CN104034713A - 罗丹明b的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗丹明B的快速检测方法，包括如下步骤：（1）提取：称取待测样品1份，加入4-10倍重量体积比的二次蒸馏水超声提取1-5min，提取液移至离心管，离心，将上清液取出备用；（2）净化：上清液加入2-5倍重量体积比的有机溶剂萃取，萃取完全后将有机溶剂层转移到离心管中，离心，再将有机溶剂层转移至试管中，吹干；（3）检测往氮气吹干的试管中加入适量二次蒸馏水，震荡后取出放入玻璃检测池，之后加入10-100ul纳米粒子溶胶及适量无机盐絮凝剂，混匀，然后放在便携拉曼光谱仪检测室内进行检测。本发明具有无机溶剂使用少，且适合实际样品的快速检测等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种罗丹明B的快速检测方法。
背景技术
罗丹明B(Rhodamine B)，又名玫瑰红B、碱性玫瑰精，俗称花粉红，分子式为C28H31ClN2O3，分子量为479.28。是一类工业碱性染料，曾用作食品添加剂，但根据国际癌症研究署（IARC）化学品致癌风险评价表明：摄取、吸入以及皮肤接触罗丹明B均会造成急性和慢性的中毒伤害，有动物实验表明，该物质吸入时有致癌作用，可能引起诱变或致畸，因其潜在的致癌和致突变性，于2008年被卫生部列入第一批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》，严禁在食品中使用。1993年起，欧美等国家和地区就已禁止将罗丹明B染料用于食品加工，日本也禁止使用该物质在食品中使用。但罗丹明B具有价格低廉、色泽红艳、稳定性强等特点，常被不法商家在辣椒、花椒、辣椒面、辣椒油等调味品中用作替代食品添加剂的着色剂，以次充好，以假冒真，欺骗消费者，给人们的饮食安全带来极大隐患，而且此类食品安全事件在近几年层出不穷，如2011年重庆罗丹明B食品安全事件、2012年长沙罗丹明B染色辣椒事件等。开展食品中罗丹明B的检测显得十分必要。目前，在我国罗丹明B的检测还没有国家标准，也没有快速检测标准，针对罗丹明B的分析检测，仅有国家质量监督检验检疫总局发布SN/T2430－2010《进出口食品中罗丹明B的检测方法》行业标准。在该标准中，样品提取后采用经凝胶色谱净化系统(GPC)净化，用液相色谱－荧光检测器或液相色谱－质谱/质谱仪测定和确证，但凝胶色谱净化系统价格昂贵，且操作复杂、检测时间长，很难在基层单位普及，更无法用于现场快速检测；而在罗丹明B快速检测方法方面，目前市面上也有根据固相萃取原理所开发的罗丹明B快速检测方法，但该方法主要是根据肉眼观察固相萃取柱上的红色条带进行判断是否含有罗丹明B，易出现假阳性，准确度低，检测灵敏度也不高。
定量检测痕量罗丹明6G的方法申请号:CN201010591599.2一种利用拉曼光谱仪定量检测痕量罗丹明6G的方法，包括以下步骤：采用交流电化学沉积法制备多个银纳米线阵列：以硝酸银/硼酸混合水溶液为电解液向AAO模板的孔洞中限域沉积银纳米线，形成银纳米线阵列；制备银纳米颗粒，并分别与不同浓度的罗丹明6G溶液混合，分别滴在制备好的银纳米线阵列上，形成SERS增强“三明治”体系；待“三明治”体系自然干燥后，在拉曼光谱仪上对其进行拉曼光谱测试，得到不同浓度罗丹明6G溶液的SERS谱；计算不同浓度罗丹明6G溶液SERS谱的特征峰强度，得到罗丹明6G的SERS强度-浓度的关系曲线，此曲线是作为罗丹明6G定量检测的依据；将未知浓度的罗丹明6G溶液SERS强度与罗丹明6G的SERS强度-浓度关系曲线进行对照，以得出罗丹明6G溶液的浓度。
但该方法测的是纯罗丹明6G。而不是混入食品中的罗丹明B。由于在实际食物样品中，食品加工企业在考虑到风味、口感、保质期等因素往往会添加各种食用添加剂及色素，这些基质的存在会对混入食品中的罗丹明B的检测照成巨大干扰，如果不经过任何前处理而直接采用检测标准品的方法进行检测，是无法检测出混入食品中的低浓度罗丹明B。本方法在考虑了上述问题之后，结合简便的液液萃取前处理方法及SERS检测方法实现了混入食物中罗丹明B的快速检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种罗丹明B的快速检测方法，以解决现有技术中存在的上述问题。
