CN103998059A - 用于中和狂犬病病毒的结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于中和狂犬病病毒的结合分子。更具体地，根据本发明的结合分子可以中和源自例如蝙蝠、狗、牛、獴、臭鼬和狼的物种的狂犬病病毒，由此可以用于治疗感染了源自多种物种的狂犬病病毒的患者。

Description

用于中和狂犬病病毒的结合分子
技术领域
本发明涉及能够中和狂犬病病毒的结合分子。
背景技术
狂犬病是病毒性人畜共患病，其主要感染野生和家养动物并且也感染哺乳动物(包括人)从而引起急性脑病。狂犬病是一旦症状出现总是导致死亡的致命疾病，狂犬病与AIDS一起被称为最致命的疾病。狂犬病的发生遍及全球，每年全球感染超过一千万人并且每年全球引起40,000-70,000人死亡。
狂犬病主要通过唾液和血液传播并且主要由被感染的狗或猫的咬伤引起。此外，狂犬病可以通过大多数哺乳动物(包括臭鼬和蝙蝠)传播。
在狂犬病病毒通过身体神经组织到达脑神经组织之后，狂犬病病毒的实际症状出现。由于阻挡外源物质的血脑屏障的存在，病毒等不可以自然地渗透入人脑，但狂犬病病毒通过RVG(rabies virus glycoprotein，狂犬病病毒糖蛋白)穿过血脑屏障以感染中枢神经系统。
在狂犬病的初始阶段，患者表现出类似流感的症状，并且在被咬区域感到痒或发热。随着狂犬病的进展，被感染患者表现出焦虑、恐水症(由于在吞咽液体例如水时发生肌肉痉挛和严重疼痛而害怕水)、怕风(风使得感觉器官过分敏感)、兴奋、麻痹和异常神经症状例如精神失常。此外，狂犬病引起对阳光的过敏。这些症状出现后约2-7天，全身的神经或肌肉瘫痪以引起昏迷状态和呼吸窘迫，导致死亡。
狂犬病可通过迅速的局部伤口护理，用抗狂犬病免疫球蛋白(以下称为“抗狂犬病抗体”)被动免疫和主动免疫(疫苗接种)来预防和治疗。目前已开发的抗狂犬病抗体包括人来源的狂犬病免疫球蛋白(以下称为“HRIG”)和马来源的狂犬病免疫球蛋白(以下称为“ERIG”)。HRIG不能以足够的量供应并且昂贵。此外，HRIG源自人血液，被HIV等感染的风险高。此外，HRIG是具有低效力的多克隆抗体。同时，ERIG源自马，与HRIG相比具有低治疗效力，因而以高于HRIG的剂量施用给患者。相比于HRIG，ERIG便宜，但是不能以足够的量供应。此外，ERIG可引起过敏症(anaphyaxis)，因为它是源自非人来源的抗体。为了克服这些缺点，已建议使用能够中和狂犬病病毒的单克隆抗体用于暴露后预防。开发了鼠狂犬病病毒中和单克隆抗体(Schumacher CL等，J.Clin.Invest.Vol.84，p.971-975，1989)，但是由于短的血清半衰期、不能触发某些人效应物功能以及在人体中引发不期望的人抗小鼠抗体(HAMA)，鼠抗体对人的直接施用是受限的。
因此，迫切需要开发用于治疗狂犬病的单克隆抗体，其不来源于血液，高度稳定，可以通过培养合成大量生产和供应，并且可具有均一的质量。
公开内容
技术问题
本发明的一个目的是提供具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子。
本发明的另一个目的是提供包含与所述结合分子连接的至少一种标签的免疫缀合物。
本发明的另一个目的是提供编码所述结合分子的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供表达载体，其包含插入其中的编码所述结合分子的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供用所述表达载体转化的细胞系。
本发明的另一个目的是提供通过培养所述细胞系产生本发明之结合分子的方法。
本发明的另一个目的是提供包含所述结合分子的组合物。
本发明的另一个目的是提供包含所述结合分子的试剂盒/药盒。
本发明的另一个目的是提供使用所述结合分子诊断狂犬病的方法。
本发明的另一个目的是提供使用所述结合分子治疗和预防狂犬病的方法。
本发明的另一个目的是提供使用所述结合分子检测狂犬病病毒的方法。
技术方案
为了实现以上目的，本发明提供了具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子。
本发明还提供了包含与所述结合分子连接的至少一种标签的免疫缀合物。
本发明还提供了编码所述结合分子的多核苷酸。
本发明还提供了表达载体，其包含插入其中的编码所述结合分子的多核苷酸。
本发明还提供了细胞系，其包含被转化入宿主细胞以产生本发明之结合分子的表达载体。
本发明还提供了通过培养所述细胞系产生本发明之结合分子的方法。
