CN1277581C - 一种用蚕生产抗血栓药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用蚕生产抗血栓药物的方法，属于生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。通过家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx moriNuclear polyhedrosis Virus)重组带有人Annexin V和低分子量尿激酶的融合蛋白基因，获得重组病毒，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为GMCC NO：0595，将该重组病毒接种家蚕幼虫、蛹进行表达，经分离纯化，冷冻干燥，制成注射和口服药物，经动物试验，均具有显著的抗血栓作用，成为一种制备靶向性的溶栓药物的新型方法。与现有技术相比，原料易得，生产成本低，治疗效果良好，而且使用剂量显著少于尿激酶。
Description
技术领域
本发明涉及到通过家蚕杆状病毒表达系统用蚕幼虫和蛹制备Annexin V和低分子量尿激酶的融合蛋白的方法，本发明还涉及用蚕幼虫和蛹生产Annexin V和低分子量尿激酶的融合蛋白制备抗血栓药物的方法。
背景技术
血栓是危害人们生命安全的疾病之一，据统计，我国每年患急性心肌梗塞和脑血栓的病人约达300万人之多。溶栓治疗已成功地用于临床血栓疾病如心肌梗塞的治疗。目前临床应用的溶栓药物主要有尿激酶、链激酶和组织型纤溶酶原激活剂等，但由于缺乏血栓特异性或在体内半衰期较短，临床应用往往会出现出血等副作用。因此，寻找新型的载体发展血栓靶向性的溶栓药物就显得十分重要。Annexin V是Annexin蛋白家族中含量最丰富的一种钙结合蛋白(Iwasaki，1987)，它对磷脂酰丝氨酸(PS)有高亲和力，在某些特殊情况下如血小板活化时，PS就暴露于膜的外侧，因此Annexin V对活化血小板具有高亲和力(Thiagarajan等，1990)。动物实验表明，同位素标记的Annexin V静脉注射后主要聚集于主动脉血栓部位(Tait等，1994)。由于Annexin V对血栓具有靶向性，因此可以其为载体发展血栓靶向性的溶栓药物。Annexin V本身具有抗凝活性，可预防血栓溶解后血栓的再形成，并且不具有免疫原性。国外已有人用化学法获取了Annexin V与尿激酶B链的偶联产物，其溶栓活性比尿激酶提高了近4倍(Tanaka等，1996)。但化学法存在操作繁琐、产物不均一等缺点。家蚕杆状病毒表达系统(Bombyxmori Nuclear polyhedrosis Virus)是真核表达系统，该技术自1983年Smith等首创以来，已有百种外源基因在该系统表达(《昆虫病毒分子生物学》，1998，547-578)，由于有家蚕淋巴血本身的大量蛋白的保护作用和一些未知机理的作用，家蚕表达的蛋白可以生产口服药物。
发明内容
为此，本发明采用家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx mori Nuclear polyhedrosisVirus)，分别在家蚕细胞，家蚕幼虫和蚕蛹中表达具有极高临床应用价值的人Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白，制成注射和口服药物，通过动物试验，均具有显著的抗血栓作用，成为一种制备靶向性溶栓药物的新型方法。即本发明提供具有较高临床应用价值的一种用蚕生产抗血栓药物的方法。
本发明提供了含有Annexin V和低分子量尿激酶的质粒pUC-UKAV，以中国人肾细胞细胞mRNA为模板，通过RT-PCR扩增，在5’端引进BamHI酶切位点，在3’端引入XhoI位点和水蛭素多肽核苷酸序列，PCR产物克隆进pUC19的HindII位点，构建质粒pUC-UK；以含有人胎盘mRNA为模板，通过RT-PCR扩增AnnexinV的cDNA，在5’端引进XhoI酶切位点，在3’端引入EcoRI位点，PCR产物经Xho I和EcoRI酶切克隆进pUC-UK的Xho I和EcoRI位点，构建质粒pUC-UKAV，经测序证明其核苷酸序列完全正确。
本发明还提供了含Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的杆状病毒转移质粒pBac-UKAV。将质粒pUC-UKAV先用BamHI和EcoRI酶切，克隆进入用BamHI和EcoRI酶切的pBacPAK8，构建含Annexin V和低分子量尿激酶融合基因转移质粒pBac-UKAV(图1)。
本发明还提供了含Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的重组昆虫杆状病毒BmBacUKAV。将转移质粒pBac-UKAV与家蚕野生病毒DNA进行共转染家蚕(Bombyx mori)细胞BmN，进行10轮空斑和Southern点杂交筛选出含AnnexinV和低分子量尿激酶融合基因的重组昆虫杆状病毒BmBacUKAV。该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为CGMCC NO：0595。
