CN104535554A - 表面增强拉曼光谱法测定辣椒制品中碱性橙ii的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种表面增强拉曼光谱法测定辣椒制品中碱性橙II的方法，包括以下步骤：将辣椒制品用甲醇溶解，超声提取后离心静置，过滤膜得到待测样品；在进样瓶中依次加入250～600μL的OTR202增强剂，10～50μL样品待测液和50～150μLOTR103增强剂混匀，此混合体积需≥0.5mL；设置拉曼光谱仪激光功率为50～200mW，分辨率为2cm^-1，信号相对强度范围为0～60000，积分时间为5～20s，积分1～3次平均，滤波器平滑参数为1；在表面增强拉曼光谱体系下，对食品中常见的非法添加剂碱性橙II进行拉曼光谱分析，找出其相应的拉曼光谱特征峰，以作为辣椒制品中非法添加碱性橙II的定性特峰，建立一种快速、简便、灵敏的表面增强拉曼光谱检测辣椒制品中碱性橙II的方法。

Description

表面增强拉曼光谱法测定辣椒制品中碱性橙II的方法

技术领域

本发明涉及食品添加剂领域，特别涉及一种应用表面增强拉曼光谱法测定辣椒制品中碱性橙II的方法。

背景技术

碱性橙II俗名“王金黄”、“块黄”，是一种碱性染料，化学名为2，4-二胺基偶氮苯，分子式为C₁₂H₁₂N₄·HCI，分子量为248.71。为带绿色光泽的黑色块状晶体或红褐色结晶性粉末，溶于水呈带黄的橙色；遇硝酸呈橙色；遇浓硫酸呈黄色，稀释后呈橙色。溶于乙醇，微溶于丙酮，不溶于苯，是一种偶氮类工业碱性染料，因为染色后不易脱落所以一般主要用于纺织品、皮革制品及木制品的染色。碱性橙II对人的神经系统和膀胱有致癌作用，美国卫生研究所(NIH)化学品健康与安全数据库资料显示该物质为致癌物，摄取、吸入或皮肤接触该物质均会造成急性或慢性中毒。

我国《食品添加剂使用卫生标准》中明确禁止碱性橙II作为食品添加剂在食品中的使用(中华人民共和国卫生部，2011)。因碱性橙II比其他水溶性染料如日落黄、柠檬黄等更易于在豆制品、辣椒制品和海产品上染色，且着色力更强不易脱色，价格也更低廉，且有报道碱性橙在食品中有良好的抗菌性及抗微生物等活性，所以一些不法生产商为美化食品外观，保持样品的新鲜持久性用碱性橙II充当食用色素广泛滥用，以假冒真，以次充好欺骗消费者，严重威胁了消费者的身体健康。

目前有关碱性橙的检测方法较多，常用检测方法是高效液相色谱法、液质联用色谱法、气质联用法、薄层色谱法、紫外-可见分光光度法和酶联免疫法等。然而这些检测方法各有优劣，有些精度高但仪器设备昂贵，且检测成本高，速度慢，不易携带，不易不同场合移动使用，对大批量的样品进行实时检测筛查困难，不能满足现场快速、大批量筛查不合格样品的需求。因此，建立快速、简便、实用、成本低、便携的碱性橙II检测方法具有重要意义。

表面增强拉曼光谱检测技术有样品处理简单，检测时间短，检测光谱所反映的信息量丰富，适合快速定性分析，在食品检测中具有一定优势。

发明内容

本发明提供了一种快速测定辣椒制品中碱性橙II的方法。在表面增强拉曼光谱体系下，对食品中常见的非法添加剂碱性橙II进行拉曼光谱分析，找出其相应的拉曼光谱特征峰，以作为辣椒制品中非法添加碱性橙II的定性特峰，建立一种快速，简便的表面增强拉曼光谱检测方法。

本发明的技术方案包括以下步骤：

(1)将辣椒制品用甲醇溶解，超声提取后离心静置，过滤膜得到待测样品；

(2)在进样瓶中依次加入250～600μL的OTR202增强剂，10～50μL样品待测液和50～150μLOTR103增强剂混匀，此混合体积需≥0.5mL。

(3)应用拉曼光谱仪测定所述进样瓶中的样品；设置拉曼光谱仪激光功率为50～200mW，分辨率为2cm^-1，信号相对强度范围为0～60000，积分时间为5～20s，积分1～3次平均，滤波器平滑参数为1；

