CN104025989B - 一种浮萍活体材料保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种浮萍活体材料的保存方法。针对现有技术中浮萍种质资源的保存方法存在易感染藻类、受自然生长季节的限制、成本高，不能随时为精细实验提供清洁的研究用材的缺陷，本发明提供了一种浮萍活体材料的保存方法。本方法在培养容器内将浮萍与满江红共同培养，培养容器置于自然环境。在优选条件下控制浮萍与满江红株数比为2:1～4:1，采用20倍～30倍稀释的Hogland标准营养液作为初始培养液，培养过程中适量添加自来水。本发明方法能够长期有效防止浮萍活体保存中因感染藻类造成的污染，为精细实验提供清洁的研究用材；本方法还能随时保持浮萍自然形态，以随时满足科学实验研究用材的需要。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物材料保存方法，特别是涉及一种浮萍活体材料的保存方法。属于植物种质资源保存、水生种子植物保存、培养技术领域。
背景技术
浮萍，泛指传统植物分类系统中浮萍科(Lemnaceae)、现在APGIII分类系统中天南星科(Araceae)中的多种不同属种，如绿萍(Lemnaminor)、多根紫萍(Spirodela polyrhiza)等。浮萍是最小的开花植物，具有很高的基础研究价值。浮萍更是重要的生物资源，其作为新型能源资源和生态环境综合治理的高效植物已引起科学家的广泛关注。美国能源部(USDOE)已将浮萍列为最具发展潜力的新型能源植物之一。因此，浮萍除具备基础研究价值外，同时具有很高的资源开发应用价值。
由于浮萍主要依靠无性繁殖，野外难以收集到种子，因而浮萍种质资源的保存方式较为独特。传统的依靠植物种子来保存种质资源的方法基本不可能，因此，活体材料的收集与保存尤为重要。
浮萍活体材料的保存方法目前主要有水培法、底泥沉积保存法、人工气候箱-固体培养基无菌保存方法。这些方法均存在较多缺陷：
常规的水培法在培养几天后，极容易感染以丝状绿藻为主的各种藻类。藻类附在浮萍表面的藻类很难去除，影响浮萍生长。并且，感染藻类的浮萍不能成为比较精细的生物学实验特别是分子生物学实验的合格研究材料。
底泥沉积保存法是将浮萍用池塘的底泥包裹，存于水底，春天来临时，将其取出培养的方法。在将浮萍用于养殖材料大规模培养时，多在秋天将其存入底泥，春天自行生长繁殖。该方法比较简便，但取用正常形态的浮萍植物材料时，需要培养至少两个星期的时间，该培养方法常常受自然生长季节的限制，在后来的水体培养中，仍然容易感染绿藻。
人工气候箱-固体培养基无菌保存方法能够满足精细实验的要求，但该方法需要定期转培养，对管理人员的技术要求较高，管理程序较为繁琐，且对人工气候箱等仪器的依赖性较强，材料保存成本较高，也不易扩大保存量。尤其是近年的研究发现，固体培养基保存的浮萍因适应于这种营养富足、水分较少的环境，其形态特征已完全改变，无法直接观察浮萍的自然形态，也无法直接获得自然生长状态下的生理生态和形态指标(液体培养基)。对于急需观察浮萍自然生长的生物学特征等研究项目，需要将浮萍从无菌培养基中取出，用液体进行培养，但在培养过程中，又容易感染绿藻。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种浮萍活体材料的保存方法。该方法能够有效防止浮萍活体保存中因感染藻类造成的污染，为精细实验提供清洁的研究用材；该方法还能随时保持浮萍自然形态，以随时满足科学实验研究的需要。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种浮萍活体材料保存方法，其特征在于：在培养容器内将浮萍与满江红(Azolla imbricata)共同培养，所述培养容器置于自然环境。
