CN104066436A

CN104066436A - 使用非糖基化载脂蛋白a-iv治疗糖尿病的方法

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Publication number: CN104066436A
Application number: CN201280067554.2A
Authority: CN
Inventors: P·卓; F·王; S·达维德森
Original assignee: University of Cincinnati
Current assignee: University of Cincinnati
Priority date: 2012-01-19
Filing date: 2012-11-21
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2032-11-21
Also published as: US9951120B2; MX357071B; IL233351A; MX2014008829A; US20150011469A1; JP2015506942A; WO2013109342A1; EA028230B1; CA2860782A1; KR20140117565A; EA201491369A1; HK1203823A1; JP6310398B2; WO2013109342A8; CN104066436B; AU2012366182A1; EP2804618B1; AU2012366182A8; AU2012366182B2; BR112014017141A2

Abstract

本发明公开了治疗需要的受试者的2型糖尿病的方法和用于治疗2型糖尿病的药物组合物，其中本发明的方法和组合物是基于使用由蛋白质表达系统如细胞表达系统产生的非糖基化载脂蛋白A-IV。还公开了基于施用由蛋白质表达系统产生的非糖基化载脂蛋白A-IV基本上恢复需要的受试者的葡萄糖耐量到正常水平的方法和降低需要的受试者的血糖水平的方法。

Description

使用非糖基化载脂蛋白A-IV治疗糖尿病的方法

技术领域

本公开涉及使用非糖基化载脂蛋白A-IV(apoA-IV)治疗糖尿病的方法。更特别地，本公开涉及通过施用有效量的由蛋白质表达系统产生的非糖基化apoA-IV治疗糖尿病的方法。

相关申请

本申请要求2012年1月19日提交的PCT申请No.PCT/US2012/021802的优先权。本申请还要求2012年7月25日提交的美国临时专利申请No.61/675692的优先权。该优先权申请的全部内容通过引用全文并入本文中。

背景技术

糖尿病的发生是分布广泛的，美国大约有8％的人群患有糖尿病。糖尿病是一种特征在于由于身体不能有效产生和/或利用胰岛素而引起的高血糖的慢性疾病。糖尿病可以导致多种身体并发症，包括但不限于，肾衰竭、失明、神经损伤、心脏病、睡眠窒息和乳糜泻病。例如，在美国，糖尿病是肾衰竭、失明、截肢、中风和心脏病发作的主要诱因。此外，在美国，糖尿病是死亡的第六大原因，并且已经显示出缩短中年成人的预期寿命约五至十年。

糖尿病的最常见形式是2型糖尿病(也称为“T2DM”或“II型糖尿病”)。2型糖尿病的特征在于高血糖症、胰岛素抵抗、β-细胞功能异常和失调的肝糖原生成。患有2型糖尿病的人发生了葡萄糖刺激的胰岛素分泌的丧失，这与在胰岛素分泌的第一阶段中从β-细胞释放储存的胰岛素颗粒的受损有关。在胰岛素分泌的第二阶段中，患有2型糖尿病的人发生了响应于葡萄糖刺激而活跃地合成胰岛素的能力的逐渐丧失。

2型糖尿病的发病率正在上升，并且在2002年中，2型糖尿病导致超过$1300亿的健康护理费用。因此，需要用于有效治疗2型糖尿病的新疗法。

发明概述

本发明是基于载脂蛋白A-IV(apoA-IV)蛋白质在人体中非糖基化的令人惊异的发现。在本公开之前，本领域中已知apoA-IV蛋白质是糖基化的。Weinberg和Scanu((1983)J of Lipid Res vol.24:52)报告apoA-IV是包含6％重量糖(甘露糖1.8％、半乳糖1.55％、N-乙酰葡糖胺1.55％、唾液酸1.1％)的糖蛋白。如此，apoA-IV通常描述为糖蛋白(参见，例如，Gomaraschi等，(2010)Biochem Biophys Res Commun.393(1):126-30)。相反，如以下实施例13中所描述的，apoA-IV是非糖基化蛋白质。

因此，在一个实施方式中，本发明提供使用非糖基化的(也称作未糖基化的)apoA-IV蛋白质治疗2型糖尿病的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的与apoA-IV蛋白质具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的非糖基化apoA-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段。

在一个实施方式中，非糖基化apoA-IV蛋白质使用缺乏糖基化能力的表达系统产生。例如，细菌表达系统如大肠杆菌可以用于制备非糖基化apoA-IV。

在另一个实施方式中，可以用于制备非糖基化apoA-IV的细胞表达系统包括，但不限于哺乳动物细胞表达系统、酵母表达系统和杆状病毒表达系统。在另一个实施方式中，无细胞表达系统可以用于制备非糖基化apoA-IV蛋白质。

在另一个实施方式中，公开了包含非糖基化apoA-IV蛋白质的药物组合物。该药物组合物包含与apoA-IV蛋白质具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的非糖基化apoA-IV蛋白质或其生物活性片段。药物组合物可以配制用于向受试者施用以治疗2型糖尿病。

在一个实施方式中，本发明提供了包含非糖基化apoA-IV蛋白质的药物组合物，该非糖基化apoA-IV蛋白质包含如SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项所示的氨基酸序列(或与SEQ ID NO:1、3、4或20-64至少90、95、96、97、98或99％相同的序列)或其生物活性片段。在一个实施方式中，本发明提供了包含非糖基化载脂蛋白A-IV蛋白质的药物组合物，该非糖基化载脂蛋白A-IV蛋白质包含如SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项至少95％相同的氨基酸序列或者其生物活性片段。在另一个实施方式中，本发明提供了具有载脂蛋白A-IV蛋白质的药物组合物，该载脂蛋白A-IV蛋白质包含与SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项至少96％相同的氨基酸序列或其生物活性片段。在另一个实施方式中，本发明提供了具有载脂蛋白A-IV蛋白质的药物组合物，该载脂蛋白A-IV蛋白质包含与SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项至少97％相同的氨基酸序列或其生物活性片段。在另一个实施方式中，本发明提供了具有载脂蛋白A-IV蛋白质的药物组合物，该载脂蛋白A-IV蛋白质包含与SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项至少98％相同的氨基酸序列或其生物活性片段。在另一个实施方式中，本发明提供了具有载脂蛋白A-IV蛋白质的药物组合物，该载脂蛋白A-IV蛋白质包含与SEQ IDNO:1、3、4或20-64任一项至少90％相同的氨基酸序列或其生物活性片段。

在一个实施方式中，药物组合物包含药学上可接受的载体或稀释剂。

在另一个实施方式中，药物组合物选自液体制剂、含水制剂和冻干制剂。

在一个实施方式中，本发明提供了治疗2型糖尿病的方法，包括向患有2型糖尿病的受试者施用非糖基化apoA-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段，其具有包含如SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项所示的氨基酸序列(或与SEQ ID NO:1、3、4或20-64至少90、95、96、97、98或99％相同的序列)的氨基酸序列。在进一步的实施方式中，apoA-IV蛋白质使用原核生物表达系统产生，例如细胞表达系统如大肠杆菌。

在又另一个实施方式中，公开了用于基本上恢复需要的受试者的葡萄糖耐量至正常水平的方法。该方法包括向受试者施用有效量的与apoA-IV蛋白质具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的非糖基化apoA-IV或其生物活性类似物或片段，例如，通过系统性施用非糖基化apoA-IV或其生物活性类似物或片段。在一个实施方式中，本发明提供了用于基本上恢复需要的受试者的葡萄糖耐量至正常水平的方法，所述方法包括施用有效量的非糖基化apoA-IV蛋白质(或其生物活性类似物或片段)，其具有如SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项所示的氨基酸序列(或与SEQ ID NO:1、3、4或20-64至少90、95、96、97、98或99％相同的氨基酸序列)。

在又另一个实施方式中，公开了用于降低受试者的血糖水平的方法。该方法包括向受试者施用有效量的非糖基化apoA-IV或与非糖基化apoA-IV具有至少90、95、96、97、98或99％同一性的其生物活性类似物或片段，例如，通过系统性施用。在一个实施方式中，本发明提供了降低需要的受试者的血糖水平的方法，该方法包括向受试者施用有效量的非糖基化apoA-IV(或其生物活性类似物或片段)，其包含SEQID NO:1、3、4或20-64所示的氨基酸序列(或与SEQ ID NO:1、3、4或20-64至少90、95、96、97、98或99％相同的序列)。

“有效量”如下面描述且可以包括约0.25-2μg/g的apoA-IV或其生物活性类似物。在一个实施方式中，有效量是约0.1mg/kg-25mg/kg。在另一个实施方式中，有效量是约1-1000mg的固定剂量。在进一步的实施方式中，有效量是约1-10mg的固定剂量。