若检测出碱性橙II的拉曼定性特征峰，则辣椒制品中含有碱性橙II；若没有出现碱性橙II的拉曼定性特征峰，则辣椒制品中不含有碱性橙II。

其中，所述碱性橙II的拉曼定性特征峰为517±3cm^-1，993±3cm^-1，1168±3cm^-1，1269±3cm^-1，1285±3cm^-1，1590±3cm^-1。

本发明中，若所述辣椒制品中含有油脂，则先加入甲醇，再加入正己烷混匀，超声提取后静置分层，弃正己烷层，然后在取甲醇提取液过膜上机分析。

更有选的，所述含有油脂的辣椒制品用正己烷重复脱油。

优选的，步骤(1)中，称2.00g辣椒制品于离心管中，加入5.00mL甲醇漩涡混匀，超声浸提5min，5000r/min离心4min，取出静置1min，取上清液过0.45μm的有机滤膜得到待测样品。

本发明中应用表面增强拉曼光谱法测定辣椒制品中碱性橙II，方法简单、快速、高效，加标回收都达到85％以上，辣椒制品中的碱性橙基本都能提取出来。灵敏度高，此方法中表面增强拉曼光谱对甲醇溶液中碱性橙的检测达到2mg/kg，但有基质的情况下，在辣椒制品中最低的检出浓度为50mg/kg，可以用于现场辣椒制品中碱性橙II添加含量大于50mg/kg的快速定性检测。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明：

图1为高效液相色谱碱性橙II的标准曲线；

图2为样品中碱性橙II与标样的高效液相色谱图；

图3为碱性橙II的表面增强拉曼光谱图；

图4为碱性橙II和样品表面增强拉曼光谱图对比；

图5为甲醇配制的标样与基质加标的碱性橙II拉曼光谱图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

1.1仪器及设备

高效液相色谱仪器:Agilent 1100，配有DAD检测器、自动进样器、化学工作站，美国安捷伦科技有限公司；

-200型便携式拉曼光谱仪，欧普图斯(苏州)光学纳米科技有限公司；

旋涡混合器:XW-80A，常州诺基仪器有限公司。

1.2试剂及样品

碱性橙II标准物质，99％，中国药品生物制品检定所；

甲醇，色谱纯，德国默克公司；

OTR202，欧普图斯(苏州)光学纳米科技有限公司；

OTR103，欧普图斯(苏州)光学纳米科技有限公司；

辣椒制品，购于超市。

1.3实验方法

1.3.1标准溶液的配制

标准储备液的配制：准确称取0.1002g碱性橙II标准品于100.00mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即配得1.00mg/mL的碱性橙II标准储备液，密封于4℃冰箱中保存，备用。

高效液相色谱法的标准工作溶液的配制：分别准确吸取0.10、0.50、1.00、2.50、5.00mL碱性橙II标准储备液于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即配得1.00、5.00、10.00、25.00、50.00μg/mL的碱性橙II标准工作溶液，作为高效液相色谱法的待测标准溶液。

拉曼光谱法的标准工作溶液的配制：准确吸取1.00mL碱性橙II标准储备液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，配得100.00μg/mL的碱性橙II标准溶液。再分别准确吸取0.10、0.50、1.00mL浓度为100.00μg/mL的碱性橙II标准溶液于10.00mL容量瓶中，用不含碱性橙II的辣椒样品提取液定容至刻度，摇匀，即配得1.00、5.00、10.00μg/mL的碱性橙II标准工作溶液，作为拉曼光谱法的待测标准溶液。

1.3.2样品前处理方法

准确称2.00g辣椒粉于15mL塑料离心管中，加入5.00mL甲醇漩涡混匀，超声浸提5min，5000r/min离心4min，取出静置1min，取上清液过0.45μm的有机滤膜，待测。

含油脂的辣椒制品则先加入甲醇，再加入5mL正己烷漩涡混匀，超声提取后静置分层，弃正己烷层，再重复脱油一次，然后在取甲醇提取液过膜上机分析。

1.3.3SERS的样品检测方法

(1)标样检测：在2.0mL玻璃进样瓶中依次加入500.0μL OTR202增强剂、20.0μL拉曼光谱法的待测标准溶液、100.0μL OTR103增强试剂，漩涡混均匀后，放入样品池测定。