本发明还提供了包含所述结合分子和可药用赋形剂的药物组合物。
本发明还提供了用于治疗和预防狂犬病的药物组合物，其包含所述结合分子和可药用赋形剂。
本发明还提供了用于诊断狂犬病的试剂盒，其包含所述结合分子。
本发明还提供了用于治疗和预防狂犬病的药盒，所述药盒包含所述结合分子。
本发明还提供了使用所述结合分子诊断狂犬病的方法。
本发明还提供了用于治疗和预防狂犬病的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的所述结合分子。
本发明还提供了使用所述结合分子检测狂犬病病毒的方法。
在下文中，将如以下定义本文所用的术语。
本文所用的术语“结合分子”指完整的免疫球蛋白，其包括单克隆抗体，例如嵌合、人源化或人单克隆抗体；或者指免疫球蛋白的抗原结合片段或包含可变结构域的片段，其与完整免疫球蛋白竞争结合免疫球蛋白的结合伴侣，例如狂犬病病毒或其片段或病毒外部的G蛋白(糖蛋白)。不论结构为何，抗原结合片段结合被完整免疫球蛋白识别的相同抗原。抗原结合片段可包含肽或多肽，所述肽或多肽包含由结合分子之氨基酸序列的至少2、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250个连续氨基酸残基组成的氨基酸序列。
本文所用的术语“结合分子”包括本领域已知的所有免疫球蛋白类型和亚类。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将结合分子划分为完整抗体的5种主要类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可以进一步被划分为亚类(同种型)，例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
抗原结合片段尤其包括Fab、F(ab′)、F(ab′)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬茵体抗体、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、多肽(其含有足以赋予多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一个片段)等。上述片段可以通过合成产生或者通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割产生，或者它们可以通过重组DNA技术而被遗传改造。生产方法是本领域公知的。
结合分子可以是裸的或未经缀合的结合分子，但也可以是免疫缀合物的一部分。
本文所用的术语“可药用赋形剂”意指任何这样的惰性物质，其与活性分子(例如药、试剂或结合分子)组合用于制备适合的或方便的剂型。可药用赋形剂是这样的赋形剂，其无毒或者至少对于其预期的用途其毒性在所使用的剂量和浓度下对接受者是可接受的，并且与制剂的其他成分(包括药、试剂或结合分子)相容。
本文所用的术语“治疗有效量”指对于预防或治疗由狂犬病病毒感染导致的病症有效的结合分子的量。
下文中，将详细描述本发明。
本发明人从疾病控制中心(下文中称为“US CDC”)获得了杂交瘤细胞，其表现为具有中和大范围的狂犬病病毒株的能力，并且从所获得的杂交瘤细胞获得了小鼠型单克隆抗体之重链和轻链可变区的序列。随后，将重链和轻链可变区连接至IgG1骨架以制备嵌合抗体。在体内和体外检测了上述嵌合抗体是否具有中和多种狂犬病病毒的能力。结果发现，本发明的单克隆抗体可有效地用于治疗被源自大范围物种之狂犬病病毒感染的患者。
因此，本发明提供了具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子。
在本发明的一个优选实施方案中，所述结合分子包含可变区，所述可变区包含互补决定区(CDR)1区、CDR2区和CDR3区，所述互补决定区(CDR)1区包含SEQ ID NO：23所示的多肽，所述CDR2区包含SEQID NO：24所示的多肽，所述CDR3区包含SEQ ID NO：25所示的多肽。
在本发明的另一个实施方案中，所述结合分子包含可变区，所述可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区包含SEQ ID NO：26所示的多肽，所述CDR2区包含SEQ ID NO：27所示的多肽，所述CDR3区包含SEQ ID NO：28所示的多肽。