参照本文中提供的附图、详述和权利要求，根据本发明的这些和其他各种实施方式的这些和其他特征以及优势将变得更清楚。

附图简要说明

当结合以下附图阅读时，可以更好地理解以下本发明实施方案的详述，附图中相似的结构用相似的附图标记表示，且其中：

图1是根据本发明实施方式的具有药物组合物储器和注射器的装置的侧透视图。

图2是用于腹膜内葡萄糖耐受测试的载脂蛋白A-IV敲除的和野生型雄性小鼠中血浆葡萄糖(mg/dL)相对于时间(min)的曲线图。

图3是16个月大的载脂蛋白A-IV野生型和敲除动物中腹膜内葡萄糖耐受测试的血浆葡萄糖(mg/dL)相对于时间(min)的曲线图。

图4是用于腹膜内葡萄糖耐受测试的腹膜内施用重组载脂蛋白A-IV(μg/g)或盐水溶液后载脂蛋白A-IV敲除雄性小鼠中血浆葡萄糖(mg/dL)相对于时间(min)的曲线图。

图5是用于腹膜内葡萄糖耐受测试的腹膜内施用重组载脂蛋白A-I或盐水溶液后载脂蛋白A-IV敲除小鼠中血浆葡萄糖(mg/dL)相对于时间(min)的曲线图。

图6是腹膜内施用重组载脂蛋白A-I或盐水溶液后载脂蛋白A-IV敲除小鼠中胰岛素分泌(ng/mL)相对于时间(min)的曲线图。

图7是用于腹膜内葡萄糖耐受测试的长期进食高脂肪饮食的载脂蛋白A-IV敲除和野生型小鼠中血浆葡萄糖(mg/mL)相对于时间(min)的曲线图。

图8是用于腹膜内葡萄糖耐受测试的腹膜内施用重组小鼠载脂蛋白A-IV(1μg/g)或盐水溶液后长期进食高脂肪饮食的载脂蛋白A-IV敲除小鼠中血浆葡萄糖(mg/mL)相对于时间(min)的曲线图。

图9是用于腹膜内葡萄糖耐受测试的腹膜内施用重组小鼠载脂蛋白A-IV(1μg/g)或盐水溶液后糖尿病小鼠中血浆葡萄糖(mg/dL)相对于时间(h)的曲线图。

图10描绘了载脂蛋白A-IV敲除小鼠、野生型小鼠和载脂蛋白A-I敲除小鼠中血清淀粉样A蛋白成分水平的Western印迹分析的结果。

图11是腹膜内葡萄糖耐受测试(IPGTT)过程中载脂蛋白A-IV敲除和野生型雌性小鼠中血浆葡萄糖(mg/dL)相对于时间(min)的曲线图。

图12是腹膜内葡萄糖耐受测试过程中腹膜内施用1.0μg/g人载脂蛋白A-IV或盐水溶液后野生型小鼠中血浆葡萄糖(mg/dL)相对于时间(min)的曲线图。

图13是腹膜内葡萄糖耐受测试过程中腹膜内施用1.0μg/g重组小鼠载脂蛋白A-IV或盐水溶液后雌性野生型小鼠中血浆葡萄糖(mg/dL)相对于时间(min)的曲线图。

图14是显示出10μg/g人apoA-IV在3mM或20mM葡萄糖存在下对通过30mM KCl和250μM二氮嗪去极化的人胰岛的作用的条形图。

图15是具有全长野生型人载脂蛋白A-IV的氨基酸序列的蛋白(SEQ ID NO.1)。

图16是具有全长野生型小鼠载脂蛋白A-IV的氨基酸序列的蛋白(SEQ ID NO.2)。

图17是具有在N-末端添加甘氨酸的全长野生型人载脂蛋白A-IV的氨基酸序列的蛋白(SEQ ID NO.3)。

图18是具有显示出多态性置换T347S、Q360H和/或E165K以及N-末端任选地添加甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸的人载脂蛋白A-IV的氨基酸序列的蛋白(SEQ ID NO.4)。

图19是编码全长野生型人载脂蛋白A-IV的多核苷酸(SEQ ID NO.5)。

图20包括氨基酸序列和用于在大肠杆菌中周质表达的Omp-ApoA-IV构建体的优化的核苷酸编码序列。

图21包括氨基酸序列和用于在大肠杆菌中周质表达的PelB-ApoA-IV构建体的优化的核苷酸编码序列。

图22包括氨基酸序列和用于在大肠杆菌中周质表达的ENX-ApoA-IV构建体的优化的核苷酸编码序列。

图23包括氨基酸序列和用于在大肠杆菌中周质表达的Apo A-IV构建体的优化的核苷酸编码序列。

图24A和B显示人野生型apoA-IV(图24A)和变体P393H(图24B)的N-糖基化预测结果。

图25A和B显示人野生型apoA-IV(图25A)和变体P393H(图25B)的O-糖基化预测结果。

本领域技术人员应理解图中的元件是为了简单和清楚的目的而图示的，并不一定是按比例绘制的。例如，附图中一些元件的尺寸可能相对于其他元件扩大，以及移除了常规部分，以帮助提高对于本发明的各个实施方式的理解。

详细说明

本申请中使用了以下术语：

如本文中所用的，术语“非糖基化的”或“未糖基化的”意思是在检测极限内没有可观察的N-连接糖基化和/或O-连接糖基化的蛋白质，例如，通过等电聚焦、PNGase F消化和/或MALDI分析检测。在一个实施方式中，术语“非糖基化的”或“未糖基化的”意思是没有可观察的N-连接糖基化和没有可观察的O-连接糖基化。在另一个实施方式中，术语“非糖基化的”或“未糖基化的”意思是没有可观察的N-连接糖基化。在另一个实施方式中，术语“非糖基化的”或“未糖基化的”意思是没有可观察的O-连接糖基化。

如本文中所用的，术语“蛋白质表达系统”是指用于产生目标蛋白(例如apoA-IV)的基于细胞的或非基于细胞的表达系统。既然令人惊异地发现apoA-IV缺乏糖基化，因而缺乏糖基化机制的表达系统可以用于产生用于治疗2型糖尿病的蛋白质。在一个实施方式中，进行糖基化的基于细胞的表达系统如哺乳动物细胞可以用于产生非糖基化的apoA-IV。在一个实施方式中，用于制备apoA-IV的蛋白质表达系统包括细菌表达系统、哺乳动物细胞表达系统、杆状病毒(昆虫)细胞表达系统或酵母表达系统。

如本文中所用的，术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)是指已经用核酸序列转化或能够转化并因而表达目标基因(例如，apoA-IV)的细胞。应当理解，这类术语意图不仅指特定的主体细胞，而且指这种细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后续世代中发生，因此这种后代事实上可能与亲本细胞不同，但仍包括在如本文中所用的术语“宿主细胞”的范围内。宿主细胞可以是能够表达外源核酸序列的原核或真核细胞。宿主细胞的实例包括细菌如大肠杆菌、酵母、植物细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)-293细胞和昆虫细胞。

术语“分离的”在用于指蛋白质时是根据其起源或衍生来源(1)不与在其天然状态下伴随它的天然相关组分关联，(2)基本上不含来自相同物种的其它蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达或(4)在自然界中不存在的蛋白质、多肽或抗体。因此，例如化学合成的或在与其天然起源的细胞不同的细胞系统中合成的多肽将是与其天然相关组分“分离的”。也可以使用任何合适的蛋白质纯化技术通过分离使蛋白质基本上不含天然相关组分。在一个实施方式中，用于本发明的组合物和方法中的apoA IV蛋白质是从重组宿主细胞例如细菌细胞获得的分离的蛋白质。

短语“百分相同”或“百分同一性”是指至少两个不同序列之间的相似性(例如，95％、96％、97％、98％或99％)。这种百分同一性可以通过标准比对算法测定，例如Altshul等((1990)J.Mol.Biol.215:403-10)描述的基础局部比对检索工具(BLAST)、Needleman等((1970)J.Mol.Biol.48:444-53)的算法或Meyers等((1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-17)的算法。一组参数可以例如是Blosum62评分矩阵，具有12的空位罚分，4的空位延伸罚分和5的空位移码罚分。两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分同一性也可以使用采用PAM120权重残差表、12的空位长度罚分和4的空位罚分的Meyers和Miller((1989)CABIOS4:11-17)的算法确定，其已并入ALIGN程序(版本2.0)中。