(2)样品检测：在2.0mL玻璃进样瓶中依次加入500.0μL OTR202增强剂、20.0μL样品待测液、100.0μL OTR103增强试剂，漩涡混均匀后，放入样品池测定。

3.1.3.4HPLC与SERS的仪器检测条件

(1)HPLC检测条件

色谱柱：ZORBAX C18150mm×4.6mm×5μm；流动相：甲醇/乙酸铵(65/35)；DAD检测器；检测波长449nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：10.0μL。

(2)SERS检测条件

光谱仪激光功率为200mW；分辨率为2cm^-1；信号相对强度范围为0～60000；积分时间为10s；积分2次平均；滤波器平滑参数为1。

1.3.5HPLC回收率和精密度实验

称取一定质量不含碱性橙II的辣椒粉样品，并在其中分别加入2.00mg/kg、5.00mg/kg和10.00mg/kg三个不同浓度的碱性橙II标准溶液，用高效液相色谱测定，分别进行6次平行实验。

1.3.6HPLC的方法检出限

根据式(1)计算方法的检出限。

LOD＝3CVf/(S/N)m  (1)

式中：C—为进样浓度(单位μg/mL)；

V—为定容体积(单位mL)；

f—稀释倍数；

S/N—为信噪比(可通过工作站对图谱进行自动分析获得)；

m—质量(单位g)。

1.3.7SERS检出限

取1.3.1中配制的不同浓度碱性橙II拉曼标准溶液液添加于辣椒粉中，混匀，用拉曼光谱进行检测，其最小检出浓度即为本方法的检出限。

2结果与分析

2.1标准曲线的绘制及色谱图

将配制的碱性橙II标准溶液从低浓度到高浓度分别取10μL，用高效液相色谱测定，根据保留时间定性，峰面积定量，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制碱性橙II的标准曲线，见图1。从图1中可看出：碱性橙II的标准工作浓度在1～50μg/mL范围内具有很好的线性关系，相关系数为0.999。

标样色谱图和样品图见图2。在图2中，从上至下依次为：不含碱性橙II的样品色谱图、含有碱性橙II(0.23mg/kg)的样品色谱图、碱性橙II标准溶液(10.0ug/ml)色谱图。从图中可以看出：碱性橙II在4.0min左右出峰，此目标物与杂质分离较好，可判断出辣椒粉中是否含有碱性橙II色素。因此，拉曼光谱可作为碱性橙II的定性检测。

2.2方法回收率和精密度实验

碱性橙II的加标回收率及精密度的结果如下表。

表1回收率和精密度(n＝6)

从表1可看出，在不同加标浓度下，碱性橙II的平均回收率为85.5％～97.0％，RSD为3.6％～5.6％。该方法回收率高，精密度好，完全满足实验要求。

2.3HPLC方法的检出限

根据LOD＝3CVf/(S/N)m计算方法的检出限。

式中：C＝10.00，进样的溶液浓度为10.00μg/mL；V＝5.00，定容体积为5.00mL；F＝1.0，稀释倍数为1.0倍；S/N＝445，在C＝10.00μg/mL时所对应的信号噪声比值为445；m＝2.00，称样质量为2.00g。根据LOD＝3CVf/(S/N)m计算得HPLC的方法检测限为0.2mg/kg。

2.4碱性橙II的表面增强拉曼光谱图特征峰选择

配制一系列浓度的碱性橙II标准溶液并进行拉曼光谱扫描，找出相应的特征峰。从图3可以看出，随着标样浓度增大，除473cm^-1外，517cm^-1，993cm^-1，1168cm^-1，1269cm^-1，1285cm^-1，1590cm^-1的波数位置都相应的变大，所以可以选择响应值比较好的波数为517±3cm^-1，993±3cm^-1，1168±3cm^-1，1269±3cm^-1，1285±3cm^-1，1590±3cm^-1的特征峰为碱性橙II的拉曼特征峰。只要样品中同时检测到这几个拉曼特征峰，就说明此样品含有碱性橙II，据此，可以对碱性橙II进行定性分析。