本发明提供的技术方案如下：
一种罗丹明B的快速检测方法，包括如下步骤：
（1）、提取：称取待测样品1份，加入4-10倍重量体积比的二次蒸馏水超声提取1-5min，提取液移至离心管，离心，将上清液取出备用；
（2）、净化：上清液加入2-5倍重量体积比的有机溶剂萃取，萃取完全后将有机溶剂层转移到离心管中，离心，再将有机溶剂层转移至试管中，吹干；
（3）、检测：往氮气吹干的试管中加入适量二次蒸馏水，震荡后取出放入玻璃检测池，之后加入10-100ul纳米粒子溶胶及适量无机盐絮凝剂，混匀，然后放在便携拉曼光谱仪检测室内进行检测。
其中，步骤（1）所述的待测样品包括辣椒（干辣椒、新鲜辣椒）、花椒、辣椒末、辣椒粉、豆瓣酱、辣椒面、辣椒油等市面上有可能被添加罗丹明B的食品。
其中，步骤（1）的离心优选在8000r/min-12000r/min下离心1-5min。
其中，步骤（2）有机溶剂优选为弱极性，其包括正丁醇、四氢呋喃、甲酸甲酯、乙酸乙酯、碳酸二甲酯、乙醚、异丙醚、正丁醚、三氯乙烯、二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、环己烷、正己烷、石油醚等中的至少一种。在以上溶剂中优选环己烷或己烷。
其中，步骤（2）的离心优选在8000r/min-12000r/min下离心1-8min。
其中，步骤（2）的吹干采用氮气或惰性气体。优选采用氮气。
其中，所述的纳米粒子溶胶包括裸露的纳米粒子或是SHINERS纳米粒子。其中，裸露的纳米粒子为拉曼光谱检测领域的现有技术，通常为金纳米粒子、银纳米粒子或是铜纳米粒子。SHINERS粒子（壳层隔绝纳米粒子增强拉曼光谱，Shell-isolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy，SHINERS)由厦门大学田中群等（Nature，464（7287）：392-395，2010.03.18）发明，在金属纳米粒子表面包覆一外壳材料，外壳材料为二氧化硅，氧化铝、氮化硅或二氧化钛等惰性材料。在该论文中，为无针孔的SHINERS粒子。本发明使用的另一SHINERS纳米粒子为在此基础上发展的带针孔的纳米粒子。
其中，所述的无机盐絮凝剂包括碘化钾、碘化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化铝、氯化钡、硫酸钾、硫酸钠、硫酸镁、磷酸钾、磷酸钠、碳酸钾或碳酸钠等溶液中的至少一种。
本发明的优点如下：
1、目前罗丹明B的检测中，在辣椒前处理方法上，行业标准是利用凝胶色谱净化，成本高；而商业公司常用的辣椒前处理方法主要是采用过固相萃取柱（SPE）方法，需经过活化-上样-清洗-解吸等步骤，要使用多种有机溶剂，有机溶剂使用量都在20-30ml左右，相对本发明方法，有机溶剂使用量较多，且为了获得较好的分离效果，在过柱时需控制流速，操作繁琐。本发明利用简单的液液萃取代替过SPE柱进行罗丹明B的净化、提纯。只需采用简单的液液萃取，并使用单一、少量的有机溶剂（仅需2-5ml），操作简便，容易上手，且有机溶剂使用量少，对人体、环境影响小，
2、可实现现场快速检测。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的具有针孔的纳米粒子的透射电子显微镜照片；
图2为本发明实施例2的检测结果图；
图3为本发明实施例3的检测结果图；
图4为本发明实施例4的检测结果图；
图5为本发明实施例5的检测结果图；
图6为本发明实施例6的检测结果图；
图7为本发明实施例7的检测结果图
其中，图3至图6中各样品由上至下列于图右上角、每个样品对应的光谱线也由上至下排列，同图2的对应关系。
具体实施方式
实施例1具有针孔的SHINNERS纳米粒子的制备
制备以金纳米粒子为内核，以二氧化硅为外壳的壳层纳米粒子的溶胶，且二氧化硅外壳上具备使金纳米粒子的内核表面裸露的针孔，该溶胶的溶剂为水。
取200mL质量分数为0.01%的氯金酸水溶液，搅拌条件下加热至沸腾，然后加入1.4mL质量分数为1%的拧棱酸纳水溶液，并保持微沸40min，溶液由淡黄色逐渐变为棕红色，使其完全反应后自然冷却至室温，即得直径约为55±10nm的金纳米粒子溶胶。取30mL金纳米粒子溶胶作为种子，加入0.2mL浓度为1mM的氨基硅烷水溶液，室温下搅拌15min，然后加入1.6mL质量分数为0.54%的硅酸钠水溶液，搅拌2分钟后转移至温度约为98℃的水浴中，反应30min后水浴冷却至室温，即得薄壳二氧化硅包金核壳结构纳米粒子溶胶，其中二氧化硅壳层厚度约为1-2nm。