浮萍与满江红都是常见且相似的水生植物，常伴生。由于两者对生态因子需求相似、适生环境相似，因此，在现有的浮萍人工培育技术中，满江红被视为重要“杂草”，须在滋生之后尽快去除，以避免其与浮萍因种间竞争而抑制浮萍生长(参考文献1)。本发明技术方案则恰好与现有技术相反。本发明方法的基本原理在于：在人工培养条件下，人为造成浮萍与满江红伴生状态。一方面，满江红较强的固氮能力可以为浮萍生长提供持续缓释的氮营养，同时满江红的死亡植物体也可以补充水体营养；另一方面，满江红具有快速的繁殖能力，可以迅速占满水面空间(死植物体和/或活植物体)，有效防止绿藻等藻类进入水体、感染浮萍，从而达到净化水体、保存清洁浮萍活体材料的目的。
上述防止浮萍染藻的保存方法，在优选条件下，浮萍与满江红株数比为2:1～4:1。
上述防止浮萍染藻的保存方法，在优选条件下，启动培养时采用20倍～30倍稀释的Hoagland标准营养液作为培养液，以后培养过程中只需要直接补充自来水作为培养液。
作为一种活体材料的保存方法，上述方法保存的浮萍活体材料可以实现随取随用。当需要取用新鲜浮萍材料时，只需用镊子轻轻拨开水面的满江红，并搅动水体，即可达到浮萍与满江红分离的目的，取出所需的浮萍材料。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)提供了一种简便快速的浮萍活体材料保存方法，保存中的浮萍能够长期避免藻类感染，取用方便，能够保证清洁浮萍活体材料始终以自然形态存在，随取随用；(2)本发明方法保存的浮萍的长期成活率高，在两年观察期内，保存的所有样品成活率达100％。而现有的固体培养基配合人工气候箱保存的材料死亡率约10％；(3)本发明方法使浮萍活体材料在天然露天条件下长期保存，不依赖昂贵的科研仪器，不耗能，节约科研成本。而固定培养基需定期配制培养基，人工气候箱耗电成本较高，每个人工气候箱按2000W功率计算，每年达17520度，按每度5角钱计算，可耗电8760元；(4)本发明方法保存的浮萍可在一年四季中随时取材使用，而野外生长的浮萍冬天已休眠，人工气候箱固体培养基保存的浮萍材料需要培养约2个星期才能恢复到其自然的生长形态，用以作为实验材料。因此，本发明方法能够有效地节省浮萍科学研究等待自然生长的植物活体材料的时间，提高工作效率和科研产出；(5)本发明方法在保存过程中管理方便，除初期配制使用一次Hoagland培养液(优化条件下)，保存过程中偶尔加少量水以外，再无需其他人工成本投入。而人工气候箱固体培养基保存浮萍材料需要日常观察、定期更换培养基，并且需要无菌条件，耗时耗工同时耗费材料成本。一般需要安排专人专职管理(包括管理人工气候箱、检查生长状态、制作培养基、转培养等等)，以1个技术工人3000元/月工资计算，年工资将达3.6万元。
参考文献：李明锋.芜萍和浮萍的人工培植.内陆水产,1999-01-05
附图说明
图1是采用本发明方法保存浮萍的整体培养效果。(满江红快速盖满水面，浮萍在其空隙得以健康保存)
图2是采用本发明方法保存的浮萍活体植株。(浮萍活体植株健康，水体清洁，无绿藻污染，易养易取)
图3是加盖透光网单独直接露天水体培养污染死亡的浮萍植株。
图4是加盖透光网单独直接露天培养的浮萍。(浮萍生长状态差、不清洁，且严重感染绿藻)
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。
实施例一
如图1～图2所示，用本发明方法保存浮萍材料。
1、试剂、材料
培养容器：高约40cm、直径30cm的干净敞口、无盖圆形水桶。
Hoagland标准营养液：KNO3 1000mg/L,NH4NO3 140mg/L,Ca(NO3)2.4H2O 600mg/L,MgSO4.7H2O 500mg/L,ferritartrate 5mg/L,Mncl2.4H20mg/L,ZnSO4.7H2O 0.2mg/L,H3BO3 3mg/L,MoO3 0.07mg/L,CuSO4.5H2O 0.08mg/L。pH值调节至6.5。
浮萍材料：健康无藻类污染的绿萍(Lemna minor)、多根紫萍(Spirodela polyrhiza)活体植株。
满江红材料：选择健康无藻类污染的满江红(Azolla imbricata)活体植株。
透光网：40目白色尼龙网。
2、保存操作方法
向培养容器中加入1/3容器高度的自来水，加入200ml Hoagland标准营养液，混匀，即相当于稀释30倍的Hoagland标准营养液；
