ES2901399T3 - Resistencia al virus de la marchitez manchada del tomate y/o al virus de la mancha necrótica de impatiens en lechuga cultivada - Google Patents

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Abstract

Una planta de lechuga (Lactuca sativa L.) que comprende un determinante genético, el cual cuando está presente homocigóticamente confiere resistencia al virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV) y/o al virus de la mancha necrótica de impatiens (INSV), y el cual se encuentra o es obtenible de las plantas cultivadas a partir de semillas de las cuales se depositó una muestra representativa con el número de acceso NCIMB 42023, dicho determinante genético en las semillas del depósito NCIMB 42023 se ubica en el grupo de ligamiento 2 y se encuentra ligado al marcador TSWV-00001 (SEQ ID NO: 1).

Description

DESCRIPCIÓN
Resistencia al virus de la marchitez manchada del tomate y/o al virus de la mancha necrótica de impatiens en lechuga cultivada
La presente invención se refiere a plantas de lechuga (Lactuca sativa L.) resistentes contra el virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV) y/o al virus de la mancha necrótica de impatiens (INSV). La invención se refiere adicionalmente a partes de estas plantas, a semillas, a material de propagación y a la progenie de estas plantas. La lechuga cultivada pertenece a la especie altamente polimórfica, Lactuca sativa, la cual es un miembro de la familia Asteraceae (Compositae). L. sativa es una de las aproximadamente 300 especies del género Lactuca. La lechuga se relaciona con achicoria, girasol, aster, acorzonera, diente de león, alcachofa y crisantemo. La lechuga se cultiva comercialmente por su cabeza y hojas comestibles, siempre que las condiciones ambientales permitan la producción de un rendimiento económicamente viable.
El TSWV e INSV están estrechamente relacionados pero son miembros distintos del género Tospovirus. Dado que los virus, tales como el TSWV e INSV son parásitos obligados, no pueden sobrevivir fuera de su especie huésped. La transmisión de estos virus se produce de una planta a otra a través de semillas, insectos o esquejes. Se conocen seis especies de trips como vectores de TSVW: trips occidental de las flores, trips de la cebolla (Thrips tabaci), trips del tabaco (Frankiniella fusca), trips de las flores comunes (Frankliniella schultzei), Thrips setosus, y Scirtothrips dorsalis. En el caso de INSV, el insecto vector es el trips occidental de las flores (Frankliniella occidentalis). Ambos virus son altamente polífagos y pueden causar pérdidas totales de cultivos en varios cultivos vegetales cultivados que incluyen lechuga, tomate, y pimiento. En la lechuga, la infección por TSWV y/o INSV se ha confirmado en lechugas cos o romana, crisphead o iceberg, y de hoja verde, pero esencialmente estos virus son capaces de infectar todo tipo de lechugas.
Los síntomas de TSWV e INSV pueden variar en dependencia del huésped, las condiciones ambientales que afectan al huésped, y el virus individual que infecta la planta. Los síntomas comunes que pueden afectar a todos los huéspedes incluyen manchas necróticas, rayas, manchas anulares, atrofias, y marchitamiento.
En la lechuga, TSWV y/o INSV pueden causar síntomas indistinguibles. Las hojas de las plantas de lechuga infectadas desarrollan manchas pardas y áreas necróticas. A medida que se propaga la necrosis, gran parte de la hoja se empardece, se seca, y muere. Los márgenes de las hojas pueden marchitarse y volverse amarillos. El empardecimiento y el amarilleo de las hojas es evidente tanto en las hojas más nuevas como en las más viejas. A menudo, solo un lado de una planta infectada se afecta. Las plantas de lechuga que se infectan al principio del desarrollo pueden atrofiarse y luego morir. Las plantas infectadas que sobreviven hasta la cosecha no son usualmente comercializables. Adicionalmente, las plantas de lechuga infectadas con TSWV producen semillas limitadas o nulas. El diagnóstico es difícil con base en solo los síntomas, ya que estos pueden parecerse a otras enfermedades fúngicas y bacterianas, al daño que causa la aplicación de fertilizantes o pesticidas, o al estrés ambiental.
Actualmente, los métodos para controlar TSWV e INSV se dirigen principalmente a los vectores trips, o pueden involucrar la aplicación de medidas de saneamiento. El TSWV e INSV pueden controlarse con buenas prácticas de manejo que reduzcan la probabilidad de infestación de trips, inspeccionar y aislar plantas que presenten síntomas de virus y/o trips, destruir tales plantas sintomáticas, y monitorear y manejar los niveles de trips. Aunque el control químico de los trips es posible, el uso repetido de ciertos insecticidas ha conducido a poblaciones de trips resistentes. Por lo tanto, es altamente ventajoso encontrar fuentes directas de resistencia a TSWV y/o INSV, en lugar de manejar los vectores del virus o emplear medidas de control una vez que la infectividad ya se ha establecido.
Un enfoque para introducir la resistencia al TSWV a la lechuga es a través de la ingeniería genética. Las plantas de lechuga transgénicas que expresan el gen de la proteína nucleocápsida (N) del aislado de lechuga de TSWV se protegieron contra los aislados de TSWV. La resistencia se produce ya sea, por acumulación de altos niveles de proteína N transgénica o por un mecanismo de silenciamiento del transgén N que se activa por su sobreexpresión. Aunque los métodos transgénicos para introducir resistencia pueden resultar efectivos, en el ambiente actual puede que no sea un método ampliamente aceptado, especialmente cuando el producto final se usará para el consumo alimenticio.