如图1所示，本实施例制备的含针孔的壳层纳米粒子的金纳米粒子内核表面包覆上了一层厚度为1-2nm的二氧化硅薄壳层。
实施例2（湖南某质监局实际检测的样品；120nm shiners；图2）
1、提取（待测样品：辣椒末、辣椒粉、豆瓣酱）
称取辣椒末、辣椒粉或豆瓣酱1g（精确至0.01g）于25mL烧杯中，加入5mL二次水（提取剂）超声1min。浸泡液移至5mL离心管，在10000r/min下离心1min，将上清液取出待净化。
2、净化
将上清液移至25mL四氟分液漏斗中，加入3mL正己烷萃取。萃取时先振荡2min，静置1分钟后再振荡约2min。静置1min后将正己烷转移到5mL离心管中，在10000r/min下离心5min，将正己烷层转移至试管中，氮气吹干。
3、检测
往氮气吹干的试管中加入250ul二次水，震荡20s后取出放入玻璃检测池，之后加入10ul金属溶胶（55nm裸露的Au纳米粒子，现有技术）及无机盐絮凝剂10ul1M KI混匀，然后放在便携拉曼光谱仪检测室内进行检测，拉曼光谱仪功率60mw，激光波长785nm，扫描范围200-2000nm。结果见图2.
实施例3图3为湖南某质监局实际检测的样品；55nmAu-shiners；
1、提取（待测样品：辣椒末、辣椒粉、豆瓣酱）
称取辣椒末、辣椒粉或豆瓣酱1g（精确至0.01g）于25mL烧杯中，加入5mL二次水（提取剂）超声1min。浸泡液移至5mL离心管，在10000r/min下离心1min，将上清液取出待净化。
2、净化
将上清液移至25mL四氟分液漏斗中，加入3mL正己烷萃取。萃取时先振荡2min，静置1分钟后再振荡约2min。静置1min后将正己烷转移到5mL离心管中，在10000r/min下离心5min，将正己烷层转移至试管中，氮气吹干。
3、检测
往氮气吹干的试管中加入250ul二次水，震荡20s后取出放入玻璃检测池，之后加入10ul金属溶胶（实施例1制备的shiners粒子）及无机盐絮凝剂10ul1M KI混匀，然后放在便携拉曼光谱仪检测室内进行检测，拉曼光谱仪功率60mw，激光波长785nm，扫描范围200-2000nm。结果见图3.
实施例4图4为湖南某质监局实际检测的样品；120nm Ag检测；
1、（待测样品：辣椒末、辣椒粉、豆瓣酱）
称取辣椒末、辣椒粉或豆瓣酱1g（精确至0.01g）于25mL烧杯中，加入5mL二次水（提取剂）超声1min。浸泡液移至5mL离心管，在10000r/min下离心1min，将上清液取出待净化。
2、净化
将上清液移至25mL四氟分液漏斗中，加入3mL正己烷萃取。萃取时先振荡2min，静置1分钟后再振荡约2min。静置1min后将正己烷转移到5mL离心管中，在10000r/min下离心5min，将正己烷层转移至试管中，氮气吹干。
3、检测
往氮气吹干的试管中加入250ul二次水，震荡20s后取出放入玻璃检测池，之后加入10ul金属溶胶（120nm裸露的Ag纳米粒子，现有技术）及无机盐絮凝剂10ul1M KI混匀，然后放在便携拉曼光谱仪检测室内进行检测，拉曼光谱仪功率60mw，激光波长785nm，扫描范围200-2000nm。结果见图4.
实施例5为湖南某质监局实际检测的样品；120nm Ag检测；
1、提取（待测样品：辣椒末、辣椒粉、豆瓣酱）
称取辣椒末、辣椒粉或豆瓣酱1g（精确至0.01g）于25mL烧杯中，加入5mL二次水（提取剂）超声1min。浸泡液移至5mL离心管，在10000r/min下离心1min，将上清液取出待净化。
2、净化
将上清液移至25mL四氟分液漏斗中，加入3mL正己烷萃取。萃取时先振荡2min，静置1分钟后再振荡约2min。静置1min后将正己烷转移到5mL离心管中，在10000r/min下离心5min，将正己烷层转移至试管中，氮气吹干。
3、检测
往氮气吹干的试管中加入250ul二次水，震荡20s后取出放入玻璃检测池，之后加入10ul金属溶胶（120nm裸露的Au纳米粒子，现有技术）及无机盐絮凝剂10ul1M KI混匀，然后放在便携拉曼光谱仪检测室内进行检测，拉曼光谱仪功率60mw，激光波长785nm，扫描范围200-2000nm。结果见图5.