本发明还提供了Annexin V和低分子量尿激酶融合基因在家蚕幼虫和蛹中的表达产物。将重组杆状病毒BmBacUKAV感染BmN细胞进行病毒扩增，然后将扩增后的重组杆状病毒BmBacUKAV注射至五龄家蚕幼虫和蛹体内，分别取24、48、72、96和120小时的家蚕淋血巴，用纤维蛋白-琼脂糖平板法测定表明表达产物具有明显的纤溶活性，可被尿激酶的单克隆抗体所中和，在感染的第六天血淋巴中的尿激酶活性达到6×104IU/ml以上，在感染的第六天蛹血淋巴的活性达到8×104IU/ml。抗凝实验表明，表达产物也具有Annexin V的抗凝活性。膜结合特异性研究表明，Annexin V与低分子量尿激酶融合蛋白对活化的血小板的亲和力与Annexin V相同。
本发明还提供了在家蚕幼虫表达的Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白进行纯化。在感染的第六天收集蚕血清先经离心和硫酸铵沉淀后上Sephadex G100柱和MonoQ柱分离，每次收集样品均经ELISA测活，确定其活性存在，进一步用HPLC阳离子交换柱纯化，获得纯度为99％的重组蛋白。
本发明还将家蚕幼虫和蛹体表达Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白制成口服药物。在家蚕幼虫和蛹体表达Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白，经过过滤(100KD超滤)，30000rmp离心后经冷冻干燥后，以家蚕蛹为填充料配制成口服药物。
本发明还将家蚕幼虫和蛹体表达Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白进行了动物试验，取SD大鼠(由浙江医学科学院动物中心提供)50只，随机8分组，每组动物10只。先将大鼠以30g.L-1戊巴比妥钠按40mg.kg-1腹腔注射麻醉后，于腹正中线切开皮肤约3cm，开腹后分离下腔静脉，于左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉，缝合皮肤。结扎下腔静脉后2h开始静脉和口服给药，以尿激酶为阳性对照，每只大鼠给药容积为2ml。给药后1h处死动物，重新开腹，在结扎下方2cm处夹闭血管，剖开血管，取出血栓，称取血栓重量，计算溶栓百分率。剥离大鼠静脉血栓时发现，空白对照组的血栓基本上完全充满整段静脉血管。静脉注射和口服给予药液后，各组动物静脉血栓占管腔面积明显减少，结果见表1。结果显示：静脉注射和口服给药均具备显著减少下腔静脉血栓湿重的作用，以大剂量组溶栓作用最大，溶栓率达35.2％，各剂量间显示出量效相关趋势。与尿激酶相比，本发明表达的蛋白不仅效果好，而且使用剂量显著少于尿激酶。
综合所述，本发明的优点如下：与原核表达尿激酶在临床应用中有种种不足(例如缺乏血栓特异性或在体内半衰期较短，临床应用往往会出现出血等副作用)相比，在家蚕幼虫和蚕蛹中的表达产物具有更高的临床应用价值；家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫，可以低成本地大规模饲养；蚕体中有多种天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定；家蚕生产的蛋白可以口服，为患者解除了注射的痛苦和被感染的威胁，产生Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白，既具有低分子量尿激酶的溶活性，而且对活化血小板也具有高亲和力，通过动物试验证明其抗血拴作用，使其成为一种新型血栓靶向性的溶栓药物，不仅效果好，而且使用剂量显著少于尿激酶。
附图说明
图1：含Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBac-UKAV(图注说明：3’FS/5’FS：苜蓿银纹夜蛾多角体病毒多角体启动子3’端/5’端旁侧序列；P：苜蓿银纹夜蛾多角体病毒多角体启动子；A(Polyhedin Poly A+signal)多角体蛋白基因聚腺苷酸化信号；M13 ori：M13噬菌体复制起始点；Amp：氨苄青霉素基因；ori：pUC复制起始点)
具体实施方式
本发明通过以下实例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
实施例1、Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的构建