El presente estado de la técnica no proporciona plantas de lechuga que sean resistentes contra TSVW y/o INSV. Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es desarrollar plantas de lechuga que sean resistentes contra TSVW y/o INSV, y que muestren en la presente descripción rasgos agronómicamente deseables.
En la investigación que condujo a la presente invención, se desarrollaron nuevas plantas de lechuga (Lactuca sativa L.) que son altamente resistentes contra TSVW y/o INSV.
Dicha resistencia de la invención se controla por un determinante genético, cuya herencia es consistente con la de un rasgo recesivo monogénico. El término "recesivo" significa en este contexto que la resistencia completamente alcanzable solo es observable en plantas que comprenden el determinante genético en el estado homocigoto.
Dado que la herencia de la resistencia es comparable a la de un rasgo monogénico, tiene una ventaja sobre la técnica anterior, debido a que la resistencia es alta, puede incorporarse fácilmente en varios tipos de lechugas cultivadas, y se dirige contra TSWV y/o INSV.
Además, se encontró durante la investigación que condujo a la presente invención que el determinante genético que confiere resistencia a TSWV y/o INSV, se encuentra en el grupo de ligamiento 2 del mapa de ligamiento genético integrado de la lechuga (Truco y otros (2007) Theoretical and Applied Genetics, 115(6): 735-46) y se vincula al marcador TSWV-00001 (SEQ ID NO: 1).
La presente invención se refiere a una planta de lechuga que comprende un determinante genético, el cual cuando está presente homocigóticamente confiere alta resistencia a TSWV y/o INSV, y el cual se encuentra o está presente en, o está contenido, o se puede obtener a partir del genoma de plantas que se cultivan a partir de semillas de las cuales se depositó una muestra representativa bajo el número de acceso NCIMB, NCIMB 42023, dicho determinante genético en las semillas del depósito NCIMB 42023 se encuentra en el grupo de ligamiento 2 y se encuentra ligado al marcador TSWV-00001 (SEQ ID NO: 1).
La invención se refiere adicionalmente a una planta de lechuga que comprende el determinante genético homocigóticamente y, por lo tanto, es altamente resistente contra TSWV y/o INSV.
En la presente descripción se describe una planta de lechuga que es resistente contra TSWV y/o INSV, obtenible al cruzar una planta resistente de la cual se depositó una semilla representativa bajo el número de acceso NCIMB 42023 con otra planta de lechuga para producir un F1, posteriormente se autofecunda dicho F1 para obtener un F2, y se selecciona una planta que muestre resistencia a TSWV y/o INSV.
La invención también se refiere a una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV, que comprende un determinante genético que confiere resistencia al TSWV y/o INSV, en donde dicho determinante genético es obtenible por introgresión de una planta que se cultiva a partir de semillas de las cuales se depositó una muestra representativa con el número de acceso NCIMB 42023, y en donde dicho determinante genético en las semillas del depósito de semillas número NCIMB 42023 está en una posición en el grupo de ligamiento 2 y se encuentra ligado al marcador TSWV0000-1.
Una planta de lechuga portadora del determinante genético que confiere resistencia al TSWV y/o INSV puede identificarse adecuadamente entre los descendientes de un cruce entre una planta susceptible al TSWV y/o INSV, y una planta que porta el determinante genético, preferiblemente en el estado homocigoto, al cultivar plantas F2 a partir de semillas que son el resultado del cruce inicial y un paso de autofecundación, y seleccionar las plantas que muestran el rasgo de resistencia. Las plantas pueden seleccionarse con base en la determinación del fenotipo mediante un bioensayo, o mediante la identificación del determinante genético, por ejemplo, mediante uno o más de los marcadores que se definen en la presente descripción.
Un bioensayo, es un método de prueba que es capaz de discernir entre plantas que son susceptibles o resistentes contra un patógeno particular. Un bioensayo de TSWV o INSV como se usa en la presente descripción, se realiza al primero sembrar semillas de las plantas que se van a probar, preferiblemente en cubos de turba en un invernadero, y cultivar las semillas en plantas. Las plantas se cultivan, preferiblemente durante 2 semanas, y preferiblemente a una temperatura entre 22 °C y 28 °C. Se evalúa un número relevante de plantas por línea, preferiblemente aproximadamente 14 plantas, para permitir que se observe la segregación si está presente.
Cuando las plantas están preferiblemente en la etapa de crecimiento 3 o 4, se inoculan, preferiblemente mediante inoculación mecánica, con un inóculo que contiene el patógeno viral apropiadamente mantenido. Las plantas inoculadas con TSWV se puntúan para la infección, preferiblemente a los 14 días y 21 días después de la infección, mientras que las plantas inoculadas con INSV se puntúan para la infección, preferiblemente a los 18 días, 24 días, y 30 días después de la infección. Las plantas resistentes y susceptibles adecuadas, si están disponibles, pueden incluirse como plantas de control en el bioensayo.
La resistencia o susceptibilidad al patógeno, se puntúa en una escala apropiada, con base en los síntomas de la planta, o la carencia de los mismos, al patógeno. El experto en la técnica puede usar una escala con cualquier subdivisión siempre que la puntuación se realice en la misma etapa de crecimiento de la planta que se usa en la presente invención. Los resultados del bioensayo TSWV y/o INSV pueden confirmarse, preferiblemente en pruebas de campo donde la presión de enfermedades correspondiente esté presente. La puntuación de la enfermedad en la prueba de campo se realiza preferiblemente mediante el uso de la misma escala para puntuar los síntomas que se usó para el bioensayo. Adicionalmente, las pruebas ImmunoStrip (Agdia Inc., Elkhart, Indiana, Estados Unidos, 46514) para TSWV e INSV, por ejemplo, se pueden usar para confirmar que aquellas plantas que se puntúan como asintomáticas o resistentes en los bioensayos, también previenen la multiplicación viral o la acumulación de partículas de virus, tras la inoculación del virus en la planta.
