番茄(Solanum lycopersicum)植物中鉴定赋予凤果花叶病毒抗性的QTL的用途，其中QTL如权利要求1～3之任一项中定义。
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