取中国人肾细胞，低温下磨碎，加入GIBCOBRL公司生产Trizol RNA提取液1ml，轻轻摇动10分钟后加入500μl氯仿(浙江迪耳药业有限公司)，在室温下放置10分钟，12000rpm离心10分钟，取上清，加入2倍体积的乙醇，混匀后，12000rpm离心10分钟，弃上清，加入反转录酶1000单位(GIBCOBRL公司)及4dNTP(GIBCOBRL公司)进行反转录，37℃，1小时，获得由mRNA反转录合成的cDNA。根据已发表的尿激酶基因设计引物(Nagai等，Gene，1985，36：183)，我们设计了两对引物P1和P2：P1：5’GGGGATCCATGTTAAAATTTCAGTGTGGCAAAAGAC3’P2：5’GGGCTCGAGATATTCTTCTGGAATTTCTTCGAAATCGCCGAGGGCCAGGCCATTCTC3’，以cDNA为模板，以P1、P2为引物进行PCR扩增。PCR条件为：94℃1min，55℃1.5min，72℃1.5min，共35个循环。PCR产物经低熔点胶纯化后，克隆进pUC19的HindII位点，构建质粒pUC-UK。测序证明PCR扩增的低分子量尿激酶cDNA序列正确。根据Annexin V的核苷酸序列(Iwasaki等，J Biochem，1987，102：1261)设计一对引物P3：5’GGGCTCGAGATGGCACAGGTTCTCAGAGG 3’和P4：5’GGGGAATTCTTAGTCATCTTCTCCACAGAGC 3’。以含有人胎盘mRNA反转录合成的cDNA为模板，以P3、P4为引物，按上述PCR条件扩增Annexin V的cDNA。PCR产物经Xho I和EcoRI酶切克隆进pUC-UK的Xho I和EcoRI位点，构建质粒pUC-UKAV，经测序证明其核苷酸序列完全正确。
实施例2、含Annexin V和尿激酶融合基因的昆虫杆状病毒转移质粒
将质粒pUC-UKAV先用BamHI和EcoRI酶切，克隆进入用BamHI和EcoRI(GIBCOBRL公司)酶切的pBacPAK8(CLONTECH公司)，构建含AnnexinV和低分子量尿激酶融合基因转移质粒pBac-UKAV，经酶切鉴定正确。(图1)
实施例3、含Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的重组昆虫杆状病毒的获得
取5ul含Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBac-UKAV和6ul家蚕野生核型多角病毒病毒DNA进行共转染。取6ulLipofectin(GIBCOBRL公司)加入100ul无血清的TC-100培养基混均。将事先培养在35mm Dish中的BmN细胞用无血清的TC-100(GIBCOBRL公司)培养基洗涤两次，并逐滴加入转移质粒和Lipofectin混合物，27℃培养4-5天，收取上清进行第一轮空斑筛选。取5ul上清感染35mm Dish中的BmN细胞，1小时后弃去上清加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖。4-5天后挑取空斑，感染BmN细胞3-4天，保存上清，细胞用NaOH裂解用于Southern杂交，取阳性克隆的上清进行第10轮空斑筛选。取阳性克隆的上清感染BmN细胞扩增，即可得到大量的含Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的重组杆状病毒BmBacUKAV。该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为CGMCC NO：0595。
实施例4、Annexin V和低分子量尿激酶融合基因在家蚕幼虫和蛹中的表达
取扩增的重组杆状病毒BmBacUKAV注射到五龄家蚕(Bombyx mori)幼虫和蛹中(申请人自行饲养)，每头注射2ul左右(滴度为1×107/ml)，分别取24、48、72、96和120小时表达的家蚕淋巴血，用纤维蛋白-琼脂糖平板法测定纤溶活性(方法参考Biochem Biophys Acta，1975，27：278)。结果表明表达产物具有明显的纤溶活性，可被尿激酶的单克隆抗体所中和，说明表达产物具有与天然尿激酶相同的纤溶活性，在感染的第六天血淋巴中的尿激酶活性达到6×104IU/ml以上，在感染的第六天蛹血淋巴活性达到8×104IU/ml。抗凝实验表明，表达产物也具有Annexin V的抗凝活性。膜结合特异性研究表明，Annexin V与低分子量尿激酶融合蛋白对活化的血小板的亲和力与Annexin V相同。
实施例5、含Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白的纯化
用3万头五龄起蚕，每头人工接种重组病毒使之发病，在感染的第六天收集蚕血清共10000ml，每瓶500ml贮存于-20℃。蚕血清先经5000rpm离心1小时，取上清在25000rpm离心30分钟，经硫酸铵沉淀后上Sephadex G100柱分离，每次收集样品均经ELISA测活，确定其活性存在。将过Sephadex G100柱的活性部分混合后，上MonoQ柱，流速0.5ml/分钟，5ml/管收集。先用20mM Tris-HCl，pH7.5缓冲液淋洗，当没有蛋白被洗脱下来时，再用75ml pH7.5 20mM Tris-HCl缓冲液+75ml含1M NaCl的缓冲液进行线性梯度洗脱。进一步用HPLC阳离子交换柱纯化，获得纯度为99％的重组蛋白。
实施例6、Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白口服药物的制备