El método de inoculación mecánica con un virus es bien conocido en la técnica. La inoculación mecánica involucra frotar los cotiledones de la planta a infectar, con el inóculo viral. Para TSWV, el inóculo que se usa para la inoculación mecánica se prepara al triturar hojas jóvenes que muestren signos visibles de infección, preferiblemente mediante el uso de una mezcla de hojas de Nicotiana benthamiana infectadas con TSWV (1/5to) y dos cultivares de lechuga infectados con TSWV (cada uno 2/5tos), en un tampón de inoculación recién preparado, con carborundo y carbón vegetal. Similarmente para INSV, el inóculo que se usa para la inoculación mecánica se prepara al triturar hojas jóvenes que muestren signos visibles de infección, preferiblemente mediante el uso de una mezcla de hojas de Nicotiana benthamiana infectadas por INSV (1/2) y dos cultivares de lechuga infectados por INSV (cada uno 1/4), en un tampón de inoculación recién preparado, con carborundo y carbón vegetal. Tras la inoculación viral, las plantas se enjuagan con agua destilada y se mantienen en el invernadero.
La inoculación mecánica se usa tanto para los bioensayos de TSWV como INSV, y para la multiplicación de TSWV e INSV. Mantener la virulencia de estos patógenos para la inoculación es importante para la eficacia del bioensayo. Tanto para TSWV como INSV, el método que se usó para la multiplicación del virus está adaptado de Marchoux y otros 2008 (Virus des Solanacées. Du génome viral a la protection des cultures. Versalles (FRA): Editions Quae; Syntheses. 2008: 615-624). El virus se multiplica por inoculación mecánica con una cepa de TSWV o INSV de tipo silvestre recolectada de lechugas infectadas con TSWV o INSV en el campo. La multiplicación viral de TSWV se realiza, preferiblemente en plantas de N. benthamiana y dos cultivares de lechuga diferentes, cada 7 a 12 días, más preferiblemente cada 10 días, mientras que la multiplicación de INSV se realiza, preferiblemente en plantas de N. benthamiana y dos cultivares de lechuga diferentes, preferiblemente cada 6 días. Las plantas en las cuales se va a mantener el virus se inoculan mecánicamente como se describe para el bioensayo. La agresividad del inóculo viral se prueba regularmente mediante el uso de controles susceptibles conocidos. Si el inóculo muestra una agresividad reducida (es decir, síntomas reducidos o nulos) en los controles susceptibles, entonces una nueva cepa silvestre de TSWV o cepa silvestre de INSV del campo se multiplica y se mantiene para cada bioensayo respectivamente.
En la ausencia de marcadores moleculares o en el caso de que se haya producido una recombinación entre los marcadores moleculares y el determinante genético y estos ya no sean predictivos, la equivalencia de los determinantes genéticos aún puede determinarse mediante una prueba de alelismo. Para realizar una prueba de alelismo, el material que es homocigoto para el determinante conocido, una planta de prueba, se cruza con material que es homocigoto para el determinante genético que se va a probar. Esta última planta se conoce como planta donante. La planta donante que se va a probar debe ser o debe hacerse homocigótica para el determinante genético que se va a probar. El experto en la técnica sabe cómo obtener una planta que sea homocigótica para el determinante genético que se va a probar. Cuando en la F2 del cruce entre una planta donante y una planta de prueba, no se observa segregación para el fenotipo que se relaciona con el determinante genético, se ha comprobado que los determinantes genéticos de la planta donante y la planta de prueba son equivalentes o iguales. La invención también se refiere a una planta de lechuga que comprende un determinante genético que confiere resistencia a TSWV y/o INSV, en donde las plantas de la progenie de primera generación (F1) de un cruce de dicha planta con una planta de prueba, que comprende el dicho determinante genético y cuya semilla representativa se depositó en la NCIMB con el número de acceso NCIMB 42023, o una planta progenie de la misma que comprende dicho determinante genético, o una planta derivada del mismo y que comprende el dicho determinante genético, muestran una segregación de 1:0 para la resistencia a TSWV y/o INSV. Tanto en la planta de prueba como la planta de la invención, el determinante genético está presente en forma homocigótica. Las plantas de la segunda y generaciones adicionales, si se obtienen por autofecundación, también muestran una segregación de 1:0 para dicho patrón de resistencia. La planta de prueba puede ser una planta cuya semilla representativa se haya depositado en la NCIMB con el número de acceso NCIMB 42023.
La planta de lechuga de la invención puede ser una cualquiera de los tipos de lechuga cultivada del siguiente grupo: iceberg o crisphead, butterhead, lechuga romana o cos, hoja verde, hoja roja, lollo, hoja de roble, rizada, hoja incisa, multihoja, corte, tallo, Batavia, y lechuga latina.
En otra modalidad, la invención se refiere a semillas que comprenden el dicho determinante genético que confiere resistencia a TSWV y/o INSV. Una planta cultivada a partir de semillas es resistente contra TSWV y/o INSV cuando el determinante genético está presente en el estado homocigoto.