在本发明的另一个实施方案中，所述结合分子包含：重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区包含SEQ ID NO：23所示的多肽，所述CDR2区包含SEQ ID NO：24所示的多肽，所述CDR3区包含SEQ ID NO：25所示的多肽；所述轻链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区包含SEQID NO：26所示的多肽，所述CDR2区包含SEQ ID NO：27所示的多肽，所述CDR3区包含SEQ ID NO：28所示的多肽。所述结合分子可以是Fab片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
在本发明的另一个实施方案中，所述结合分子包含可变区，所述可变区包含SEQ ID NO：29所示的多肽序列。
在本发明的另一个实施方案中，所述结合分子包含可变区，所述可变区包含SEQ ID NO：30所示的多肽序列。
在本发明的另一个实施方案中，所述结合分子包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：29所示的多肽序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：30所示的多肽序列。所述结合分子可以是Fab片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
在本发明的另一个实施方案中，所述结合分子包含重链，所述重链包含可变区和恒定区，所述可变区包含SEQ ID NO：29所示的多肽序列，所述恒定区包含SEQ ID NO：31所示的多肽序列。
在本发明的另一个实施方案中，所述结合分子包含轻链，所述轻链包含可变区和恒定区，所述可变区包含SEQ ID NO：30所示的多肽序列，所述恒定区包含SEQ ID NO：32所示的多肽序列。
在本发明的另一个实施方案中，所述结合分子包含：重链和轻链，所述重链包含可变区和恒定区，所述可变区包含SEQ ID NO：29所示的多肽序列，所述恒定区包含SEQ ID NO：31所示的多肽序列；所述轻链包含可变区和恒定区，所述可变区包含SEQ ID NO：30所示的多肽序列，所述恒定区包含SEQ ID NO：32所示的多肽序列。
在本发明中，依照由Kabat等设计的系统(参见Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest(第5)，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))使用常规方法确定互补决定区(CDR)的可变结构域。依照Kabat方法确定在本发明中使用的CDR，但本发明还涵盖包含通过其他方法(包括IMGT方法、Chothia方法和AbM方法)确定的CDR的结合分子。
本发明的结合分子可以是抗体。
狂犬病病毒可以源自蝙蝠、狗、牛、獴、臭鼬，狼等，但不限于此。
本发明还提供了包含与所述结合分子连接的至少一个标签的免疫缀合物。
本发明还提供了编码所述结合分子的核酸分子。
本发明的核酸分子涵盖根据本领域技术人员已知的方法将本发明抗体的氨基酸序列转换成多核苷酸序列所获得的所有核酸分子。因此，可以制备多种具有开放阅读框(ORF)的多核苷酸序列并且所述多核苷酸序列页也包含在本发明核酸分子的范围内。
本发明还提供了表达载体，其包含插入其中的编码所述结合分子的核苷酸分子。
所述表达载体可优选地源自选自以下的任意一种：Celltrion Inc.(韩国)生产的MarEx表达载体(参见韩国专利申请号10-2006-0020723)、广泛市售可得的pCDNA载体、F、RI、RP1、Col、pBR322、ToL、Ti载体；黏粒；噬茵体例如λ(lambda)，λ形(lambdoid)、M13、Mu、p1、P22、Qμ、T-even、T2、T3、T7等；和植物病毒，但不限于此。本领域技术人员已知的任何表达载体可以用于本发明，并且表达载体的选择取决于所选宿主细胞的性质。宿主细胞中的载体的引入可以通过以下实现(但不限于此)：磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、lipofectamin转染或电穿孔，并且本领域的任何技术人员可以选择和使用适合所使用的表达载体和宿主细胞的引入方法。优选地，所述载体含有一个或更多个可选择标记，但不限于此，并且也可以使用不含可选择标记的载体。可选择标记的选择可以取决于所选的宿主细胞，尽管这对于本发明不是关键的，因为这对于本领域技术人员是公知的。
为了便于本发明核酸分子的纯化，可以将标签序列插入和融合至表达载体中。标签的实例包括但不限于，六组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或flag标签。本领域技术人员已知的任何便于纯化的标签均可以在本发明中使用。