在家蚕幼虫和蛹体(申请人自行饲养)表达Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白，经过过滤(100KD超滤)，30000rmp离心后经冷冻干燥后，以家蚕蛹为填充料配制成口服药物。
实施例7、Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白的动物试验
取SD大鼠(由浙江医学科学院动物中心提供)50只，随机8分组，每组动物10只。先将大鼠以30g.L-1戊巴比妥钠按40mg.kg-1腹腔注射麻醉后，仰卧固定。于腹正中线切开皮肤约3cm，开腹后分离下腔静脉，于左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉，缝合皮肤。分离大鼠左颈外静脉，插管给药。结扎下腔静脉后2h开始静脉和口服给药，静脉给药为实施例5纯化的蛋白，口服给药为例6的口服药物，以尿激酶为阳性对照(广东天普生化制药有限公司产品)，每只大鼠给药容积为2ml。给药后60min处死动物，重新开腹，在结扎下方2cm处夹闭血管，剖开血管，取出血栓，称取血栓重量，计算溶栓百分率。
剥离大鼠静脉血栓时发现，空白对照组的血栓基本上完全充满整段静脉血管。静脉注射和口服给予药液后，各组动物静脉血栓占管腔面积明显减少，结果见表1。结果显示，静脉注射和口服给药均具备显著减少下腔静脉血栓湿重的作用，以大剂量组溶栓作用最大，溶栓率达35.2％，各剂量间显示出量效相关趋势。与尿激酶相比，本发明表达的蛋白不仅效果好，而且使用剂量显著少于尿激酶。
表1 对结扎大鼠下腔静脉形成的静脉血栓的溶栓作用
| 分组 | 剂量(U·kg-1) | 血栓湿重(mg) | 溶栓率 |
| 空白对照 | 26.1±2.89 | ||
| Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白口服药物 | 50000 | 24.1±2.63* | 7.6％ |
| 100000 | 22.9±3.39* | 12.3％ | |
| 150000 | 22.2±2.77* | 14.9％ | |
| Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白(注射) | 5000 | 20.0±2.43** | 23.3％ |
| 10000 | 19.0±2.28** | 27.2％ | |
| 20000 | 16.9±2.44** | 35.2％* | |
| 尿激酶(注射) | 50000 | 19.8±2.53** | 24.1％ |
**P＜0.01，*P＜0.05
Claims (4)
1.一种用蚕生产抗血栓融合蛋白的方法：其特征在于：人Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白是通过带人Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的重组家蚕杆状病毒Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus感染家蚕幼虫和蛹体内表达产生，所述的含有人Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的重组家蚕杆状病毒为BmBacUKAV，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏编号为GMCC NO.0596。
2.根据权利要求1所述的一种用蚕生产抗血栓融合蛋白的方法，其特征在于：所述人Annexin V和低分子量尿激酶融合基因在家蚕幼虫和蛹中的表达产物是通过重组杆状病毒BmBacUKAV注射至五龄家蚕幼虫和蛹体内表达产生。
3.权利要求1所述的用蚕生产抗血栓融合蛋白的方法，其特征在于：该方法还包括分离，纯化家蚕表达的人Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白的步骤。
4.一种用蚕生产抗血栓的口服药物的方法，其特征在于：将表达人Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白的家蚕和蛹经冷冻干燥后制成口服药物，所述表达人Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白的家蚕和蛹是通过带人Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的重组家蚕杆状病毒Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus感染家蚕幼虫和蛹产生的，所述的含有人Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的重组家蚕杆状病毒为BmBacUKAV，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏编号为GMCC NO.0596。
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