术语“重组蛋白”是指从重组DNA表达的蛋白质分子。例如，重组ApoA-IV蛋白是在重组宿主细胞中表达的蛋白质。优选地，用于本发明的组合物和方法中的apoA IV蛋白质是重组ApoA-IV蛋白。

如本文中所用的，术语“有效量”描述了实现所需生物效应的必需或足够量。对于任何特定应用的有效量可以根据多种因素而改变，包括但不限于待施用的特定组合物、受试者大小和/或待治疗疾病和/或病症的严重程度。在一个实施方案中，“有效量”是约0.25至10μg/g非糖基化apoA-IV或其生物活性类似物的剂量。或者，非糖基化apoA-IV或其生物活性类似物的“有效量”为约1至10μg/g，约0.25至2μg/g，约1μg/g或0.1mg/kg-25mg/kg。在另一个实施方式中，有效量是约1-1000mg的固定剂量。在进一步的实施方式中，有效量是约1-10mg的固定剂量。

非糖基化apoA-IV或其生物活性类似物每天施用一次。或者，非糖基化apoA-IV或其生物活性类似物每天施用约2次。在再另一个可选方案中，非糖基化apoA-IV或其生物活性类似物一天施用超过两次，例如，每天三次。在再另一个可选的实施方案中，每两天、三天、四天、五天或六天施用一次非糖基化apoA-IV，或每周施用一次。

如本文中所用的，术语“所需的生物效应”描述的是降低疾病或病症的影响、抵消和/或消除疾病或病症。例如，在2型糖尿病的情况中，所需的生物效应包括，但不限于，降低血糖、改善葡萄糖耐量、基本上将葡萄糖耐量恢复至正常水平、改善胰岛素分泌和/或基本上将胰岛素分泌恢复至正常水平。

如本文中所用的，术语“正常水平”描述的是与不需要治疗的受试者中的水平基本上相同的水平。例如，在治疗2型糖尿病的情况中，正常的血糖水平在餐前为约70mg/dL至约130mg/dL，和在餐后约一至两小时低于约180mg/dL，或者餐前约70mg/dL至约100mg/dL，和餐后约一至两小时低于约140mg/dL。在治疗2型糖尿病的情况的另一个实例中，正常的葡萄糖耐量水平描述的是受试者代谢碳水化合物的能力，以使得血糖水平在餐前为约70mg/dL至约130mg/dL并且在餐后约一至两小时低于约180mg/dL，或者在餐前为约70mg/dL至约100mg/dL并且在餐后约一至两小时低于约140mg/dL。在治疗2型糖尿病情况的再另一个实例中，正常的胰岛素分泌水平是维持正常葡萄糖耐量水平所需的量，其中胰岛素分泌的水平在餐后约十五小时高于约1ng/mL。在进一步的实施方式中，血糖的正常水平对于早晨禁食血糖测试是约70mg/dl-100mg/dl。

在血糖水平的情况中，术语“恢复”描述的是改变受试者的血糖水平至正常水平。相似地，在葡萄糖耐量的情况中，术语“恢复”描述的是改变受试者的葡萄糖耐量至正常水平。另外，在胰岛素分泌的情况中，“恢复”描述的是改变受试者的胰岛素分泌至正常水平。

在非糖基化apoA-IV的情况中，术语“生物活性片段”描述了能够在患有2型糖尿病的受试者中实现所需生物效应的非糖基化apoA-IV的片段。术语“生物活性类似物”描述了能够在患有2型糖尿病的受试者中实现所需生物效应的非糖基化apoA-IV的类似物。在一个实例中，所需的生物效应是恢复apoA-IV敲除小鼠中的葡萄糖耐量，如实施例2中所述。所需生物效应的另一个实例是在2型糖尿病的动物模型(如实施例7中所述的小鼠模型)中引起异常血糖水平统计学显著的下降。

如本文中所用的，术语“肥胖”描述的是其中受试者远超过正常体重的状况。在一个特定的实例中，术语肥胖描述了其中受试者比其理想体重超出约20％和/或具有约三十或高于约三十的体重指数的状况。在一个实施方式中，待治疗的受试者是肥胖的；在另一个实施方式中，待治疗的受试者不是肥胖的；并且在再另一个实施方式中，待治疗的受试者具有正常体重。

本发明的实施方式涉及治疗需要的受试者的2型糖尿病的方法和用于治疗2型糖尿病的药物组合物。在一个实施方式中，公开了治疗糖尿病的方法。在一个特定的实施方式中，公开了治疗需要的受试者的2型糖尿病的方法，其中该方法包括将有效量的非糖基化apoA-IV(下文中称为“apoA-IV”)或其生物活性类似物或片段施用于受试者。

在一个实施方式中，治疗2型糖尿病的方法有效地降低受试者的血糖水平。在一个特定的实施方式中，该方法有效地将受试者的血糖水平降低约20至50％。在进一步的实施方式中，该方法有效地将受试者的血糖水平降低约40％。在进一步的实施方式中，该方法有效地将受试者的血糖水平降低约70％。在再进一步的实施方式中，该方法有效地将血糖水平基本上恢复至正常水平。

在一个实施方式中，治疗2型糖尿病的方法导致受试者的较低血糖水平。在一个特定的实施方式中，该方法在给药间隔的过程中有效地将受试者的血糖水平从基线降低约1mg/dl、2mg/dl、3mg/dl、4mg/dl、5mg/dl、6mg/dl、7mg/dl、8mg/dl、9mg/dl、10mg/dl、11mg/dl、12mg/dl、13mg/dl、14mg/dl、15mg/dl、16mg/dl、17mg/dl、18mg/dl、19mg/dl、20mg/dl、40mg/dl、60mg/dl、80mg/dl、100mg/dl、120mg/dl、140mg/dl、160mg/dl、180mg/dl、200mg/dl、220mg/dl或240mg/dl。

在另一个实施方式中，治疗2型糖尿病的方法有效地将受试者的葡萄糖耐量基本上恢复至正常水平。在一个特定的实施方式中，该方法在施用一剂非糖基化apoA-IV或其生物活性类似物后约两小时内有效地将受试者的葡萄糖耐量基本上恢复至正常水平。在另一个实施方式中，该方法在施用一剂非糖基化apoA-IV或其生物活性类似物后约三小时内或约四小时内有效地将受试者的葡萄糖耐量基本上恢复至正常水平。在另一个实施方式中，受试者的葡萄糖耐量基本上恢复至正常水平约八至十二小时的时间。

在再另一个实施方式中，治疗有效地将胰岛素分泌基本上恢复至正常水平。在一个特定的实施方式中，治疗在施用一剂非糖基化apoA-IV或其生物活性类似物或片段后约两小时内有效地将胰岛素分泌基本上恢复至正常水平。在另一个实施方式中，胰岛素分泌基本上恢复至正常水平约八至十二小时的时间。在再另一个实施方式中，治疗有效地降低C-反应性蛋白的水平。

在一个实施方式中，系统性施用非糖基化apoA-IV或其生物活性类似物。非糖基化apoA-IV或其类似物的系统性施用选自口服、皮下、静脉内、肌内和腹膜内施用。

在另一个实施方式中，公开了一种药物组合物。在一个特定的实施方式中，药物组合物包含非糖基化apoA-IV或其生物活性类似物或片段。在另一个实施方式中，非糖基化apoA-IV或其类似物配制用于施用于受试者以治疗2型糖尿病。在该特定的实施方式中，还提供了用于治疗需要的受试者的2型糖尿病的方法，其中该方法包括将有效量的药物组合物施用于受试者。

“载脂蛋白A-IV”指的是哺乳动物apoA-IV，并且包括全长apoA-IV和apoA-IV的生物活性片段。全长人apoA-IV蛋白是376个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO.1)，其氨基酸序列显示于图15中，且其分子量是43.4kDa。全长小鼠apoA-IV蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)显示于图16中。术语“载脂蛋白A-IV”还包括其中甘氨酸被添加至全长人序列的apoA-IV的N-末端的已知类似物(SEQ ID NO.3，如图17中所示)，及其对于N-末端甘氨酸具有保守置换(如，丙氨酸和缬氨酸)的其类似物。“载脂蛋白A-IV”还包括其多态性形式，包括对SEQ IDNO.1表示的人序列的T347A、Q360H或E165K置换或SEQ ID NO.3相应位置的置换。因此，“载脂蛋白A-IV”包括SEQ ID NO.4的蛋白质，如图18中所示。另外，人“载脂蛋白A-IV”包括各具有以下错义突变的变体(SEQ ID NO:20-64)：P393H,Q385K,Q381K,Q380H,Q377P,T367S,S353A,N352Y,V336M,D335H,G311R,V307L,R305C,R304Q,E291G,V274M,V274A,R264Q,A260T,E250K,N235S,Q231K,R220C,Q214H,E207K,T202M,R200C,D191N,D184N,P181L,A172T,R169W,A161S,R154W,T148M,S147N,A139E,N127K,S95L,R90C,T85A,Q77H,G74S,V13M或V6M，如以下表1中所示。SEQ ID NO:20-65包括信号序列。在一个实施方式中，本文中描述的方法和组合物包括SEQ ID NO:20-65中描述的蛋白质的成熟形式。