本发明还提供了细胞系，其包含被转化入宿主细胞以产生本发明之结合分子的表达载体。
在本发明中，所述细胞系可以包括哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌来源的细胞，但不限于此。作为哺乳动物细胞，优选使用选自CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞和HEK293T细胞中的任一种作为宿主细胞，但不限于此。本领域技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞可以在本发明中使用。
本发明还提供了用于产生具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子的方法，所述方法包括以下步骤：i)培养上述细胞系；以及ii)回收在所述细胞系中表达的结合分子。
本发明还提供了药物组合物，其包含所述结合分子和可药用赋形剂。
除了具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子之外，本发明的组合物可以包含可药用赋形剂。可药用赋形剂是本领域技术人员公知的。
本发明还提供了用于治疗和预防狂犬病的组合物，其包含所述结合分子和可药用赋形剂。
除了具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子之外，本发明的组合物可以包含可药用赋形剂。可药用赋形剂是本领域技术人员公知的。
另外，本发明的预防性和治疗性组合物可以包含用于治疗狂犬病的至少5种其他治疗剂，并且还可以包含多种单克隆抗体，并且因此可以表现出中和活性的协同效应。
此外，本发明的预防性和治疗性组合物还可以包含一种或更多种其他治疗剂或诊断剂。所述治疗剂包括但不限于抗病毒药物。这种药物的实例包括抗体、小分子、有机或无机化合物、酶、多核苷酸序列、抗病毒肽等。
本发明的预防性和治疗性组合物必须在制造和储存条件下是无菌且稳定的。此外，它可以是粉末的形式以在递送之前或递送时在适当的可药用赋形剂中重构。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冻干，其从预先灭菌过滤的粉末溶液产生活性成分和任何另外期望成分的粉末。或者，本发明的组合物可以为溶液形式并且可以在递送之前或递送时添加和/或混合适当的可药用赋形剂以提供单位剂量的可注射形式。优选地，本发明中使用的可药用赋形剂适合于高药物浓度，可以维持适当的流动能力并且如需要可延缓吸收。
本发明的预防性和治疗性组合物的最佳施用路径的选择将受几种因素的影响，所述因素包括：组合物中活性分子的物理化学性质、临床情况的紧迫性以及活性分子的血浆浓度与期望的治疗效果之间的关系。例如，本发明的单克隆抗体可与保护它们免于快速释放的载体一起制备，如控释制剂，其包括植入物和微胶囊化递送系统。可以在本发明中使用生物可降解和生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酸酐(polyanhydride)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、胶原、聚原酸酯(polyorthoester)和聚乳酸。此外，本发明的单克隆抗体可以用防止抗体失活的材料或化合物包被或与其共同施用。例如，本发明的单克隆抗体可与适当的载体(例如，脂质体或稀释剂)一起施用。
本发明的预防性和治疗性组合物的施用途径可分为经口和肠胃外途径。优选的施用途径是静脉内途径，但不限于此。
经口剂型可以配制成片剂、药片(troche)、锭剂(lozenge)、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊、软明胶胶囊、糖浆(syrup)或酏剂、丸剂、糖衣丸剂(dragee)、液体、凝胶或浆(slurry)。这些制剂可以含有可药用赋形剂，其包括(但不限于)，惰性稀释剂、粒化或崩解剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、着色剂、调味剂或甜味剂、植物油或矿物油、润湿剂和增稠剂。
用于肠胃外施用的制剂可以是水性或非水性的等渗无菌无毒注射或输注溶液或悬液的形式。该溶液和悬液可以包含在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒的试剂，例如1，3-丁二醇、林格氏溶液(Ringer′s solution)，Hank′s溶液、等渗氯化钠溶液、油、脂肪酸，局部麻醉剂、防腐剂、缓冲剂、粘度增加剂或溶解性增加剂，水溶性抗氧化剂、油溶性抗氧化剂和金属螯合剂。
