CN104031858A - 一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法。对其进行温度控制和适应性驯化，驯化采用时间和温度相结合控制的方法，大大提高了植源乳酸菌制备的高活性、安全性，适应性，并且操作简便，降低了技术成本，提高植源乳酸菌适应性能力。一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法为：(1)将通过筛选的植物源菌株CCTCC No.M204051进行常规斜面培养活化和种子培养，得到种子培养液，对种子培养液进行不高于45度的温度控制，添加种子培养液体积百分比2%—5%的柠檬酸进行适应性训化；(2)然后配制发酵培养基，并经灭菌后接种芽孢杆菌菌种和上述种子培养液，再用高速剪切机进行剪切，得到菌落；(3)然后对菌落进行太阳能、外加热源发酵，得到菌泥；(4)对菌泥进行膜包覆处理和干燥。

Description

一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法

一、技术领域：

本发明具体涉及一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法。

二、背景技术：

背景技术中，根据我国传统的植源乳酸菌制备方法，很难满足市场对植源乳酸菌的大量需求，植源乳酸菌能改善人体肠道微生态平衡预防肠道致病菌的感染，提高人体免疫力.也可用于动植物营养和环境治保。但是市场上的绝大多数微生物制剂多为芽孢杆菌和酵母菌为主，很难找到具有靶向性植源乳酸菌的踪迹，存在“主角缺失、配角登台”的遗憾，国外的植源乳酸菌市场虽说起源比国内要早，但也不能适应绿色消费趋势。造成市场上植源乳酸菌几乎无货可供的局面的原因有两个：①植源乳酸菌难以大规模扩繁获得，生产难度大，技术成本高；②更重要的原因是难以贮存，容易失活。因此我们需要创新一种新型的靶向性植源乳酸菌制备方法，在核心技术上突出表现为可以人为调控植源乳酸菌制备的温度和适性能力，从而最大限度的保证其生物活性及抗逆性，使植源乳酸菌的制备实现规范性.高活性、安全性，并且操作简便，大大降低技术成本和提高适性能力。

三、发明内容：

本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法，对其进行温度控制和适应性驯化，驯化采用时间和温度相结合控制的方法，大大提高了植源乳酸菌制备的高活性、安全性，适应性，并且操作简便，降低了技术成本，提高植源乳酸菌适应性能力。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 ：（与权利要求书相同）

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：本发明的菌株HSC235，菌体得率高，菌体OD值在2～6.35，所得活菌数可达1050个/g；所得菌体具有转化亚油酸生成共轭亚油酸的能力；亚油酸采用促溶剂进行保护溶解，降低其对细胞生长的抑制作用，另一方面增强了其诱导作用，提高了转化率，其对亚油酸的转化率可达16％～43％(底物质量转化率)；且发酵温度低，降低了能耗，节省成本。采用本发明所得乳酸菌粉可作为益生菌在食品、动植物营养、土壤改良、水质净化等方面使用，以提高突宿主体内共轭亚油酸的含量。