在一个实施方式中，本文描述的方法和组合物使用包含选自SEQID NO:1、3、4或20-64的氨基酸序列的非糖基化ApoA-IV蛋白质或其生物活性片段。或者，本文描述的方法和组合物使用包含与选自SEQ ID NO:1、3、4或20-64的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的非糖基化ApoA-IV蛋白质或其生物活性片段。

apoA-IV的生物活性类似物与apoA-IV具有至少90、95、96、97、98或99％的同一性。如前一段落中所述的，apoA-IV包括全长哺乳动物apoA-IV(例如，人或哺乳动物)(人apoA-IV描述于SEQ IDNO:1中)、其多态性形式、SEQ ID NO:3和4的蛋白质及前述任一种的生物活性片段。生物活性类似物中的氨基酸变异优选具有相对于野生型序列的保守性置换。“保守性置换”是氨基酸被具有相同净电荷以及大致相同的大小和形状的另一个氨基酸替代。当侧链中的碳和杂原子的总数相差不超过约四个时，具有脂肪族或取代的脂肪族氨基酸侧链的氨基酸残基具有大致相同的大小。当侧链中的分支数相差不超过约一个时，它们具有大致相同的形状。在侧链中具有苯基或取代苯基的氨基酸残基被认为具有大约相同的大小和形状。以下所列的是五组氨基酸。氨基酸残基用相同组中的另一个氨基酸替代形成保守性置换：

组I：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和具有C1-C4脂肪族或C1-C4羟基取代的脂肪族侧链(直链的或单支链的)的非天然产生的氨基酸。

组II：谷氨酸、天冬氨酸和具有羧酸取代的C1-C4脂肪族侧链(未分支的或一个分支点)的非天然产生的氨基酸。

组III：赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸和具有胺或胍取代的C1-C4脂肪族侧链(未分支的或一个分支点)的非天然产生的氨基酸。

组IV：谷氨酰胺、天冬酰胺和具有酰胺取代的C1-C4脂肪族侧链(未分支的或一个分支点)的非天然产生的氨基酸。

组V：苯丙氨酸、苯基甘氨酸、酪氨酸和色氨酸。

apoA-IV或其生物活性类似物优选是未糖基化的。实施例12中描述了重组未糖基化人和小鼠apoA-IV的制备。全长野生型人载脂蛋白(SEQ ID NO.1)的多核苷酸显示为图19中的SEQ ID NO.5。

实施例1-10中使用的apoA-IV是未糖基化的。可以根据分子生物学领域中已知的标准方法来制备非糖基化apoA-IV。例如，可以通过传统分子克隆技术来制备非糖基化apoA-IV。

在一个实施方式中，apoA-IV根据Tubb等(2009)J of Lipid Res50:1497中描述的方法制备，其中作者在细菌表达系统(即大肠杆菌)中表达具有亲和性标签(组氨酸(His)标签)的重组apoA-IV。Tubb等描述了使用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶作为从apoA-IV蛋白切割His标签的工具。因此，apoA-IV蛋白可以使用通过TEV蛋白酶切割的His标签在重组宿主细胞例如大肠杆菌中表达。或者，apoA-IV蛋白可以使用通过TEV蛋白酶切割的谷光甘肽S-转移酶(GST)标签在重组宿主细胞例如大肠杆菌中表达。在一个实施方式中，TEV蛋白酶用于从apoA-IV蛋白切割亲和性标签。

在一个实施方式中，细菌宿主可以用于产生未糖基化apoA-IV。细菌宿主的实例包括，但不限于大肠杆菌BL-21、BL-21(DE3)、BL21-AI^TM、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、BL21Star^TM(DE3)和BL21Star^TM(DE3)pLysS(Invitrogen)。棒状杆菌也可以用作表达apoA-IV的宿主细胞。在转化到细菌宿主中之前，编码ApoA-IV或其类似物的DNA片段可以整合到任何合适的表达载体中以用于转化到细菌宿主中。合适的表达载体包括本领域技术人员各个已知的质粒载体、粘粒载体和噬菌体载体，例如，如Sambrook等,Molecular Cloning Manual,第2版,1989中所述的。表达载体的实例包括pET载体(Invitrogen)、pDEST载体(Invitrogen)、pRSET载体(Invitrogen)和pJexpress载体(DNA2.0Inc.)。在一个实施方式中，大肠杆菌BL-21(DE3)用包含编码ApoA-IV的基因的pET30表达载体转化。

除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是用于apoA-IV编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母或普通的面包酵母是低等真核宿主微生物中最常使用的。但是，多种其它属、种和菌株是通常可得的并可用于本发明中，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母菌属宿主如，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、克鲁雄酵母(K.waltii)(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶罗威亚酵母(EP402,226)；毕赤酵母(EP183,070)；假丝酵母；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌如，例如，脉孢菌属、青霉属、弯颈霉和曲霉属宿主如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

用于表达apoA-IV的合适宿主细胞也可以源自多细胞生物体。无脊柱动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了多种杆状病毒株和变体及来自宿主如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的相应的许可昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株是公开可得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，且这类病毒可以按照本发明用作本文中的病毒，特别地用于草地贪夜蛾细胞的转染。

棉花、玉米、土豆、大豆、牵牛花、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。

用于产生apoA-IV蛋白质的另一种合适的宿主细胞是脊柱动物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括，但不限于通过SV40(COS-7,ATCC CRL1651)转化的猴肾CV1细胞系、人胚肾细胞系(例如，293细胞或经亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK，例如，ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))，包括，但不限于CHO K1、CHO pro3.sup.-、CHO DG44、CHO DUXB11、Lec13、B-Ly1和CHO DP12细胞，优选CHO DUX(DHFR-)或其亚克隆(本文中称为"CHO DUX")、C127细胞、小鼠L细胞、Ltk.sup.-细胞、小鼠sertoli细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))、猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)、非洲青猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HeLa,ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34)、buffalo大鼠肝细胞(BRL3A,ATCC CRL1442)、人肺细胞(W138,ATCC CCL75)、人肝细胞(Hep G2,HB8065)、小鼠骨髓瘤细胞、NS0、杂交瘤细胞如小鼠杂交瘤细胞、COS细胞、小鼠乳腺肿瘤(MMT060562,ATCC CCL51)、TR1细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))、MRC5细胞、FS4细胞和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。

宿主细胞以用于产生apoA-IV蛋白的表达或克隆载体转化，并在适当地改变用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。

根据J Lipid Res.1997年9月；38(9):1782-94中公开的程序来产生实施例中所用的ApoA-IV敲除小鼠，通过引用将该文献的完整教导并入本文中。

本发明的方法中还包括用于治疗2型糖尿病的组合疗法。可以用于与载脂蛋白A-IV组合的另外的治疗剂的实例包括，但不限于磺酰脲类、氯茴苯酸类、双胍类、噻唑烷二酮类、α-葡糖苷酶抑制剂、DPP-4抑制剂、肠促胰酶素模拟物和胰岛素。另外的治疗剂可以在apoA-IV施用于需要的受试者之前、同时或之后施用。

施用于受试者以用于治疗2型糖尿病的有效量的apoA-IV可以例如是基于体重的剂量(例如，mg/kg)或，在另一实施例中，是固体剂量(非体重相关的)。在一个实施方式中，约1-10mg/kg、约0.25-2mg/kg、约1mg/kg或0.1mg/kg-25mg/kg的apoA-IV施用于需要的受试者。在另一个实施方式中，施用于需要的受试者的有效量的apoA-IV是约1-1000mg的固定剂量。在进一步的实施方式中，有效量是施用于需要的受试者的apoA-IV的固定剂量，为约1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、21mg、22mg、23mg、24mg、25mg、26mg、27mg、28mg、29mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、120mg、140mg、160mg、180mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg或1000mg。

在一个特定的实施方式中，药物组合物可以进一步包含药物学上可接受的载体。药物学上可接受的载体包括该领域中常用的广泛多样的已知稀释剂(即，溶剂)、填充剂、增量剂、粘合剂、悬浮剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、赋形剂、润湿剂等。药物组合物优选是含水的，即，是液体制剂，并且优选包含无热原水。根据药物制剂的形式，这些载体可以单独或结合使用。如果需要，所得到的制剂可以掺入一种或多种药物制剂领域中广泛使用的稳定剂、缓冲剂、防腐剂、着色剂、香料、调味剂等。