培养容器中放入8株浮萍(绿萍与多根紫萍随机)和4株满江红，株数比2:1。
将培养容器口用透光网覆盖，将透光网用绳子扎紧固定在培养容器上。透光网目的是防大雨冲走材料，也可防止较大的昆虫等进入桶内采食浮萍；
将培养容器至于露天的楼顶或任意阳光充足的平台。
管护操作：每隔半个月留意观察培养容器内水量，若水量低于1/3则添加自来水补充。尤其是冬季比较干燥，应防止水分蒸发过度而干枯。管护操作每个月花费1个普通工人1天的工作时间。
3、保存效果
图1是培养容器中保存浮萍的整体培养效果。可见满江红快速盖满水面，浮萍在其空隙得以健康保存。
图2是保存中的浮萍活体植株放大。可见浮萍活体植株健康，水体清洁，无绿藻污染。浮萍活体材料易养易取。
保存2年半时间以上，100％保证浮萍样本的长期存活，无一感染绿藻或其他藻类。
4、浮萍材料取用
需要取新鲜的浮萍样品时，只需用镊子轻轻拨开表面的满江红，并搅动水体，即可达到浮萍与满江红分离的目的，取得所需的浮萍材料。
实施例二
用本发明方法保存浮萍材料。
其与实施例一相同之处不再重复，其不同之处在于营养液浓度与浮萍与满江红的株数比。
1、试剂、材料同实施例一。
2、保存操作方法
向培养容器中加入3.8L自来水，加入200ml Hoagland标准营养液，混匀，即相当于稀释20倍的Hogland标准营养液；
培养容器中放入16株浮萍(绿萍与多根紫萍随机)和4株满江红，株数比4:1。
其余操作与管护同实施例一。
3、保存效果同实施例一。
4、浮萍材料取用同实施例一。
对照例一
人工气候箱液体保存浮萍。
1、试剂、材料
培养容器：500ml圆形玻璃烧杯。赛福智能人工气候箱18PRX-1000ml-CO2。
Hoagland标准营养液、浮萍材料、透光网，同实施例一。
2、保存培养操作
将人工气候箱设定8h白天，2500Lux光照，6h黑夜，温度设置为白天黑夜20℃/18℃交替。将玻璃烧杯用自来水和去离子水清洗干净，加入烧杯容积1/2的Hoagland标准营养液。取健康的浮萍材料10株，用1％NaClO溶液消毒处理2min，用无菌水清洗干净，然后将浮萍放入盛有Hoagland标准营养液的烧杯中。
管护操作：定期加营养液，每个星期需补充自来水和Hoagland标准营养液，每隔一个月需要进行清洗灭菌处理。培养200个浮萍样品，管护工作单独耗费1个技术人员的全时工作时间。
3、保存效果
在连续三次Hoagland营养液液体在人工气候箱培养的200个浮萍样品在培养半个月后均不同程度的感染绿藻，部分样品感染白色的细菌。采用青霉素等抗生素处理感染菌类的样品，效果不理想，也尝试采用1％次氯酸钠消毒处理，效果同样不明。一个月后10％死亡，一年后基本死亡率达到80％。加盖透光网，露天单独培养浮萍的样品一个月后100％感染绿藻，1年后成活20％。
对照例二
常规露天单独水培法保存浮萍。
1、试剂、材料
培养容器、Hoagland标准营养液、浮萍材料、透光网，同实施例一。2、保存培养操作
向培养容器中加入1/3的自来水，加入200ml Hoagland标准营养液，混匀，即相当于稀释30倍的Hoagland标准营养液；
培养容器口用透光网覆盖，将透光网用绳子扎紧固定在培养容器上。将培养容器至于露天的楼顶或任意阳光充足的平台。
管护操作：定期加营养液，每1个月加一次200ml Hoagland标准营养液，同时每半个月需观察一次水桶，以保持每隔半个月留意观察培养容器内水量，若水量低于1/4则添加自来水补充。
3、保存效果
浮萍易染绿藻、杂菌，成活率不高。图3是本实施方式培养中污染死亡的浮萍植株；图4是本实施方式培养中的浮萍(浮萍生长状态差、不清洁，且严重感染绿藻)。
对照例三
人工气候箱固体培养基保存浮萍
1、试剂、材料
直径为5cm的圆形玻璃培养皿，YJ-875型医用超净工作台，GZ-300GSI智能人工气候箱，2500Lux，20℃，16h光照/8h暗，培养箱中培养。
组织培养基础培养基：MS基础培养基(见表1)+蔗糖30g/L+琼脂7g/L,pH5.8。
表1MS基础培养基母液配制表
浮萍材料同实施例一。
2、保存培养操作