四、具体实施方式：

本发明的能有效转化亚油酸为共轭亚油酸的新的微生物菌株，是乳杆菌属(Lactobacillus)的植物乳杆菌一个种：HSC235(Lactobacillusplantarum HSC 235)，此菌株是从天然发酵的植物中采用MRS乳酸菌培养分离筛选得到。此菌株己于2004年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保存号CCTCC No.M204051。此菌株的细菌学特征如下：(1)形态：①细条状，直径0.48微米～0.83微米，长0.8微米～5.2微米；②在培养初始阶段，细胞呈长杆状；③具有耐酸性；④游动性：静止；⑤孢子形成：不形成孢子；⑥革兰氏染色实验呈阳性；。(2)在各种培养基上生长状态(30℃)：①MRS琼脂平板培养基：生长不良，菌落呈圆形，不规则，表面光滑，乳白色；②MRS琼脂斜面培养基：生长不良，无光泽，乳白色；③MRS液体培养基：生长良好，液体混浊，有沉淀。(3)生理特征：1)木糖：+2)海藻糖：+3)单糖：+4)山梨醇：+5)水杨苷：+6)核糖：+7)鼠李糖：-8)棉子糖：+9)密二糖：+10)甘露糖：+11)甘露醇：+12)麦芽糖：+13)乳糖：+14)葡萄糖酸盐：+15)半乳糖：+16)果糖：+17)七叶灵：+18)纤维二糖：+19)阿拉伯糖：+20)苦杏仁苷：+21)乳酸旋光性：DL22)接触酶：-23)产吲哚能力：-24)分解酪素：-根据以上细菌学特征，以及此菌株HSC235培养物基于其对底物的利用情况可确定为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。该菌种在MRS培养基上保藏，通常所用的培养基含有：碳源(例如葡萄糖、乳糖、乳清)，氮源(如)，有机营养物质(如酵母抽提物，蛋白胨，胰白胨，植物蛋白胨，牛肉膏，玉米浆)，无机营养成分(如磷酸盐、镁、钾、锌、铁、钴和锰)，及作为诱导物质的亚油酸，或者含亚油酸的其它物质，或者亚油酸结构类似物等。在20℃～40℃培养温度下均能生长，最适的生长温度为27.5℃～38℃。培养条件：pH值4.0～7.0，最适的生长pH值为6.0～6.6。该菌种在含明亚油酸的MRS培养基上厌氧条件下培养1天～4天，所得细胞具有转化亚油酸及亚油酸类物质为共扼亚油酸的能力。

本发明对其进行温度控制和适应性驯化，驯化采用时间和温度相结合控制的方法，大大提高了植源乳酸菌制备的高活性、安全性，适应性，并且操作简便，降低了技术成本，提高植源乳酸菌适应性能力。

发酵工艺：按上述配方配制10L发酵液于发酵罐中，经灭菌后接种子培养液，菌种的接种量为培养基溶液的5％，即500mL，光密度(OD值)为1；将10L发酵培养基所需的亚油酸溶解或包埋在环糊精中，添加入发酵液中，控制发酵液中亚油酸初始浓度诱导浓度为0.2g/L；剩余的亚油酸在发酵过程中再添加入发酵液中；用氢氧化钠来调节pH6.0，开始培养发酵；在开始培养发酵6h后把葡萄糖100g(首先配制成30％的溶液消毒)慢速加入发酵罐，在48h内加完；在接种子液培养发酵12h后，将剩余的溶解或包埋在环糊精中的亚油酸量，分三次间歇补加入发酵液中，48h内加完，发酵液中亚油酸的总加入量为8g/L；继续发酵，总时间为60h，整个发酵过程中长菌培养及诱导温度控制在30℃左右；发酵过程中采用氢氧化钠和盐酸调节pH，使发酵过程中的pH值维持在6.0～6.6之间。

实施例1 ：一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法为：

(1)将通过筛选的植物源菌株CCTCC No.M204051进行常规斜面培养活化和种子培养，得到种子培养液，对种子培养液进行不高于45度的温度控制，添加种子培养液体积百分比2%—5%的柠檬酸进行适应性训化；

(2) 然后配制发酵培养基，并经灭菌后接种芽孢杆菌菌种和上述种子培养液，再用高速剪切机进行剪切，得到菌落；

发酵培养基的配方为：蛋白胨5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏1g/L、葡萄糖2g/L、乙酸钠2g/L、吐温80 1g/L、硫酸铁1g/L、硫酸锰1g/L、柠檬酸三胺2g/L，余量为水。

(3) 然后对菌落进行太阳能、外加热源发酵，得到菌泥；

a.接种子液，接种量为发酵培养基溶液体积比的的5％～15％，种子液的光密度为1～3；

b.发酵过程中，长菌温度为28℃～30℃，时间为60h～66h；

c.采取慢速加糖方式，发总发酵液体积为10升，加糖量为100g-350g，且在接种后6h开始，在48h内加完；

d.上述发酵培养基中亚油酸不能直接加入，而经与分散剂混合后才能加入，且控制发酵液中亚油酸的浓度，采用缓慢加入的方式；

e.发酵过程中采用添加氢氧化钠和盐酸自动平衡调节pH值，使pH值维持在6.0～6.6之间。

(4) 对菌泥进行膜包覆处理和干燥。

发酵液通过高速冷冻离心机用去离子无菌水洗涤三次，洗涤时转子的速度为7000转/分，时间为20min，温度为4℃，离心收集细胞，加保护剂，真空冷冻干燥，即得植源乳酸菌。