非糖基化apoA-IV或其生物活性类似物可以配制成选自片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、注射液、溶液、乳液、悬浮液和糖浆的剂型。药物组合物的形式和施用途径不受限制，并且可以适当地选择。例如，片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、糖浆、溶液、乳液和悬浮液可以口服施用。此外，注射液(例如，皮下、静脉内、肌肉内和腹膜内)可以单独静脉内施用或结合含有葡萄糖、氨基酸和/或其他物质的常规补充物一起施用，或可以单独地肌肉内、皮内、皮下和/或腹膜内施用。

可以根据这种类型的药物领域中的已知方法，使用药物学上可接受的载体来制备本发明的用于治疗2型糖尿病的药物组合物。例如，根据已知的方法，使用赋形剂如蔗糖、乳糖、葡萄糖、淀粉、甘露糖醇等；粘合剂如糖浆、阿拉伯树胶、山梨糖醇、黄芪胶、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂如淀粉、羧甲基纤维素或其钙盐、微晶纤维素、聚乙二醇等；润滑剂如滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硅石等及润湿剂如月桂酸钠、甘油等，来制备如片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂等的口服形式。

可以根据已知的方法，合适地使用用于溶解活性成分的溶剂如乙醇、异丙醇、丙二醇、1,3-丁二醇、聚乙二醇、芝麻油等；表面活性剂如山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、氢化蓖麻油的聚氧乙烯酯、卵磷脂等；悬浮剂如纤维素衍生物(包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素等)、天然树胶(包括黄芪胶、阿拉伯树胶等)及防腐剂如对羟基苯甲酸酯、苯扎氯铵、山梨酸盐等，来制备注射液、溶液、乳液、悬浮液、糖浆等。

本发明的用于治疗2型糖尿病的药物组合物中所含的活性成分的比例可以从大的范围中适当地选择。

在一个特定的实施方式中，需要治疗2型糖尿病的受试者是哺乳动物。哺乳动物可以选自人、非人灵长类动物、犬、猫、鼠、牛、马、猪和兔类。在一个特定的实施方式中，哺乳动物是人。在另一个实施方式中，非糖基化apoA-IV或其生物活性类似物可以施用于受试者以用于治疗2型糖尿病，其中该受试者是肥胖的。或者，非糖基化apoA-IV可以施用于受试者以用于治疗2型糖尿病，其中该受试者不是肥胖的。

在再另一个实施方式中，参照图1，公开了装置1。在一个实施方式中，装置1包含之前讨论的药物组合物的储器10。在进一步的实施方式中，储器10包含小瓶12。小瓶12可以由不抑制药物组合物的功能的任何材料形成。例如，小瓶12可以包含玻璃和/或塑料。此外，小瓶12可以包含可刺穿的隔膜，通过其可以取出药物组合物。使用中，由注射器20的针22刺穿小瓶的隔膜14，通过注射器20从小瓶12中取出药物组合物，并且通过注射到需要的受试者中来施用药物组合物。

实施例

以下非限制性实施例说明了本发明的方法。

实施例1：ApoA-IV敲除小鼠的葡萄糖耐受不良

实验方案。获得了雄性apoA-IV敲除(“下文中称为“KO”)小鼠。野生型(下文中称为“WT”)小鼠作为对照。ApoA-IV KO和WT小鼠获自辛辛那提大学(辛辛那提，OH)保持的群体。给apoA-IV KO和WT小鼠喂食正常饮食(chow diet)。在进行葡萄糖耐受测试之前，apoA-IV KO小鼠和WT小鼠禁食五小时。在葡萄糖耐受测试中，给apoA-IV KO小鼠和WT小鼠腹膜内注射约2mg/g体重的剂量的葡萄糖，并且在注射葡萄糖后约0、15、30、60和120分钟测量血糖。葡萄糖耐受测试进行两次，一次在三个月大时，再一次在十六个月大时。

实验结果。如图2中所示的，apoA-IV KO小鼠相对于WT小鼠是葡萄糖耐受不良的。具体地，图2显示了腹膜内注射葡萄糖后两小时，WT小鼠中的血糖水平低于apoA-IV KO小鼠中的血糖水平。尽管不受理论束缚，这些研究的含义在于apoA-IV是正常葡萄糖动态平衡(至少在雄性中)必需的。此外，如图3中所示，在十六个月大测试时，apoA-IV KO小鼠显示出提高的葡萄糖耐受不良。具体地，图3显示了在十六个月大时测试的apoA-IV KO小鼠中的血糖水平高于三个月大时测试的apoA-IV KO中的血糖水平。尽管不受理论束缚，这些研究的含义在于apoA-IV KO小鼠的葡萄糖耐受随着年龄变差。

使用雌性野生型和apoA-IV敲除小鼠的实验

如实施例1中之前所述的，雌性apoA-IV野生型和敲除小鼠接受与用于雄性apoA-IV KO和WT小鼠相同的腹膜内葡萄糖耐受测试。结果显示于图11中。用葡萄糖腹膜内激发时，雌性apoA-IV^-/-小鼠与雌性WT动物相比具有提高的血糖水平，但没有统计学显著差异。另一方面，在WT和KO动物之间，雄性具有显著差异。

实施例2：ApoA-IV敲除小鼠中葡萄糖耐量的恢复

实验方案。在证明apoA-IV KO小鼠是葡萄糖耐受不良后，进行了一系列深入的研究来确定将apoA-IV施用于apoA-IV KO小鼠是否使葡萄糖耐量恢复至正常水平。具体地，进行了一系列研究以不仅确定施用的apoA-IV的量，而且确定在进行葡萄糖耐受测试之前施用apoA-IV的最佳时间。

给ApoA-IV雄性KO小鼠腹膜内注射约0.25、0.5、1和2μg/g体重的剂量的apoA-IV。还给ApoA-IV KO小鼠腹膜内注射盐水溶液来作为对照。给小鼠注射apoA-IV或盐水溶液后，按照之前讨论的在三个月大时进行葡萄糖耐受测试。具体地，在注射apoA-IV或盐水溶液后约两小时进行葡萄糖耐受测试。实验结果表明恢复apoA-IV KO小鼠的葡萄糖耐量的最佳时间为进行葡萄糖耐受测试之前约两小时施用apoA-IV。

实验结果。如图4中所示，apoA-IV施用于apoA-IV KO小鼠将葡萄糖耐量恢复至正常水平。具体地，图4中显示了注射apoA-IV的apoA-IV KO小鼠中的血糖水平低于注射盐水溶液的apoA-IV KO小鼠中的血糖水平。此外，如图4中所示，注射apoA-IV的apoA-IV KO小鼠中的血糖水平在注射最高剂量的apoA-IV的apoA-IV KO小鼠中是最低的；相似地，注射apoA-IV的apoA-IV KO小鼠中的血糖水平在注射最低剂量的apoA-IV的apoA-IV KO小鼠中是最高的。因此，发现了葡萄糖耐量改善的程度取决于施用的apoA-IV的剂量，较高的剂量导致改善的葡萄糖耐量。

实施例3：ApoA-IV在恢复apoA-IV敲除小鼠的葡萄糖耐量中的特异性

实验方案。为了确定apoA-IV的特异性，我们将载脂蛋白AI(下文中称为“apoA-I”)施用于apoA-IV KO小鼠。ApoA-I是由小肠上皮细胞产生的蛋白质，小肠上皮细胞也产生apoA-IV。ApoA-I具有许多与apoA-IV共同的功能。给apoA-IV KO小鼠腹膜内注射1μg/g体重剂量的apoA-I。还给ApoA-IV KO小鼠腹膜内注射盐水溶液来作为对照。给小鼠注射apoA-I或盐水溶液后，按照之前讨论的在三个月大时进行葡萄糖耐受测试。具体地，在注射apoA-I或盐水溶液后约两小时进行葡萄糖耐受测试。

实验结果。如图5中所示，apoA-I施用于apoA-IV KO小鼠未能恢复或改善葡萄糖耐量。

实施例4：apoA-IV敲除小鼠中葡萄糖耐量恢复的机制

实验方案。为了确定ApoA-IV改善apoA-IV KO小鼠中葡萄糖耐量的机制，我们测量了apoA-IV KO小鼠中葡萄糖诱导的胰岛素分泌。更具体地，按照之前讨论的在三个月大时的葡萄糖耐受测试过程中，我们测量了葡萄糖诱导的胰岛素分泌。在该研究中，在进行葡萄糖耐受测试前两小时，给apoA-IV KO小鼠腹膜内注射约1μg/g体重剂量的小鼠apoA-IV。在进行葡萄糖耐受测试前约两小时，给apoA-IV KO小鼠注射盐水溶液作为对照。