La invención se refiere adicionalmente a semillas que comprenden dicho determinante genético y cuyas semillas son capaces de cultivarse en plantas que son resistentes contra TSWV y/o INSV.
La invención también se refiere a la progenie de las plantas, células, tejidos, y semillas de la invención. Tal progenie puede ser en sí misma plantas, células, tejidos, o semillas.
El término "progenie" que se usa en la presente descripción pretende significar el primer y todos los descendientes posteriores de un cruce con una planta de la invención que comprende dicho determinante genético. "Progenie" también incluye plantas que portan el rasgo de la invención y se obtienen de otras plantas o progenie de plantas de la invención por propagación o multiplicación vegetativa.
Por lo tanto, en una modalidad, la invención se refiere a la progenie de una planta de lechuga que comprende el determinante genético de la invención.
En una modalidad adicional, la invención se refiere a la progenie de plantas de lechuga de la invención que son resistentes contra TSWV y/o INSV. Estas plantas de progenie comprenden, por lo tanto, el determinante genético que confiere resistencia a TSWV y/o INSV, preferiblemente en forma homocigótica.
De acuerdo con un aspecto adicional de la misma, la invención se refiere a material de propagación capaz de cultivarse en una planta de la invención.
En una modalidad, tal material de propagación se forma por una semilla de la planta de lechuga de la invención, en donde la planta que puede cultivarse a partir de la semilla comprende un determinante genético de la invención. En una modalidad adicional, el material de propagación capaz de cultivarse en una planta de la invención se selecciona del grupo que consiste en microesporas, polen, ovarios, óvulos, embriones, sacos embrionarios, células embrionarias, esquejes, raíces, puntas de las raíces, hipocótilos, cotiledones, tallos, hojas, flores, anteras, semillas, células meristemáticas, protoplastos, y células.
En una modalidad adicional, la invención se refiere al cultivo de tejidos de material de propagación capaz de cultivarse en una planta de la invención.
En otra modalidad, la planta que se produce a partir del material de propagación comprende el determinante genético que se encuentra en el genoma de las plantas de lechuga cultivadas a partir de semillas, y cuya semilla representativa se depositó con el número de acceso NCIMB 42023.
La lechuga destinada a la industria fresca y procesadora y, por lo tanto, al consumo humano, necesita estar libre de enfermedades. Además, los síntomas de la enfermedad que causa la infección por TSWV y/o INSV pueden dar lugar a una reducción significativa tanto del rendimiento como de la calidad de la lechuga que se cosecha, ya que las plantas infectadas que sobreviven hasta la cosecha no son usualmente comercializables. Los brotes de TSWV e INSV son notoriamente difíciles de manejar. Las medidas de control de enfermedades y plagas dirigidas al vector trips de TSWV e INSV (por ejemplo, insecticidas; por ejemplo, medidas de saneamiento) pueden aumentar significativamente el costo de producción de lechuga, y este costo también se traduce en el producto final cosechado o procesado. Por lo tanto, es de gran relevancia para la industria fresca y procesadora cultivar y cosechar plantas de lechuga que sean resistentes a TSWV y/o INSV, ya que estas plantas resistentes darán más altos rendimientos y un producto de mejor calidad en comparación con las mismas plantas de lechuga que carecen de la(s) resistencia(s) antes mencionada(s).
La parte cosechada de la planta de lechuga comprende el determinante genético que confiere resistencia a TSWV y/o INSV.
También se describe en la presente descripción un producto alimenticio que comprende una o más partes cosechadas de una planta de lechuga que comprende el determinante genético que confiere resistencia a TSWv y/o INSV. La parte cosechada o producto alimenticio puede ser, o comprender, la cabeza y/o las hojas de lechuga de una planta de lechuga. Un producto alimenticio preferido que comprende partes de la planta de lechuga de la invención es una ensalada, en donde las hojas de lechuga se pueden mezclar opcionalmente con otras hojas de, por ejemplo, espinaca, escarola, achicoria, remolacha, acelga, etc.
El producto alimenticio o la parte cosechada puede haber pasado por uno o más pasos de procesamiento. Tal paso de procesamiento podría comprender, pero no se limita a, uno cualquiera de los siguientes tratamientos o combinaciones de los mismos: cortar, lavar, asar, sofreír, o una mezcla de ensalada que comprenda hojas de la planta de lechuga de la invención.
La lechuga procesada también se puede usar en otro producto alimenticio, tal como una sopa, un sándwich, etc. Tales productos alimenticios pueden estar preenvasados y destinados a la venta en un supermercado.
Además, se describe una molécula de ácido nucleico, la cual es causante de resistencia a TSWV y/o INSV. Dicha molécula de ADN comprende una secuencia de ADN, la cual está ligada al marcador TSWV-00001 que se posiciona en el grupo de ligamiento 2. La molécula de ácido nucleico también es parte de esta invención.
En un aspecto, la molécula de ácido nucleico, la cual causa la resistencia a TSWV y/o INSV se encuentra entre los marcadores TSWV-00001 (SEQ ID NO: 1) y TSWV-00002 (SEQ ID NO: 2).
Otro aspecto más de la invención se refiere al uso de marcadores para identificar plantas, las cuales son resistentes contra TSWV y/o INSV, y/o portan el determinante genético que confiere resistencia a TSWV y/o INSV.
Por lo tanto, en una modalidad, la invención se refiere al uso del marcador TSWV-00001 (SEQ ID NO: 1) para identificar plantas resistentes contra TSWV y/o INSV, y/o que portan el determinante genético que confiere resistencia a TSWV y/o INSV.