所述的保护剂为甘油。

所述的分散剂为乙醚。

所述的亚油酸的浓度30%-50%。

实施例2 ：一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法为：

(1)将通过筛选的植物源菌株CCTCC No.M204051进行常规斜面培养活化和种子培养，得到种子培养液，对种子培养液进行不高于45度的温度控制，添加种子培养液体积百分比2%—5%的柠檬酸进行适应性训化；

(2) 然后配制发酵培养基，并经灭菌后接种芽孢杆菌菌种和上述种子培养液，再用高速剪切机进行剪切，得到菌落；

发酵培养基的配方为：蛋白胨12g/L、酵母膏5g/L、牛肉膏3g/L、葡萄糖8g/L、乙酸钠8g/L、吐温80 5g/L、硫酸铁3g/L、硫酸锰3g/L、柠檬酸三胺5g/L，余量为水。

(3) 然后对菌落进行太阳能、外加热源发酵，得到菌泥；

a.接种子液，接种量为发酵培养基溶液体积比的的5％～15％，种子液的光密度为1～3；

b.发酵过程中，长菌温度为28℃～30℃，时间为60h～66h；

c.采取慢速加糖方式，发总发酵液体积为10升，加糖量为100g-350g，且在接种后6h开始，在48h内加完；

d.上述发酵培养基中亚油酸不能直接加入，而经与分散剂混合后才能加入，且控制发酵液中亚油酸的浓度，采用缓慢加入的方式；

e.发酵过程中采用添加氢氧化钠和盐酸自动平衡调节pH值，使pH值维持在6.0～6.6之间。

(4) 对菌泥进行膜包覆处理和干燥。

发酵液通过高速冷冻离心机用去离子无菌水洗涤三次，洗涤时转子的速度为7000转/分，时间为20min，温度为4℃，离心收集细胞，加保护剂，真空冷冻干燥，即得植源乳酸菌。

所述的保护剂为脱脂奶粉。

所述的分散剂为乙醚。

所述的亚油酸的浓度30%-50%。

实施例3 ：一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法为：

(1)将通过筛选的植物源菌株CCTCC No.M204051进行常规斜面培养活化和种子培养，得到种子培养液，对种子培养液进行不高于45度的温度控制，添加种子培养液体积百分比2%—5%的柠檬酸进行适应性训化；

(2) 然后配制发酵培养基，并经灭菌后接种芽孢杆菌菌种和上述种子培养液，再用高速剪切机进行剪切，得到菌落；

发酵培养基的配方为：蛋白胨8g/L、酵母膏3g/L、牛肉膏2g/L、葡萄糖5g/L、乙酸钠6g/L、吐温80 4g/L、硫酸铁2g/L、硫酸锰2g/L、柠檬酸三胺3g/L，余量为水。

(3) 然后对菌落进行太阳能、外加热源发酵，得到菌泥；

a.接种子液，接种量为发酵培养基溶液体积比的的5％～15％，种子液的光密度为1～3；

b.发酵过程中，长菌温度为28℃～30℃，时间为60h～66h；

c.采取慢速加糖方式，发总发酵液体积为10升，加糖量为100g-350g，且在接种后6h开始，在48h内加完；

d.上述发酵培养基中亚油酸不能直接加入，而经与分散剂混合后才能加入，且控制发酵液中亚油酸的浓度，采用缓慢加入的方式；

e.发酵过程中采用添加氢氧化钠和盐酸自动平衡调节pH值，使pH值维持在6.0～6.6之间。

(4) 对菌泥进行膜包覆处理和干燥。

发酵液通过高速冷冻离心机用去离子无菌水洗涤三次，洗涤时转子的速度为7000转/分，时间为20min，温度为4℃，离心收集细胞，加保护剂，真空冷冻干燥，即得乳酸菌吧。