2.5碱性橙II和样品表面增强拉曼光谱图对比

在图4中，结合碱性橙II的特征峰，可以看出样品中含有碱性橙，此方法可为辣椒制品中是否添加碱性橙II的定性判定提供依据。

2.6甲醇溶剂与基质对碱性橙II的影响

从图5中可以看出，同一浓度不同基质对碱性橙响应值的影响较大，所以在检测分析样品时，需要考虑不同基质对目标物相应值的影响，必要时需要用基质加标加以校正。

2.7碱性橙II的检出限

取辣椒提取液配制的碱性橙II号最低响应浓度20μg/mL进行计算，得出SERS碱性橙II的SERS检出限为50mg/kg。

3小结

(1)辣椒制品中的碱性橙用甲醇溶解，超声提取后离心静置，直接过膜上液相检测。含油脂的辣椒制品则先加入甲醇，再加入5mL正己烷漩涡混匀，超声提取后静置分层，弃正己烷层，再重复脱油一次，然后在取甲醇提取液过膜上机分析。此提取方法操作简单，快捷，高效，加标回收都达到85％以上，表明辣椒制品中的碱性橙基本都能提取出来。同时，由于高效液相的灵敏度较高，碱性橙的检出限达到0.2mg/kg以上，为定性定量检测提供了扎实的基础，同时也为表面增强拉曼光谱对辣椒制品中是否含有碱性橙物质提供有力的依据。

(2)经分析，用拉曼峰为517±3cm^-1，993±3cm^-1，1168±3cm^-1，1269±3cm^-1，1285±3cm^-1，1590±3cm^-1作为碱性橙II的拉曼定性特征峰。此方法中表面增强拉曼光谱对甲醇溶液中碱性橙的检测达到2mg/kg，但由于基质的干扰，在辣椒制品中最低的检出浓度为50mg/kg，所以检测样品时需要用液相检测不含碱性橙的样品提取液进行基质加标，用于和样品中是否含有碱性橙进行比对并进行定性分析。

(3)实验表明，表面增强拉曼光谱在辣椒制品中对非法添加物碱性橙II的含量达50mg/kg时，其定性结果与液相色谱一致，可以用于现场辣椒制品中碱性橙II添加含量大于50mg/kg的快速定性检测。

上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.表面增强拉曼光谱法测定辣椒制品中碱性橙II的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将辣椒制品用甲醇溶解，超声提取后离心静置，过滤膜得到待测样品；

(2)在进样瓶中依次加入250～600μL的OTR202增强剂，10～50μL样品待测液和50～150μLOTR103增强剂混匀，此混合体积需≥0.5mL；

(3)应用拉曼光谱仪测定所述进样瓶中的样品；

若检测出碱性橙II的拉曼定性特征峰，则辣椒制品中含有碱性橙II；若没有出现碱性橙II的拉曼定性特征峰，则辣椒制品中不含有碱性橙II；

其中所述碱性橙II的拉曼定性特征峰为517±3cm^-1，993±3cm^-1，1168±3cm^-1，1269±3cm^-1，1285±3cm^-1和1590±3cm^-1。

2.根据权利要求1所述的表面增强拉曼光谱法测定辣椒制品中碱性橙II的方法，其特征在于，若所述辣椒制品中含有油脂，则先加入甲醇，再加入正己烷混匀，超声提取后静置分层，弃正己烷层，然后在取甲醇提取液过膜上机分析。

3.根据权利要求3所述的表面增强拉曼光谱法测定辣椒制品中碱性橙II的方法，其特征在于，所述含有油脂的辣椒制品用正己烷重复脱油。

4.根据权利要求1所述的表面增强拉曼光谱法测定辣椒制品中碱性橙II的方法，其特征在于，步骤(1)中，称2.00g辣椒制品于离心管中，加入5.00mL甲醇漩涡混匀，超声浸提5min，5000r/min离心4min，取出静置1min，取上清液过0.45μm的有机滤膜得到待测样品。

5.根据权利要求1所述的表面增强拉曼光谱法测定辣椒制品中碱性橙II的方法，其特征在于，步骤(3)中，设置拉曼光谱仪激光功率为50～200mW，分辨率为2cm^-1，信号相对强度范围为0～60000，积分时间为5～20s，积分1～3次平均，滤波器平滑参数为1。