El experto en la técnica sabe cómo desarrollar nuevos marcadores ligados a un rasgo mediante el uso de marcadores, QTLS, alelos, genes u otras moléculas de ADN ya conocidos que estén asociados con un determinado rasgo.
Por lo tanto, la invención también se refiere al uso del marcador TSWV-00001 (SEQ ID NO: 1) para desarrollar otros marcadores ligados al determinante genético que confiere resistencia a TSWV y/o INSV.
En un aspecto la invención se refiere a un proceso para producir plantas de lechuga que comprende un determinante genético que confiere resistencia a TSWV y/o INSv , que comprende el paso de seleccionar dichas plantas de lechuga de una población de plantas de lechuga segregadas para dicho determinante genético mediante el uso del marcador TSWV-00001 (SEQ ID NO: 1).
El término "determinante genético", como se usa en la presente descripción, abarca uno o más QTL, genes, o alelos. Estos términos se usan indistintamente. Alternativamente, un determinante genético puede identificarse por la posición en un mapa genético, o por indicación de la ubicación en un grupo de ligamiento o cromosoma. Cuando un determinante genético ya no está ligado a un marcador molecular específico, pero su posición en un cromosoma tal como se define en un mapa genético no se altera, este determinante genético todavía es el mismo que cuando estaba ligado al marcador molecular. Por lo tanto, el rasgo genético que confiere todavía es el mismo.
La invención se refiere adicionalmente a una célula de una planta de lechuga de la invención, cuya célula comprende un determinante genético que da lugar a la resistencia a TSWV y/o INSV, en donde dicho determinante genético está presente en una planta de lechuga, cuyas semillas representativas se depositaron con el número de acceso NCIMB 42023. Por lo tanto, dicha célula comprende la información genética que codifica dicha resistencia a TSWV y/o INSV, en particular la información genética, la cual es sustancialmente idéntica, preferiblemente completamente idéntica a la información genética que codifica dicha resistencia a TSWV y/o INSV, cuyas semillas representativas se depositaron con el número de acceso NCIMB 42023. Preferiblemente, la célula de la invención es parte de una planta o parte de una planta, pero la célula también puede estar en forma aislada.
La invención también se refiere a una célula de una planta de lechuga de la invención, cuya célula comprende un determinante genético, el cual da lugar a la resistencia a TSWV y/o INSV, y cuya planta se obtiene al transferir dicha resistencia, como se encuentra en semillas de las cuales una muestra representativa se depositó con el número de acceso NCIMB 42023 en una planta de lechuga de valiosa agronómicamente.
La invención se refiere adicionalmente a semillas de la planta de lechuga de la invención, cuyas semillas contienen en su genoma la información genética que codifica la resistencia a TSWV y/o INSV.
También se describe en la presente descripción el uso de semillas de las cuales se depositó una muestra representativa con el número de acceso NCIMB 42023 para transferir la resistencia a TSWV y/o INSV a otra planta de lechuga valiosa agronómicamente.
La planta de lechuga de la invención que exhibe resistencia a TSWV y/o INSV debido a la presencia, en el genoma de la planta, de dicha resistencia encontrada en semillas de las cuales se depositó una muestra representativa con el número de acceso NCIMB 42023, se puede usar como cultivo.
La planta de lechuga de la invención que exhibe resistencia a TSWV y/o INSV debido a la presencia, en el genoma de la planta, de dicha resistencia encontrada en semillas de las cuales se depositó una muestra representativa con el número de acceso NCIMB 42023, se puede usar como una fuente de semilla.
La planta de lechuga de la invención que exhibe resistencia a TSWV y/o INSV debido a la presencia, en el genoma de la planta, de dicha resistencia encontrada en semillas de las cuales se depositó una muestra representativa con el número de acceso NCIMB 42023, se puede usar como una fuente de material de propagación.
La planta de lechuga de la invención que exhibe resistencia a TSWV y/o INSV debido a la presencia, en el genoma de la planta, de dicha resistencia encontrada en semillas de las cuales se depositó una muestra representativa con el número de acceso NCIMB 42023, se puede usar para el consumo.
Un método para producir una planta de lechuga resistente al TSWV y/o INSV, puede comprender:
a) cruzar una planta que comprende un determinante genético que conduce a la resistencia a TSWV y/o INSV con otra planta;
b) autofecundar el F1 resultante para obtener plantas F2;
c) seleccionar plantas resistentes contra TSWV y/o INSV en el F2;
d) opcionalmente realizar una o más rondas adicionales de autofecundación o cruce y, posteriormente, seleccionar una planta que comprenda el rasgo.
La palabra "rasgo" en el contexto de esta solicitud se refiere al fenotipo de la planta. En particular, la palabra "rasgo" se refiere al rasgo de la invención, más en particular a la resistencia a TSWV y/o INSV. El término "determinante genético" se usa para la información genética en el genoma de la planta que causa el rasgo de la invención. Cuando una planta muestra el rasgo de la invención, su genoma comprende el determinante genético que causa el rasgo de la invención. Por lo tanto, la planta tiene el determinante genético de la invención.
Está claro que el progenitor que proporciona el rasgo de la invención no es necesariamente una planta cultivada directamente a partir de las semillas depositadas. El progenitor también puede ser una planta progenie a partir de la semilla o una planta progenie a partir de semillas que se identifican que tienen el rasgo de la invención por otros medios.