本发明还提供了用于诊断狂犬病的试剂盒，其包含：i)具有中和狂犬病病毒之能力的本发明结合分子，和ii)容器。
本发明还提供了用于治疗和预防狂犬病的药盒，其包含：i)具有中和狂犬病病毒之能力的本发明结合分子，和ii)容器。
本发明还提供了使用所述结合分子诊断狂犬病的方法，该方法包括以下步骤：i)将来自对象的样品与具有中和狂犬病病毒之能力的结合分子相接触，和ii)分析步骤i)的结果以确定所述对象是否已感染狂犬病。
本发明还提供了使用治疗量的具有中和狂犬病病毒之能力的结合分子治疗和预防狂犬病的方法，该方法包括向已确认感染有狂犬病的对象施用治疗有效量的所述结合分子。
本发明还提供了用于检测狂犬病病毒的方法，该方法包括以下步骤：i)将来自对象的样品与具有中和狂犬病病毒之能力的结合分子相接触，和ii)测量所述结合分子是否与所述样品特异性结合。
来自对象的样品可以是生物样品，包括但不限于来自(潜在的)受感染对象的血液、血清、组织或其他生物材料。所述(潜在的)受感染对象可以是人对象，但也可以是被怀疑为狂犬病病毒携带者的动物。可以首先处理来自对象的样品以使其更适合于检测方法。优选地，在允许结合分子与样品中存在的狂犬病病毒或其抗原成分之间形成免疫复合物的条件下将本发明的结合分子或免疫缀合物与对象的样品相接触。通过合适的方法检测和测量表明样品中存在狂犬病病毒的免疫复合物的形成。这样的方法包括但不限于免疫测定例如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光、免疫细胞化学、FACS、BIACORE和Western印迹分析。
有益效果
发现本发明的能够中和狂犬病病毒的结合分子具有中和多种狂犬病病毒的能力，并因此可用于在感染有狂犬病病毒感染的患者和动物中治疗和预防狂犬病。
附图说明
图1示出嵌合抗体表达载体，其包含根据本发明的重链和轻链基因。
图2示出使用中国狗狂犬病病毒(Rv342)进行的体内动物实验的结果。
最佳方式
下文中，将参照实施例详细描述本发明。然而应理解，这些实施例仅用于举例说明目的而不旨在限制本发明的范围。
实施例1：杂交瘤细胞的选择
基于对保藏在疾病控制中心(下文中称作“US CDC”)的杂交瘤细胞的先前实验和记录，选择特定的杂交瘤细胞，随后通过RFFIT(快速荧光灶抑制测试(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test))测量克隆在培养基中的Fab效价(Smith，J.S.等，Geneva：World Health Organization，181-191页，1996；和疾病控制和预防中心，Morb.Mortal. Weekly Rep.49(RR-1)，1-21，1999)。下表1中示出了测量的结果。所选择的杂交瘤细胞的克隆名称为#62-71-3。通过纯化从所选择的杂交瘤细胞纯化单克隆抗体，随后使用单克隆抗体进行作为效价相关测试的RFFIT。
表1：使用经纯化克隆进行的RFFIT的结果
抗体名称 效价(IU/mL)IU/mg IU/mg
62-71-3 480(5.7IU/mL) 1.4IU/mg
使用表1中示出的#62-71-3克隆进行保藏在US CDC的在全球范围发生的狂犬病病毒的RFFIT。US CDC拥有在全球范围内发生的约50种狂犬病病毒，所述病毒的列表在下表2中示出。
表2：US CDC拥有的狂犬病病毒的列表
编号 狂犬病病毒种类 SRIG 62-71-3 IU/mg
1 CVS-11 125 170 3.3
2 獴RSA 90 170 4.6
3 CASK 90 ＜5 0
4 突尼斯狗 125 700 13.7
5 加蓬狗 125 45 0.9
6 TXFX 125 440 8.6
7 泰国狗 125 625 12.2
8 索诺拉狗 125 900 17.6
9 002菲律宾 125 125 2.4
10 DR MX xxx xxx xxx
11 DR巴西 62.5 ＜5 0
12 狗Phi 125 85 1.7
13 WA蝙蝠 125 45 0.9
14 3860CA蝙蝠 125 250 4.9
15 狗Arg 125 700 13.7
16 TX SK 90 ＜5 0
17 RAC 90 ＜5 0
18 中国2005 62.5 145 5.7
19 Rv342中国 62.5 95 3.7
20 TX丛林狼 90 1000 27.1
21 rv61 62.5 ＜5 0
22 AL蝙蝠 125 440 8.6
23 LC NY xxx xxx xxx