所述的保护剂为海藻糖。

所述的分散剂为乙醚。

所述的亚油酸的浓度30%-50%。

实施例4 ：一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法为：

(1)将通过筛选的植物源菌株CCTCC No.M204051进行常规斜面培养活化和种子培养，得到种子培养液，对种子培养液进行不高于45度的温度控制，添加种子培养液体积百分比2%—5%的柠檬酸进行适应性训化；

(2) 然后配制发酵培养基，并经灭菌后接种芽孢杆菌菌种和上述种子培养液，再用高速剪切机进行剪切，得到菌落；

发酵培养基的配方为：蛋白胨7g/L、酵母膏5g/L、牛肉膏1g/L、葡萄糖4g/L、乙酸钠7g/L、吐温80 5g/L、硫酸铁2g/L、硫酸锰1g/L、柠檬酸三胺3g/L，余量为水。

(3) 然后对菌落进行太阳能、外加热源发酵，得到菌泥；

a.接种子液，接种量为发酵培养基溶液体积比的的5％～15％，种子液的光密度为1～3；

b.发酵过程中，长菌温度为28℃～30℃，时间为60h～66h；

c.采取慢速加糖方式，发总发酵液体积为10升，加糖量为100g-350g，且在接种后6h开始，在48h内加完；

d.上述发酵培养基中亚油酸不能直接加入，而经与分散剂混合后才能加入，且控制发酵液中亚油酸的浓度，采用缓慢加入的方式；

e.发酵过程中采用添加氢氧化钠和盐酸自动平衡调节pH值，使pH值维持在6.0～6.6之间。

(4) 对菌泥进行膜包覆处理和干燥。

发酵液通过高速冷冻离心机用去离子无菌水洗涤三次，洗涤时转子的速度为7000转/分，时间为20min，温度为4℃，离心收集细胞，加保护剂，真空冷冻干燥，即得乳酸菌吧。

所述的保护剂为甘露醇。

所述的分散剂为乙醚。

所述的亚油酸的浓度30%-50%。

试验例（根据实施例1制得的产物）：

1、试验目的

验证本发明对苹果生长发育的作用及增产效果进行比较，为此植物靶向乳酸菌在乳酸菌市场上大力推广提供科学依据。

2、试验时间与地点

试验2012年4—10月份安排在杜康镇后洼村进行实施。

3、试验地概况

试验果园海拔858m，地势平坦，土壤类型为黄绵土，质地：壤土类，地力等级2级。面积8亩，品种：红富士，树龄15年，树势整齐一致，管理水平较高。试验处理前采集0—40cm土样，化验测得土壤基本养分状况如下表1：

4、试验设计与处理

4.1实验设计

试验设三个处理，采用随机排列，三次重复，每个处理5棵树。

4.2试验处理：

①施用含有此植物靶向乳酸菌的肥料120公斤∕亩

②施用同类型普通肥料120公斤∕亩

③（CK）不施肥

5、试验实施及田间管理

5.1试验实施：

试验含有此植物靶向乳酸菌的肥料，在苹果生长发育的幼果期、果实膨大期、着色期各喷施一次。

5.2田间管理：

试验果园4-8月份喷药防治病虫害6次，中耕除草4次，前期灌水2次。

6、2012年度气候特点与苹果生长发育

6.1降水：2012年在苹果生育期共降水570.5mm，较历年同期370.6mm多199.9mm，1-6月份降雨量较少，7、8、9三个月降水偏多。

6.2光照：2012年4-10月份光照时数1135小时，比历年同期1270.3小时，减少135小时。总之，苹果生育期降雨量偏多，温度适中，光照适宜，气候有利于苹果的生长发育和试验的植物靶向乳酸菌肥料效果的发挥。