Otro método para producir una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV, puede comprender:
a) cruzar una planta que comprende un determinante genético que conduce a la resistencia a TSWV y/o INSV con otra planta;
b) opcionalmente retrocruzar el F1 resultante con el progenitor preferido;
c) seleccionar plantas resistentes contra TSWV y/o INSV en el F2;
d) realizar opcionalmente una o más rondas adicionales de autofecundación o cruce, y posteriormente seleccionar una planta que comprenda dicha resistencia a TSWV y/o INSV.
También se describe un método para introducir otro rasgo deseado en una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV, que comprende:
a) cruzar una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV, cuyas semillas representativas se depositaron con el número de depósito NCIMB 42023, con una segunda planta de lechuga que comprende un rasgo deseado para producir la progenie F1;
b) seleccionar una progenie F1 que comprenda dicha resistencia a TSWV y/o INSV y el rasgo deseado;
c) cruzar la progenie F1 seleccionada con cualquiera de los progenitores, para producir una progenie de retrocruce;
d) seleccionar la progenie de retrocruce que comprenda el rasgo deseado y la resistencia a TSWV y/o INSV; y e) opcionalmente repetir los pasos c) y d) una o más veces en sucesión para producir una cuarta o más alta progenie de retrocruce seleccionada que comprenda el rasgo deseado y la resistencia a TSWV y/o INSV. La invención incluye una planta de lechuga producida por este método.
La selección de plantas resistentes contra TSWV y/o INSV se realiza, por ejemplo, en la F1 o en cualquier generación adicional mediante el uso del marcador TSWV-00001 (SEQ ID NO: 1). En otro aspecto, la selección del rasgo de la invención se inicia en el F2 de un cruce o alternativamente de un retrocruce. La selección de plantas en el F2 se puede hacer fenotípicamente así como mediante el uso de dicho(s) marcador(es), los cuales detectan directa o indirectamente el determinante genético subyacente al rasgo.
La selección de plantas resistentes contra TSWV y/o INSV también puede iniciarse en la F3 o una generación posterior.
En una modalidad, la planta que comprende el determinante genético es una planta de una línea endogámica, un híbrido, un haploide doble, o de una población de segregación.
La invención proporciona adicionalmente un método para la producción de una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV mediante el uso de una técnica de generación de haploides dobles para generar una línea haploide doble que comprenda dicha resistencia.
La invención además se refiere a semillas híbridas que se pueden cultivar en una planta que tiene resistencia a TSWV y/o INSV y también se describe en la presente descripción un método para producir tal semilla híbrida que comprende cruzar una primera planta progenitora con una segunda planta progenitora y cosechar la semilla híbrida resultante, en donde dicha primera planta progenitora y/o dicha segunda planta progenitora es la planta como se reivindica.
Un método para producir una planta de lechuga híbrida que sea resistente contra TSWV y/o INSV, puede comprender cruzar una primera planta de lechuga progenitora con una segunda planta de lechuga progenitora, y cosechar la semilla híbrida resultante, de la cual la primera planta progenitora y/o la segunda planta progenitora es resistente contra TSWV y/o INSV, y cultivar dichas semillas híbridas en plantas híbridas resistentes a TSWV y/o INSV.
La invención también se refiere a un método para la producción de una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV mediante el uso de una semilla que comprende un determinante genético en su genoma que da lugar a la resistencia al TSWV y/o INSV para el cultivo de dicha planta de lechuga. Las semillas son adecuadamente semillas de las cuales se depositó una muestra representativa en la NCIMB con el número de depósito NCIMB 42023.
Además, se describe un método para la producción de semillas que comprende cultivar plantas de lechuga a partir de semillas de las cuales se depositó una muestra representativa en la NCIMB con el número de depósito NCIMB 42023, al permitir que las plantas produzcan semillas, y recolectar estas semillas. La producción de semillas se realiza adecuadamente mediante cruce o autofecundación.
En una modalidad, la invención se refiere a un método para la producción de una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV mediante el uso de cultivo de tejidos.
La invención se refiere adicionalmente a un método para la producción de una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV mediante el uso de reproducción vegetativa.
En una modalidad, la invención se refiere a un método para la producción de una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV mediante el uso de un método de modificación genética para introducir la dicha resistencia en la planta de lechuga. La modificación genética comprende la modificación transgénica o transgénesis, mediante el uso de un gen de una especie no cruzable o un gen sintético, y la modificación cisgénica o cisgénesis, mediante el uso de un gen natural, que codifica un rasgo (agrícola), de la planta de cultivo en sí o de una planta donante sexualmente compatible.
En la presente descripción se describe un método de cultivo para el desarrollo de plantas de lechuga que sean resistentes contra TSWV y/o INSV en donde se usa germoplasma que comprende dicha resistencia. La semilla representativa de dicha planta que comprende el determinante genético y que es representativa del germoplasma se depositó en la NCIMB con el número de depósito NCIMB 42023.
Además, se describe un método para la producción de una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV en donde la progenie o material de propagación de una planta que comprende el determinante genético que confiere dicha resistencia se usa como una fuente para introgresar dicha resistencia en otra planta de lechuga. La semilla representativa de dicha planta que comprende el determinante genético se depositó en la NCIMB con el número de depósito NCIMB 42023.
La invención proporciona preferiblemente una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV, cuya planta es obtenible mediante cualquiera de los métodos que se describen en la presente descripción y/o familiar para el experto en la técnica.
La invención proporciona adicionalmente un método para seleccionar una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV, cuyo método que comprende examinar plantas para las resistencia(s) antes mencionada(s) como se describe en la presente descripción.