实验结果。如图6中所示的，在注射盐水的apoA-IV KO小鼠中不存在I期胰岛素分泌。然而，如图6中所示的，在进行葡萄糖耐受测试前两小时腹膜内注射apoA-IV时，apoA-IV KO小鼠中的I期胰岛素分泌恢复。

实施例5：ApoA-IV在高脂肪饮食的apoA-IV敲除小鼠和野生型小鼠中的功效

实验方案。给apoA-IV KO和WT小鼠长期喂食购自Dyets(Bethlehem，PA)的高脂肪半纯化的、营养完全的实验饮食(AIN-93M)，持续10周。高脂肪饮食含有约20g脂肪(即，约19g乳脂和1g大豆油以提供必需脂肪酸)/100g饮食。将apoA-IV KO和WT小鼠单独圈养在温度控制(约22±1℃)和光照控制(约12h光/12暗)的生态动物饲养场中的盆状笼子(tub cage)中，玉米芯垫层。按照之前讨论的，在三个月大时进行葡萄糖耐受测试。在进行葡萄糖耐受测试之前，apoA-IV KO小鼠和WT小鼠禁食五小时。在葡萄糖耐受测试中，给apoA-IV KO小鼠和WT小鼠腹膜内注射约2mg/g体重的剂量的葡萄糖。

实验结果。如图7中所示，apoA-IV KO小鼠相对于WT小鼠呈现出更高的葡萄糖耐受不良。具体地，图7显示了腹膜内注射葡萄糖后两小时，WT小鼠中的血糖水平低于apoA-IV KO小鼠中的血糖水平。

实施例6：高脂肪饮食的ApoA-IV敲除和野生型小鼠中葡萄糖耐量的恢复

实验方案。进行了一系列涉及三个月大时向高脂肪饮食(20％重量脂肪，19％乳脂和1％红花油)饲养14周的apoA-IV KO和WT小鼠施用apoA-IV的研究。具体地，给apoA-IV KO和WT小鼠腹膜内注射约1μg/g体重剂量的小鼠apoA-IV。还给apoA-IV KO和WT小鼠腹膜内注射盐水溶液以用作对照。注射apoA-IV或盐水溶液后，进行了葡萄糖耐受测试。具体地，注射apoA-IV或盐水溶液后两小时进行葡萄糖耐受测试。

实验结果。如图8中所示，apoA-IV KO小鼠中apoA-IV的施用显著改善了葡萄糖耐量。具体地，图8显示了注射apoA-IV的apoA-IVKO小鼠中的血糖水平低于注射盐水溶液的apoA-IV KO小鼠中的血糖水平。[前一句是多余的，因为下一句描述了相同的情况。]尽管本文中没有包括数据，但还发现了长期喂食高脂肪饮食的WT小鼠中apoA-IV的施用也显著改善葡萄糖耐量。

实施例7：具有2型糖尿病的小鼠中葡萄糖耐量的恢复

实验方案。为了证实apoA-IV有效促进具有2型糖尿病的动物的葡萄糖耐受，从Jackson Laboratories(Bar Harbor，Maine)获得杂合性KK Cg-A/J(下文称为“Cg-A/J”)小鼠。Cg-A/J小鼠在八周大时发生高血糖症、高胰岛素血症、肥胖和葡萄糖耐受不良。这些小鼠中糖尿病的主要诱因是由与编码刺鼠相关蛋白和黑素皮质素-IV受体的拮抗剂的A^y突变的多基因相互作用而产生的胰岛素抵抗。给Cg-A/J喂食正常饮食。此外，从喂食正常饮食的十至十四周，血糖水平显著提高。

在十四周大时，通过腹膜内注射向Cg-A/J小鼠施用小鼠apoA-IV(约1μg/g体重)或盐水溶液(作为对照)。然后在约0、0.5、1、2、3、4、5、7、11和24小时测定血糖。

实验结果。如图9中所示的，相对于盐水对照，apoA-IV在降低Cg-A/J小鼠的血糖水平方面具有显著作用。尽管注射盐水溶液的Cg-A/J小鼠在24小时的整个研究期间中保持稳定的血糖水平，但注射apoA-IV的Cg-A/J小鼠经历了超过10个小时的血糖水平下降，并且在该时间段的大部分时间中，血糖水平与我们研究的C57BL/6J动物相当。从这个研究中，我们得出结论，apoA-IV的施用在降低Cg-A/J小鼠的血糖中是有效的。

实施例8：ApoA-IV KO、ApoA-I KO和WT小鼠中血清淀粉样P成分的水平

实验方案。进行了一系列涉及测定喂食致动脉粥样硬化的饮食的ApoA-IV KO、ApoA-I KO和WT小鼠中的血清淀粉样A蛋白成分(下文中称为“SAP”)的水平的研究。ApoA-IV KO、ApoA-I KO和WT小鼠获自辛辛那提大学。SAP是淀粉样P成分(下文中称为“AP”)的血清形式，是首先被确认为称为淀粉状蛋白的体内病理性沉积物的五边形组分的25kDa五聚体蛋白。SAP在人体中的行为类似于C-反应性蛋白。具体地，在喂食致动脉粥样硬化饮食12周后，在apoA-IV KO、apoA-I KO和WT小鼠中测定apoA-IV KO、apoA-I KO和WT小鼠的血浆SAP水平。通过Western印迹分析测定了血浆SAP的水平。

实验结果。如图10中所示的，apoA-IV KO小鼠(对应于小鼠编号1、8和10)中的SAP水平相对于apoA-I KO小鼠(对应于小鼠编号28、29和30)和WT小鼠(对应于小鼠编号19、20和25)中的SAP水平提高。

为了描述和限定本发明的目的，应注意本文中所用的术语“约”和“基本上”表示可以归结于任何量的比较、值、测量值或其他表示的内在不确定程度。术语“约”和“基本上”在本文中还用来表示数量表示可能从所引述的值发生改变而不导致所述事物的基本功能改变的程度。

以上的描述和附图只认为是实现了本发明的特征和优点的示例性实施方式的说明。可以进行所述特征和步骤的改变和替换而不脱离本发明公开内容的意图和范围。因此，不认为本公开受到之前的描述和附图的限制，而仅仅由所附权利要求的范围限定。

实施例9：人ApoA-IV降低进行腹膜内葡萄糖耐受测试的野生型小鼠的血糖水平

实验方案。进行了研究来确定将人apoA-IV施用于野生型小鼠是否将影响进行葡萄糖耐受测试的小鼠的血糖水平。

给三个月大的野生型小鼠腹膜内注射约1μg/g体重剂量的人apoA-IV。作为对照，给另一组野生型小鼠腹膜内注射盐水溶液。注射人apoA-IV或盐水溶液后，进行了葡萄糖耐受测试。具体地，注射apoA-IV或盐水溶液后约两小时和禁食五小时后进行葡萄糖耐受测试。收集尾血，并通过血糖仪进行测量。

实验结果。如图12中所示，人apoA-IV在降低进行葡萄糖耐受测试的野生型小鼠的血糖方面是有效的。

实施例10：小鼠ApoA-IV在进行腹膜内葡萄糖耐受测试的野生型雌性小鼠中的作用

实验方案。进行了研究来确定将小鼠apoA-IV施用于雌性野生型小鼠是否影响进行葡萄糖耐受测试的小鼠的血糖水平。

给三个月大的雌性野生型小鼠腹膜内注射约1μg/g体重剂量的小鼠apoA-IV。作为对照，给另一组雌性野生型小鼠腹膜内注射盐水溶液。注射人apoA-IV或盐水溶液后，进行了葡萄糖耐受测试。具体地，注射apoA-IV或盐水溶液后约两小时和禁食五小时后进行葡萄糖耐受测试。收集尾血，并通过血糖仪进行测量。