实施例6（图6为湖南某质监局实际检测的样品；55nm Au检测）
1、提取（待测样品：辣椒末、辣椒粉、豆瓣酱）
称取辣椒末、辣椒粉或豆瓣酱1g（精确至0.01g）于25mL烧杯中，加入5mL二次水（提取剂）超声1min。浸泡液移至5mL离心管，在10000r/min下离心1min，将上清液取出待净化。
2、净化
将上清液移至25mL四氟分液漏斗中，加入3mL正己烷萃取。萃取时先振荡2min，静置1分钟后再振荡约2min。静置1min后将正己烷转移到5mL离心管中，在10000r/min下离心5min，将正己烷层转移至试管中，氮气吹干。
3、检测
往氮气吹干的试管中加入250ul二次水，震荡20s后取出放入玻璃检测池，之后加入10ul金属溶胶（55nm裸露的Au纳米粒子，现有技术）及无机盐絮凝剂10ul1M KI混匀，然后放在便携拉曼光谱仪检测室内进行检测，拉曼光谱仪功率60mw，激光波长785nm，扫描范围200-2000nm。结果见图6.
实施例7（辣椒空白，图7）
1、提取
干辣椒剪碎，称取1g（精确至0.01g）于25mL烧杯中，加入5mL二次水（提取剂）超声1min。浸泡液移至5mL离心管，在10000r/min下离心1min，将上清液取出待净化。
2、净化
将上清液移至25mL四氟分液漏斗中，加入3mL正己烷萃取。萃取时先振荡2min，静置1分钟后再振荡约2min。静置1min后将正己烷转移到5mL离心管中，在10000r/min下离心5min，将正己烷层转移至试管中，氮气吹干。
3、检测
往氮气吹干的试管中加入250ul二次水，震荡20s后取出放入玻璃检测池，之后加入10ul金属溶胶（55nm裸露的Au纳米粒子，现有技术）及无机盐絮凝剂10ul1M KI混匀，然后放在便携拉曼光谱仪检测室内进行检测，拉曼光谱仪功率60mw，激光波长785nm，扫描范围200-2000nm。结果见图7。
上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
Claims (10)
1.一种罗丹明B的快速检测方法，包括如下步骤：
（1）、提取：称取待测样品1份，加入4-10倍重量体积比的二次蒸馏水超声提取1-5min，提取液移至离心管，离心，将上清液取出备用；
（2）、净化：上清液加入2-5倍重量体积比的有机溶剂萃取，萃取完全后将有机溶剂层转移到离心管中，离心，再将有机溶剂层转移至试管中，吹干；
（3）、检测：往氮气吹干的试管中加入适量二次蒸馏水，震荡后取出放入玻璃检测池，之后加入10-100ul纳米粒子溶胶及适量无机盐絮凝剂，混匀，然后放在便携拉曼光谱仪检测室内进行检测。
2.如权利要求1所述的一种罗丹明B的快速检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的待测样品包括辣椒、花椒、辣椒末、辣椒粉、豆瓣酱、辣椒面或辣椒油。
3.如权利要求1所述的一种罗丹明B的快速检测方法，其特征在于：步骤（1）在8000r/min-12000r/min下离心1-5min。
4.如权利要求1所述的一种罗丹明B的快速检测方法，其特征在于：步骤（2）有机溶剂包括正丁醇、四氢呋喃、甲酸甲酯、乙酸乙酯、碳酸二甲酯、乙醚、异丙醚、正丁醚、三氯乙烯、二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、环己烷、正己烷、石油醚等中的至少一种。
5.如权利要求1所述的一种罗丹明B的快速检测方法，其特征在于：步骤（2）的离心为8000r/min-12000r/min离心1-8min。
6.如权利要求1所述的一种罗丹明B的快速检测方法，其特征在于：步骤（2）有机溶剂采用环己烷或正己烷。
7.如权利要求1所述的一种罗丹明B的快速检测方法，其特征在于：步骤（2）的吹干采用氮气或惰性气体。
8.如权利要求1所述的一种罗丹明B的快速检测方法，其特征在于：所述的纳米粒子溶胶包括裸露的纳米粒子或是SHINERS纳米粒子。
9.如权利要求1所述的一种罗丹明B的快速检测方法，其特征在于：其中SHINERS纳米粒子为带针孔的纳米粒子；或是不带针孔的纳米粒子。
10.如权利要求1所述的一种罗丹明B的快速检测方法，其特征在于：所述的无机盐絮凝剂包括碘化钾、碘化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化铝、氯化钡、硫酸钾、硫酸钠、硫酸镁、磷酸钾、磷酸钠、碳酸钾或碳酸钠溶液中的至少一种。
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