El determinante genético que confiere resistencia al TSWV y/o INSV puede ser para producir una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV, cuyo determinante genético está presente en el genoma de las plantas de las cuales se depositó una muestra representativa en la NCIMB bajo el número de depósito NCIMB 42023.
Depósitos
Las semillas representativas de Lactuca sativa que contienen el determinante genético de la invención, el cual confiere resistencia a TSWV y/o INSV se depositaron con el número de acceso NCIMB 42023 el 9 de agosto de 2012 con NCIMB Ltd. (Edificio Ferguson, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA). Todas las semillas del depósito comprenden el determinante genético homocigóticamente. Las plantas que se cultivan a partir de estas semillas son, por lo tanto, altamente resistentes contra TSWV y/o INSV.
Las semillas depositadas no cumplen los criterios DUS, los cuales se requieren para obtener la protección de las variedades de plantas y, por lo tanto, no pueden considerarse una invención de planta.
La presente invención se aclarará en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son solo para fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes de la presente invención de ninguna manera.
Datos de secuencia
Tabla 1
Figure imgf000009_0001
Ejemplos
Ejemplo 1
Bioensayo para TSWVy/o INSV
Para probar si una planta es resistente contra TSWV y/o INSV, se realizó un bioensayo. El bioensayo de TSWV y/o INSV se puede realizar como se describe en la presente descripción.
Las semillas se sembraron en cubos de turba en el invernadero. Las plantas se cultivaron durante 2 semanas a una temperatura de 22 °C-28 °C. Se evaluó un número relevante de plantas por línea, por ejemplo, 14 plantas, de manera que se pudiera observar la segregación si estuviera presente. Las plantas jóvenes se inocularon con un inóculo de TSWV en la etapa de crecimiento 3 o 4. Para TSWV, las plantas se puntuaron para la infección 14 días después de la infección y 21 días después de la infección.
Como plantas altamente resistentes de esta invención, se usaron para el bioensayo plantas cultivadas a partir de semillas de Lactuca sativa, de las cuales se depositó una muestra representativa con el número de acceso NCIMB 42023. En este bioensayo también se usaron plantas de la variedad "Fabietto" y "Bambi" como plantas de control susceptibles.
Cada planta se puntuó por la cantidad de síntomas de TSWV, con base en la escala explicada en la Tabla 2. El experto en la técnica no está obligado a usar esta escala, pero también puede usar una escala con otra subdivisión siempre que la puntuación se realice en la misma etapa de crecimiento de la planta. Esto no influirá en los resultados finales del examen.
Las puntuaciones del bioensayo de TSWV se resumen en la Tabla 3. Está claro a partir de los resultados del bioensayo que todas las plantas de la invención son resistentes al TSWV.
Tabla 2
Figure imgf000009_0002
Tabla 3
Figure imgf000010_0001
Las plantas que se puntuaron como resistentes al TSWV también se probaron para determinar su resistencia al INSV mediante el uso de un método de prueba de bioensayo similar. Para INSV, las plantas se puntuaron para la infección a los 18, 24 y 30 días después de la infección.
La misma escala de puntuación que se describe en la Tabla 2 también se empleó para la prueba INSV.
Las puntuaciones del bioensayo INSV se resumen en la Tabla 4. Está claro a partir de los resultados del bioensayo que todas las plantas de la invención son resistentes al TSWV y/o al INSV.
Tabla 4
Figure imgf000010_0002
Adicionalmente, se usaron pruebas ImmunoStrip (Agdia Inc., Elkhart, Indiana, Estados Unidos, 46514) para TSWV e INSV para confirmar que aquellas plantas que se puntuaron como asintomáticas o resistentes en los bioensayos, también previnieron la multiplicación viral o la acumulación de partículas de virus, tras la inoculación del virus de la planta. La prueba ImmunoStrip se realizó, según las instrucciones del fabricante, en hojas jóvenes de plantas inoculadas con TSWV o INSV que se cultivaron a partir de semillas de Lactuca sativa, de las cuales se depositó una muestra representativa con el número de acceso NCIMB 42023. La prueba ImmunoStrip también se realizó en plantas de las variedades de lechuga "Fabietto" y "Bambi" que fueron inoculadas con TSWV o INSV.
La interpretación de los resultados de la prueba ImmunoStrip se detalla en la "User Guide: Agdia ImmunoStrip Test". Una puntuación positiva indica la presencia del virus que se prueba, mientras que una puntuación negativa indica la ausencia del virus que se prueba. Además, una puntuación negativa indica que el título viral es comparable al de una planta no infectada por virus.
Las puntuaciones de la prueba ImmunoStrip para TSWV e INSV se resumen en la Tabla 5. Los resultados indican que se previene la multiplicación o acumulación viral en plantas de la invención que comprenden un determinante genético, el cual confiere resistencia a TSWV y/o INSV.
Tabla 5
Figure imgf000010_0003
Ejemplo 2
Introgresarresistencia TSWVy/o INSVen un fondo susceptible
Las plantas F1 de la invención se probaron en un bioensayo como se describe en el Ejemplo 1. No se observaron plantas altamente resistentes a TSWV y/o INSV.
A partir de la población F1, se autocultivó una planta para obtener una población de semillas F2. Se cultivaron setenta y ocho plantas F2 elegidas al azar a partir de estas semillas y se autofertilizaron. Las líneas F3 se probaron en un bioensayo como se describe en el Ejemplo 1. Las puntuaciones de resistencia se resumen en la Tabla 6. La segregación de la población F2 demuestra que la herencia de la resistencia de la invención es comparable a la de un rasgo monogénico (susceptible:heterocigoto:resistente = 1:2:1).