实验结果。如图13中所示，小鼠apoA-IV在降低进行葡萄糖耐受测试的野生型雌性小鼠的血糖方面是有效的。

实施例11：人ApoA-IV刺激人胰岛的胰岛素释放

高纯度人胰岛由弗吉尼亚大学，Axon Cells，提供。将胰岛在含有10％FBS和11mM葡萄糖的RPMI1640中，在37℃下，95％空气和5％CO₂的潮湿气氛中培养48小时。然后将四组50IEQ胰岛在含有3.0mM葡萄糖的常规KRB(129mM NaCl、4.8mM KCl、2.5mM CaCl₂、1.2mM MgSO₄、1.2mM KH₂PO₄、5mM NaHCO₃、10mM HEPES和0.2％BSA)中，在37℃下预孵育1h。然后在10μg/ml人A-IV存在或不存在下，将前两组的胰岛在含有3.0mM葡萄糖的常规KRB中孵育一小时，并进一步在10μg/ml人A-IV存在或不存在下，与20mM葡萄糖再孵育一小时。将后两组的胰岛在10μg/ml人A-IV存在或不存在下，在含有3.0mM葡萄糖的30mM KCl KRB(103.8mM NaCl、30mM KCl、2.5mM CaCl₂、1.2mM MgSO₄、1.2mM KH₂PO₄、5mMNaHCO₃、10mM HEPES和0.2％BSA)加250μmol/l二氮嗪中孵育一小时，并进一步在10μg/ml人A-IV存在或不存在下，与20mM葡萄糖再孵育一小时。在各次的一小时孵育结束时收集培养基。通过ELISA试剂盒(Millipore)测量胰岛素水平。

如可从图14看到的，当通过30mM KCl加250μM二氮嗪将人胰岛最大去极化时，10μg/ml hA-IV对胰岛素分泌显示出明显的刺激作用。

实施例12：非糖基化ApoA-IV的制备

将人和小鼠apoA-IV cDNA包含在pSP65维持载体中，并且Afl III限制性位点进行工程化设计以恰好在用于成熟apoA-IV蛋白的编码序列的5’端。从维持载体切除基因，并接合至pET30表达载体中。将构建体转染至大肠杆菌BL-21(DE3)细胞中，并且在补充了卡那霉素(30μg/ml)的Luria-Bertani培养基中在37℃下生长。在诱导细胞中的apoA-IV蛋白合成后，收获细胞并超声波处理。通过His-结合亲和柱色谱和渗析来纯化来自裂解产物的apoA-IV蛋白。将所得到的apoA-IV蛋白在盐水中稀释至1.0mg/ml的终浓度。

实施例13：人ApoA-IV中不存在N-和O-糖基化

使用www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/webface？jobid＝netNglyc,4F9C6AD203AFBD5C的NetNGlyc1.0服务器，在计算机上分析了人apoA-IV和45种错义变体。关于错义变体的详情在表1中提供。O-和N-连接的糖基化分析通过原始apoA-IV和示例性的变体(即，P393H)在图24和25中举例说明。结果表明人apoA-IV和错义变体不具有任何N-连接的或N-连接的糖基化位点。值得注意的是，表1中描述的变体(通过SEQ ID NO:20-64中描述的氨基酸序列表示；SEQ ID NO:65代表具有信号序列的ApoAIV)的糖基化特征与图24和25中呈现的那些相同。鉴于本领域中apoA-IV通过甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡糖胺和唾液酸糖基化的公知常识(例如，Weinberg等,J Lipid Res.1983,24(1):52-9)，这些结果是出人意料的

表1.ApoAIV变体(APOA4基因(mRNA登录号NM_000482.3))

注：过滤器状态对于表1的所有条目是通过。

实施例14：ApoA-IV对于细胞表达的优化

为利于apoA-IV在大肠杆菌中的周质表达，构建体使用各种信号肽制备。这些信号肽(即，OmpA、PelB和ENX)各自与apoA-IV的N-末端融合。这些信号序列各自的氨基酸和核酸序列提供如下：

OmpA信号肽

M K K T A I A I A V A L AG F T A V A Q A(SEQ ID NO:6)

ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCTGGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC(SEQ ID NO:7)

PelB信号肽

M K Y L L P T A A A G L L LL A A Q P A M A(SEQ ID NO:8)

ATG AAA TAC CTG CTG CCG ACC GCT GCT GCT GGT CTG CTG CTCCTC GCT GCC CAG CCG GCG ATG GCC(SEQ ID NO:9)

ENX信号肽

M F K F K K N F L V G L S AA L M S I S L F S A T A S A(SEQ ID NO:10)

ATG TTT AAG TTT AAA AAG AAT TTC TTA GTT GGA TTA TCG GCAGCT TTA ATG AGT ATT AGC TTG TTT TCG GCA ACC GCC TCT GCA(SEQ ID NO:11)

为提高大肠杆菌中的蛋白质产率，apoA-IV的密码子使用进行优化。优化使用DNA2.0的算法(DNA2.0Inc.)或其它算法基于实验数据和tRNA荷载率(氨基乙酰化)进行。具有优化的密码子的apoA-IV编码序列随后在5’端与信号肽的核苷酸序列的3’端融合。另外，密码子优化的序列可以在其3’端与双终止密码子连接。具有优化的密码子和克隆位点的构建体在图20-23中举例说明。优化的DNA序列描述于SEQID NO:13、15、17和19中，所得的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:12、14、16和18中示出。值得注意的是，优化的序列(SEQ ID NO:12-19)也可以用于本发明的方法和组合物中。

apoA-IV构建体然后可以由DNA2.0,Inc.合成并利用NdeI-XhoI限制性位点亚克隆到pJexpress载体(例如，pJexpress401)中。这些构建体可以转化到BL21大肠杆菌菌株(Novagen)(F^-OmpT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)galdcm)中并且包含这些构建体的克隆可以用卡那霉素选择。在125ml含卡那霉素(例如，50μg/ml)的YES培养基中的预培养物可以从一个分离的集落开始接种并在37℃下以270rpm的搅拌孵育约16小时。500ml含卡那霉素的YES培养基中的新鲜培养物可以用10mL的预培养物接种并在37℃下以270rpm的搅拌孵育直到OD₆₀₀达到0.5-1.0(最佳＝0.6)。所得的培养物随后用IPTG(例如，1mM的终浓度)诱导并在37℃下孵育1小时、2小时、4小时或22小时。

ApoA-IV蛋白可以从上述制备的培养物的周质和胞质部分分离。更具体地，培养物可以被沉淀。所得的培养物沉淀可以悬浮在高渗TES缓冲液(蔗糖20％)/OD₆₀₀/mL中并在室温下孵育5min，然后在4℃下4倍体积的纯化水中稀释。稀释的悬浮液可以在冰上进一步孵育10min并以13,000rpm离心5min。所得的上清液是周质部分(P)且沉淀是胞质部分。apoA-IV的表达可以通过SDS-PAGE或Western分析进行分析。这些部分中的ApoA-IV随后可以通过常规和/或亲和层析纯化并配制用于递送于人以治疗2型糖尿病。

通过引用并入

本文中引用的所有参考文献和专利的内容通过引用全文由此并入。

等同

本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文描述的本发明特定实施方式的许多等同物。以下权利要求意图包括这类等同物。

Claims

1.一种治疗需要的受试者的2型糖尿病的方法，包括向所述受试者施用有效量的与载脂蛋白A-IV蛋白质具有至少90％同一性的非糖基化载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段，从而治疗所述受试者的2型糖尿病，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段使用蛋白质表达系统产生。

2.一种降低需要的受试者的血糖水平的方法，包括向所述受试者施用有效量的与载脂蛋白A-IV蛋白质具有至少90％同一性的非糖基化载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段，从而降低所述受试者的血糖水平，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段使用蛋白质表达系统产生。

3.一种基本上恢复需要的受试者的葡萄糖耐量至正常水平的方法，包括向所述受试者施用有效量的与载脂蛋白A-IV蛋白质具有至少90％同一性的非糖基化载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段，从而恢复所述受试者的葡萄糖耐量，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段使用蛋白质表达系统产生。

4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述非糖基化载脂蛋白A-IV蛋白质与载脂蛋白A-IV蛋白质具有至少95％的同一性。

5.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述非糖基化载脂蛋白A-IV蛋白质与载脂蛋白A-IV蛋白质具有至少99％的同一性。

6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质的氨基酸序列是

X₁EVSADQVATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQKSELTQQLNALFQDKLGEVNTYAGDLQKKLVPFATELHERLAKDSEKLKEEIGKELEELRARLLPHANEVSQKIGDNLRELQQRLEPYADQLRTQVNTQAEQLRRQLTPYAQRMERVLRENADSLQASLRPHADX₂LKAKIDQNVEELKGRLTPYADEFKVKIDQTVEELRRSLAPYAQDTQEKLNHQLEGLTFQMKKNAEELKARISASAEELRQRLAPLAEDVRGNLRGNTEGLQKSLAELGGHLDQQVEEFRRRVEPYGENFNKALVQQMEQLRQKLGPHAGDVEGHLSFLEKDLRDKVNSFFSTFKEKESQDKX₃LSLPELEQQQEQX₄QEQQQEQVQMLAPLES(SEQ ID NO.4)