7实验结果分析

7.1对产量的影响

从表2看：对照亩产量2447公斤，施用含有植物靶向植源乳酸菌肥料的亩产量为2840.3公斤，较对照增产16.1％；施用同类型普通肥料产量为2625.3公斤，较对照增产7.2％.从表3、4、5看，不同处理均有增产效果，尤以含有植物靶向植源乳酸菌肥料增产效果最佳。

7.2对果树生物学性状的影响

从表8看：苹果施用含有植物靶向植源乳酸菌肥料后，百叶鲜重较对照增产12.3g，叶面积比对照增加4.27cm² ，花芽形成数较对照增加13个。

7.3对苹果品质的影响

从表6看：苹果施用含有植物靶向植源乳酸菌肥料后，苹果苹果纵横较对照增加10×10，色度较对照增加30.6%，硬度较对照增加2.4%，糖度较对照增加9.6%，酸度较对照减少9.5%；从表7看，苹果单果重量较对照增加38.6g.

7.4对供试果园土壤基本养分状况的影响

从表1和表9看：供试果园施用含有土壤修复活性菌群肥料后有机质增加0.2%，碱解氮增加0.2%，速效磷减少0.2%，速效钾减少0.1%。

8、结论和建议

8.1结论：苹果施用含有植物靶向乳酸菌肥料后，养分释放与植物吸收同步，树势生长健壮，叶片深绿，抗逆性强，增产效果显著，专家审定为平衡营养具有体质增效的作用，为环境友好型产品。

8.2建议：该植物靶向行乳酸菌在苹果上试验效果证明，平衡营养效果明显，下年可扩大示范并且在不同领域推广应用。

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Claims (7)

1.一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法：其特征在于：所述的制备方法为：(1)将通过筛选的植物源菌株CCTCC No.M204051进行常规斜面培养活化和种子培养，得到种子培养液，对种子培养液进行不高于45度的温度控制，添加种子培养液体积百分比2%—5%的柠檬酸进行适应性训化；

(2) 然后配制发酵培养基，并经灭菌后接种芽孢杆菌菌种和上述种子培养液，再用高速剪切机进行剪切，得到菌落；

(3) 然后对菌落进行太阳能、外加热源发酵，得到菌泥；

(4) 对菌泥进行膜包覆处理和干燥。

2.根据权利要求1所述的一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法：其特征在于：所述的步骤（2）中的发酵培养基的配方为：蛋白胨5-12g/L、酵母膏2-5g/L、牛肉膏1-3g/L、葡萄糖2-8g/L、乙酸钠2-8g/L、吐温80 1—5g/L、硫酸铁1-3g/L、硫酸锰1-3g/L、柠檬酸三胺2—5g/L，余量为水。

3.根据权利要求1所述的一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法：其特征在于：所述的步骤(3)的工艺流程中：

a.接种子液，接种量为发酵培养基溶液体积比的的5％～15％，种子液的光密度为1～3；

b.发酵过程中，长菌温度为28℃～30℃，时间为60h～66h；

c.采取慢速加糖方式，发总发酵液体积为10升，加糖量为100g-350g，且在接种后6h开始，在48h内加完；

d.上述发酵培养基中亚油酸不能直接加入，而经与分散剂混合后才能加入，且控制发酵液中亚油酸的浓度，采用缓慢加入的方式；

e.发酵过程中采用添加氢氧化钠和盐酸自动平衡调节pH值，使pH值维持在6.0～6.6之间。

4.根据权利要求1所述的一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法：其特征在于：所述的步骤（4）菌泥收集和干燥：发酵液通过高速冷冻离心机用去离子无菌水洗涤三次，洗涤时转子的速度为7000转/分，时间为20min，温度为4℃，离心收集细胞，加保护剂，真空冷冻干燥，即得植物乳酸菌。

5.根据权利要求1所述的一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法：其特征在于：所述的保护剂为甘油、脱脂奶粉、海藻糖或甘露醇。

6.根据权利要求1所述的一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法：其特征在于：所述的分散剂为乙醚。

7.根据权利要求1所述的一种植物源靶向植源乳酸菌的制备方法：其特征在于：所述的亚油酸的浓度30%-50%。