取健康的浮萍植物10株，1％NaClO溶液处理2min，用无菌水清洗干净，再将其在超净工作台上接种至已灭菌、装有MS培养基的培养皿中，迅速用封口胶密封，即将其放入GZ-300GSI智能人工气候箱中培养。人工气候箱的条件设定为2500Lux，20℃，16h光照/8h暗。
管护操作：每天观察培养箱中的生长情况，如发现感染细菌的需及时取出灭菌，重新转接；定期更换培养基，每2个月需要转接一次培养皿，更换培养基，以满足浮萍生长的营养。
3、保存效果
90％的浮萍能够有效的保存，但浮萍长期适应于这种固态的生长环境，浮萍的叶片加厚，根变得极短，如需要观察其自然生长的形态特征，需要取出在液态培养集中培养2个星期以上才能逐渐恢复期自然的生长形态特征。
对比例一
实施例一至四每种保存方法取20个浮萍样品，每种保存方法取三个重复，进行一元方差分析(表2)与LSD多重比较分析(表3)。
表2不同浮萍保存方法的一元方差分析(ANOVA)
*P<0.05,表示有显著。
表3浮萍不同保存方法的LSD多重比较结果分析
*平均差异在0.05水平上显著。
*培养方式1人工气候箱液体保存(对照例一)2.本发明方法保存(实施例一)3.单独露天水培法保存(对照例二)4.人工气候箱固体培养基保存(对照例三)
结果表明，1个月浮萍样品存活率、1个月后感染藻类的样品、1年后没染菌的样品均存在显著差异。不同浮萍保存方法的LSD多重比较分析表明(表3)，本发明方法与其他保存方法除在感染藻类方面与人工气候箱固体培养基培养(对照例三)不存在显著差异，1个月后存活样品与露天保存(对照例二)、人工气候箱固体培养基保存(对照例三)的存活样品不存在显著差异外，其他指标均存在显著差异，且具有明显的技术有益性。
Claims (9)
1.一种浮萍活体材料保存方法，其特征在于：在培养容器内将浮萍与满江红(Azolla imbricata)共同培养，所述培养容器置于自然环境。
2.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于：所述浮萍与满江红株数比为2:1～4:1。
3.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于：在直径30cm的水面配置8株～16株浮萍与4株满江红。
4.根据权利要求1或2或3所述的保存方法，其特征在于：启动培养时采用20倍～30倍稀释的Hoagland标准营养液作为培养液。
5.根据权利要求4所述的保存方法，其特征在于：启动培养时采用20倍～30倍稀释的Hoagland标准营养液作为培养液，日常管护中补充自来水。
6.根据权利要求1或2或3或5所述的保存方法，其特征在于：所述浮萍是绿萍(Lemna minor)和/或多根紫萍(Spirodela polyrhiza)。
7.根据权利要求1或2或3或5所述的保存方法，其特征在于：所述自然环境是阳光充足的自然环境。
8.根据权利要求1或2或3或5所述的保存方法，其特征在于：所述培养容器口覆盖透光网。
9.根据权利要求8所述的保存方法，其特征在于：所述透光网是40目白色尼龙网。
Priority Applications (1)
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Citations (4)
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| 日本青萍6746的种质保存;邹宁等;《植物生理学通讯》;19881027(第5期);第62、68页 * |
| 水生植物化感抑藻作用研究与应用;洪喻等;《科学通报》;20090115;第54卷(第3期);第287～293页 * |
| 江苏省夏季浮萍种类及其生长水环境调查;吴雪飞等;《生态与农村环境学报》;20120925;第28卷(第5期);第554～558页 * |
| 除藻与控藻技术;过龙根;《中国水利》;20060912(第17期);第34～36页 * |
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