其中X₁是G、A、V或不存在；

X₂是E或K；

X₃是T或S；和

X₄是Q或H，

或其生物活性类似物或片段。

8.权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质是全长人载脂蛋白A-IV蛋白质。

9.权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质的氨基酸是

EVSADQVATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQKSELTQQLNALFQDKLGEVNTYAGDLQKKLVPFATELHERLAKDSEKLKEEIGKELEELRARLLPHANEVSQKIGDNLRELQQRLEPYADQLRTQVNTQAEQLRRQLTPYAQRMERVLRENADSLQASLRPHADELKAKIDQNVEELKGRLTPYADEFKVKIDQTVEELRRSLAPYAQDTQEKLNHQLEGLTFQMKKNAEELKARISASAEELRQRLAPLAEDVRGNLRGNTEGLQKSLAELGGHLDQQVEEFRRRVEPYGENFNKALVQQMEQLRQKLGPHAGDVEGHLSFLEKDLRDKVNSFFSTFKEKESQDKTLSLPELEQQQEQQQEQQQEQVQMLAPLES(SEQ ID NO.1)或其生物活性类似物或片段。

10.权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质的氨基酸序列是

GEVSADQVATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQKSELTQQLNALFQDKLGEVNTYAGDLQKKLVPFATELHERLAKDSEKLKEEIGKELEELRARLLPHANEVSQKIGDNLRELQQRLEPYADQLRTQVNTQAEQLRRQLTPYAQRMERVLRENADSLQASLRPHADELKAKIDQNVEELKGRLTPYADEFKVKIDQTVEELRRSLAPYAQDTQEKLNHQLEGLTFQMKKNAEELKARISASAEELRQRLAPLAEDVRGNLRGNTEGLQKSLAELGGHLDQQVEEFRRRVEPYGENFNKALVQQMEQLRQKLGPHAGDVEGHLSFLEKDLRDKVNSFFSTFKEKESQDKTLSLPELEQQQEQQQEQQQEQVQMLAPLES(SEQ ID NO.3)或其生物活性类似物或片段。

11.权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述使用蛋白质表达系统是细菌表达系统。

12.权利要求11所述的方法，其中所述细菌表达系统是大肠杆菌。

13.权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述蛋白质表达系统选自哺乳动物表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统和无细胞表达系统。

14.一种治疗患有2型糖尿病的受试者的2型糖尿病的方法，包括向所述受试者施用重组的非糖基化apoA-IV蛋白质，其中所述apoA-IV蛋白质包含SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项具有至少95％同一性的氨基酸序列，或者其生物活性片段。

15.权利要求14所述的方法，其中所述apoA-IV蛋白质包含SEQ IDNO:1、3、4或20-64任一项所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项具有至少96％同一性的氨基酸序列，或者其生物活性片段。

16.权利要求14所述的方法，其中所述apoA-IV蛋白质包含SEQ IDNO:1、3、4或20-64任一项所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项具有至少97％同一性的氨基酸序列，或者其生物活性片段。

17.权利要求14所述的方法，其中所述apoA-IV蛋白质包含SEQ IDNO:1、3、4或20-64任一项所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项具有至少98％同一性的氨基酸序列，或者其生物活性片段。

18.权利要求1-17任一项所述的方法，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质系统性施用。

19.权利要求18所述的方法，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段的系统性施用选自口服、皮下、静脉内、肌肉内和腹膜内施用。

20.权利要求1-19任一项所述的方法，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段以约1-约10μg/g的剂量施用。

21.权利要求1-19任一项所述的方法，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段以约0.25-约2μg/g的剂量施用。

22.权利要求1-19任一项所述的方法，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段以约1μg/g的剂量施用。

23.权利要求1-22任一项所述的方法，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段每天施用一次。

24.权利要求1-22任一项所述的方法，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段每天施用约2次。

25.包含与载脂蛋白A-IV蛋白质具有至少90％同一性的非糖基化载脂蛋白A-IV蛋白质或者其生物活性类似物或片段的药物组合物，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段使用蛋白质表达系统产生。

26.一种药物组合物，其包含非糖基化载脂蛋白A-IV蛋白质的，该非糖基化载脂蛋白A-IV蛋白质包含SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项至少95％相同的氨基酸序列，或者其生物活性片段。

27.权利要求26所述的药物组合物，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质包含与SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项至少96％相同的氨基酸序列，或其生物活性片段。

28.权利要求26所述的药物组合物，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质包含与SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项至少97％相同的氨基酸序列，或其生物活性片段。

29.权利要求26所述的药物组合物，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质包含与SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项至少98％相同的氨基酸序列，或其生物活性片段。

30.权利要求26所述的药物组合物，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质包含与SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项至少99％相同的氨基酸序列，或其生物活性片段。

31.权利要求25-30任一项所述的药物组合物，进一步包含药学上可接受的载体或稀释剂。

32.权利要求25-31任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物选自液体制剂、含水制剂和冻干制剂。

33.权利要求25-31任一项所述的药物组合物，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质的氨基酸序列是

其中X₁是G、A、V或不存在；

X₂是E或K；

X₃是T或S；和

X₄是Q或H，

或其生物活性片段。

34.权利要求25-31任一项所述的药物组合物，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质是全长人载脂蛋白A-IV蛋白质。

35.权利要求25-31任一项所述的药物组合物，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质的氨基酸序列是

EVSADQVATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQKSELTQQLNALFQDKLGEVNTYAGDLQKKLVPFATELHERLAKDSEKLKEEIGKELEELRARLLPHANEVSQKIGDNLRELQQRLEPYADQLRTQVNTQAEQLRRQLTPYAQRMERVLRENADSLQASLRPHADELKAKIDQNVEELKGRLTPYADEFKVKIDQTVEELRRSLAPYAQDTQEKLNHQLEGLTFQMKKNAEELKARISASAEELRQRLAPLAEDVRGNLRGNTEGLQKSLAELGGHLDQQVEEFRRRVEPYGENFNKALVQQMEQLRQKLGPHAGDVEGHLSFLEKDLRDKVNSFFSTFKEKESQDKTLSLPELEQQQEQQQEQQQEQVQMLAPLES(SEQ ID NO.1)，或其生物活性片段。

36.权利要求25-31任一项所述的药物组合物，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质的氨基酸序列是

GEVSADQVATVMWDYFSQLSNNAKEAVEHLQKSELTQQLNALFQDKLGEVNTYAGDLQKKLVPFATELHERLAKDSEKLKEEIGKELEELRARLLPHANEVSQKIGDNLRELQQRLEPYADQLRTQVNTQAEQLRRQLTPYAQRMERVLRENADSLQASLRPHADELKAKIDQNVEELKGRLTPYADEFKVKIDQTVEELRRSLAPYAQDTQEKLNHQLEGLTFQMKKNAEELKARISASAEELRQRLAPLAEDVRGNLRGNTEGLQKSLAELGGHLDQQVEEFRRRVEPYGENFNKALVQQMEQLRQKLGPHAGDVEGHLSFLEKDLRDKVNSFFSTFKEKESQDKTLSLPELEQQQEQQQEQQQEQVQMLAPLES(SEQ ID NO.3)，或其生物活性片段。

37.权利要求25-31任一项所述的药物组合物，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质使用蛋白质表达系统产生，该蛋白质表达系统是细菌表达系统。

38.权利要求37所述的药物组合物，其中所述细菌表达系统是大肠杆菌。

39.权利要求22-31任一项所述的药物组合物，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质使用蛋白质表达系统产生，所述蛋白质表达系统选自哺乳动物表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统和无细胞表达系统。

40.一种治疗需要的受试者的2型糖尿病的方法，所述方法包括

在蛋白质表达系统中产生载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段，和

向患有2型糖尿病的受试者施用所述载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段，

从而治疗2型糖尿病，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质或其生物活性类似物或片段是非糖基化的。

41.权利要求40所述的方法，其中所述蛋白质表达系统是细菌表达系统。

42.权利要求40所述的方法，其中所述蛋白质表达系统是酵母或哺乳动物细胞表达系统。

43.权利要求40-42任一项所述的方法，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质包含SEQ ID NO:1、3、4或20-64中所示的氨基酸序列，或其生物活性片段。

44.权利要求40-42任一项所述的方法，其中所述载脂蛋白A-IV蛋白质包含与SEQ ID NO:1、3、4或20-64任一项所示的序列至少95％相同的氨基酸序列，或其生物活性片段。