Tabla 6
Figure imgf000011_0001
Ejemplo 3
Cultivo para resistencia a TSWV y/o resistencia a INSV
Una planta de la invención 08D. 121730 que se cultivó a partir de una semilla de la cual se depositó una muestra representativa con el número de acceso NCIMB 42023, y la cual era resistente a TSWV y/o INSV de acuerdo con el bioensayo como se describe en el Ejemplo 1, se cruzó con una planta de lechuga susceptible a TSWV e INSV 08D.841822.
De la población F1 se seleccionó una planta 09D.120395 y se autofecundó para obtener una población de plantas F2. Se probó la resistencia de F2 a TSWV e INSV de acuerdo con el bioensayo como se describe en el Ejemplo 1. La segregación de la población F2 demostró que la herencia de la resistencia de la invención era consistente con la de un rasgo monogénico y, además, los datos de segregación confirmaron la herencia de la resistencia al TSWV y al INSV de la planta cruzada 08D.121730.
De la población F2 se seleccionó una planta resistente al TSWV 10D.20479 y se autofecundó para obtener una población de plantas F3. El F3 se probó para determinar la resistencia al TSWV y al INSV de acuerdo con el bioensayo como se describe en el Ejemplo 1.
De nuevo, la segregación de la población F3 demostró que la resistencia de la invención era consistente con la de un rasgo monogénico.
Finalmente, de la población F3 se seleccionó una planta resistente a TSWV y/o INSV 11D.231349 y se autofecundó para obtener una población de plantas F4. El F4 se probó para determinar la resistencia al TSWv y al INSV de acuerdo con el bioensayo como se describe en el Ejemplo 1.
La población F4 no mostró segregación de la resistencia de la invención. Esto demostró que la semilla F4 era de hecho homocigótica y uniforme para el determinante genético que confiere resistencia a TSWv y/o INSV.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Una planta de lechuga (Lactuca sativa L.) que comprende un determinante genético, el cual cuando está presente homocigóticamente confiere resistencia al virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV) y/o al virus de la mancha necrótica de impatiens (INSV), y el cual se encuentra o es obtenible de las plantas cultivadas a partir de semillas de las cuales se depositó una muestra representativa con el número de acceso NCIMB 42023, dicho determinante genético en las semillas del depósito NCIMB 42023 se ubica en el grupo de ligamiento 2 y se encuentra ligado al marcador TSWV-00001 (SEQ ID NO: 1).
2. Una planta de lechuga como se reivindica en la reivindicación 1, la cual es homocigótica para el determinante genético y resistente contra TSWV y/o INSV.
3. La semilla que comprende el determinante genético como se define en la reivindicación 1.
4. Semilla como se reivindica en la reivindicación 3, en donde la planta que se cultiva a partir de dicha semilla es resistente contra TSWV y/o INSV.
5. Progenie de una planta de lechuga como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, o la progenie de plantas cultivadas a partir de semillas como se reivindica en la reivindicación 3 o 4, en donde la planta progenie comprende el determinante genético como se define en la reivindicación 1.
6. Planta de progenie como se reivindica en la reivindicación 5, en donde la planta de progenie es resistente contra TSWV y/o INSV.
7. Material de propagación que se deriva de una planta como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, en donde el material de propagación comprende el determinante genético como se define en la reivindicación 1.
8. Material de propagación capaz de cultivarse en una planta como se reivindica en la reivindicación 1 o 2.
9. Material de propagación como se reivindica en la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde el material de propagación se selecciona del grupo que consiste en microesporas, polen, ovarios, óvulos, embriones, sacos embrionarios, óvulos, esquejes, raíces, puntas de raíces, hipocótilos, cotiledones, tallos, hojas, flores, anteras, semillas, células meristemáticas, protoplastos y células.
10. Cultivo de tejidos de material de propagación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
11. Uso del marcador como se define en la reivindicación 1 para identificar plantas resistentes al TSWV y/o INSV, o desarrollar otros marcadores ligados al determinante genético como se define en la reivindicación 1.
12. Método para la producción de una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV, mediante el uso de una técnica de generación de haploides dobles para generar una línea haploide doble que comprende el determinante genético como se define en la reivindicación 1 a partir de la planta como se reivindica en la reivindicación 1 o 2.
13. Método para la producción de una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV, mediante el uso de cultivo de tejidos en una planta como se reivindica en la reivindicación 1 o 2.
14. Método para la producción de una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV, mediante el uso de reproducción vegetativa de la planta como se reivindica en la reivindicación 1 o 2.
15. Método para la producción de una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV, mediante el uso de una semilla que comprende el determinante genético como se define en la reivindicación 1 en su genoma que da lugar a la resistencia a TSWV y/o INSV para el cultivo de dicha planta de lechuga.
16. Método como se reivindica en la reivindicación 15, en donde la semilla es semilla de la cual se depositó una muestra representativa en la NCIMB con el número de depósito NCIMB 42023.
17. Método para seleccionar una planta de lechuga resistente contra TSWV y/o INSV, cuyo método comprende examinar plantas para el determinante genético como se define en la reivindicación 1.
18. Método como se reivindica en la reivindicación 17, en donde el examen se realiza mediante el uso del marcador TSWV-00001 (SEQ ID NO: 1).
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