24 蝙蝠Ef 125 125 2.4
25 C1434 125 350 6.8
26 ABV(SM4476) 125 ＜5 0
27 Wu ABLV 125 480 9.4
28 AZ蝙蝠 125 540 10.5
29 VA399 125 540 10.5
30 TN410 125 125 2.4
31 TN132 125 ≥1400 ≥27.3
32 SK4384 90 ＜5 0
33 AK FX 125 xxx 0
34 857r 62.5 230 9.0
35 I-148 62.5 360 14.0
36 Mong PR 125 250 4.9
37 Gray FX-AZ 125 210 4.1
38 NC SK 90 800 21.7
39 323R 90 230 6.2
40 RVHN xxx xxx xxx
41 MI1625 125 ≥1400 ≥27.3
42 I-151 62.5 ＜5 0
43 TN269 125 625 12.2
44 斯里兰卡 62.5 60 2.3
45 鼠耳蝠 125 1100 21.5
对于在以上表2中显示的#62-71-3克隆的RFFIT结果在下表3中显示。在表3中，较高的值表示较高的中和效力。
表3：在US CDC进行的RFFIT的结果
编号 狂犬病病毒种类 SRIG 62-71-3 IU/mg
1 CVS-11 125 170 3.3
2 獴RSA 90 170 4.6
3 CASK 90 ＜5 0
4 突尼斯狗 125 700 13.7
5 加蓬狗 125 45 0.9
6 TXFX 125 440 8.6
7 泰国狗 125 625 12.2
8 索诺拉狗 125 900 17.6
9 002菲律宾 125 125 2.4
10 DR MX xxx xxx xxx
11 DR巴西 62.5 ＜5 0
12 狗Phi 125 85 1.7
13 WA蝙蝠 125 45 0.9
14 3860CA蝙蝠 125 250 4.9
15 狗Arg 125 700 13.7
16 TX SK 90 ＜5 0
17 RAC 90 ＜5 0
18 中国2005 62.5 145 5.7
19 Rv342中国 62.5 95 3.7
20 TX丛林狼 90 1000 27.1
21 rv61 62.5 ＜5 0
22 AL蝙蝠 125 440 8.6
23 LC NY xxx xxx xxx
24 蝙蝠Ef 125 125 2.4
25 C1434 125 350 6.8
26 ABV(SM4476) 125 ＜5 0
27 Wu ABLV 125 480 9.4
28 AZ蝙蝠 125 540 10.5
29 VA399 125 540 10.5
30 TN410 125 125 2.4
31 TN132 125 ≥1400 ≥27.3
32 SK4384 90 ＜5 0
33 AK FX 125 xxx 0
34 857r 62.5 230 9.0
35 I-148 62.5 360 14.0
36 Mong PR 125 250 4.9
37 Gray FX-AZ 125 210 4.1
38 NC SK 90 800 21.7
39 323R 90 230 6.2
40 RVHN xxx xxx xxx
41 MI1625 125 ≥1400 ≥27.3
42 I-151 62.5 ＜5 0
43 TN269 125 625 12.2
44 斯里兰卡 62.5 60 2.3
45 鼠耳蝠 125 1100 21.5
(SRIG：标准狂犬病免疫球蛋白)
(xxx：未进行)
#62-71-3克隆显示出针对狂犬病病毒的特异性效果，对于所述狂犬病病毒，韩国专利申请号10-2011-0024332中公开的#2-21-23克隆显示出低的中和能力。因此，将#62-71-3克隆从US CDC递送至申请人(CelltrionInc.)。使用#62-71-3克隆的可变区和人型抗体的恒定区制备嵌合单克隆抗体。
实施例2：从杂交瘤细胞分泌的嵌合抗体的cDNA的合成
2-1：细胞培养
杂交瘤细胞#62-71-3由US CDC递送。在补充了5％胎牛血清(FBS；Sigma，12003C)的IMDM培养基(Invitrogen12440-053)中培养细胞。在培养期间，使用支原体PCR ELISA试剂盒(Roche，11663925910)检查支原体的污染，并且证实在培养基中没有支原体。
2 - 2：由杂交瘤细胞分泌的小鼠型抗体的重链和轻链可变区DNA的合 成
使用RNeasy plus小型试剂盒(RNeasy plus mini kit )( Qiagen，74134)从培养的杂交瘤细胞#62-71-3分离总RNA。使用1μg经分离的总RNA作为模板和SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech，634923)进行5′末端RACE PCR(cDNA末端快速扩增聚合酶链式反应)以合成在5′末端包含特定序列的cDNA。用以下方式进行cDNA的合成。首先，将1μg总RNA与5′RACE CDS引物A(5′-(T)25GC-3′；SEQ ID NO：1)混合，随后在72℃反应3分钟，并且在42℃反应2分钟。然后添加SMARTer IIA寡核苷酸(5′-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGT GGG-3′；SEQ ID NO：2)和逆转录酶至反应产物中并与反应产物混合，接着在42℃90分钟和在70℃10分钟进行逆转录，从而合成在5′末端包含特定序列的杂交瘤细胞来源的cDNA。使用杂交瘤细胞来源的cDNA作为模板，在下列条件下使用通用引物A混合物(长5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATAGGG CAA GCA GTG GTA TCA ACGCAG AGT-3；SEQ ID NO：3；和短5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGGC-3′；SEQ ID NO：4)，反义引物(5′-GCTGGACAGGGATCCAGAGTTCCAAGTCACAGTC-3′：SEQID NO：5)(用于扩增IgG2b重链恒定区的特定序列)，以及反义引物(5′-cgt ct tgg tca acg tga ggg tgc tgc t-3′：SEQ ID NO：6)(用于扩增轻链之k链恒定区的特定序列)进行聚合酶链反应(PCR)，从而获得包含在杂交瘤细胞#62-71-3中表达之抗体的全部可变区的cDNA：在94℃热变性30秒和随后72℃3分钟的5个循环；在94℃热变性30秒、70℃30秒和72℃3分钟的5个循环，以及在94℃热变性30秒、68℃30秒和72℃3分钟的27个循环.
将所获得的包含各全部重链和轻链可变区的cDNA片段克隆到TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，K4500)的TA载体中，然后测序。
2-3：构建编码嵌合抗体的重链和轻链cDNA
使用重叠PCR构建嵌合抗体，其包含连接到人型抗体之恒定区的小鼠型抗体之可变区的DNA序列。具体地，使用下表4中示出的引物在下列条件下进行重叠PCR，从而获得小鼠型轻链(κ链)和重链(γ链)可变区的PCR产物和人型轻链(κ链)和重链(γ链)恒定区的PCR产物：在95℃热变性5分钟，然后95℃1分钟、57℃1分钟和72℃1分钟的35个循环。然后，使用可变区和恒定区的PCR产物作为模板和HC F1和HC R2引物，在以上提到的条件下进行PCR，从而获得重链，其包含连接到恒定区的可变区。此外，使用LC F1和LC R2引物以相同的方式进行PCR，从而获得轻链，其包含连接到恒定区的可变区。
表4：关于引物的信息
2-4：嵌合抗体表达载体的构建
将所获得的重链和轻链基因用限制性酶Nhe I和Pme I处理，随后分别插入到已经被相同的限制性酶处理的pCT184载体和pCT146载体中。pCT184和pCT146载体由Celltrion，Inc.构建，为了分别克隆抗体的重链和轻链。然后，为了构建含有重链转录单元(启动子-重链基因-聚腺苷酸)以及轻链转录单元(启动子-轻链基因-聚腺苷酸)的表达载体，将含有重链基因的pCT184载体用限制性酶PacI和AscI处理，以获得重链转录单元，之后用相同的限制性酶处理含有轻链基因的pCT146载体，然后将重链转录单元插入其中。然后，使用限制性酶筛选含有重链转录单元和轻链转录单元二者的载体并命名为“pCT234”(参见图1)。使用Endofree质粒大提试剂盒(Endofree plasmid maxi kit)(QIAGEN，德国，12362)提取经筛选的载体，并且分析部分经提取DNA的核苷酸序列，从而确定抗体的核苷酸序列。在下表5中示出经确定的序列。依据由Kabat等设计的系统(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5)，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))通过常规方法确定可变区的CDR。
表5：关于小鼠型单克隆抗体的序列的信息
实施例3：通过瞬时转染产生嵌合抗体
使用阳离子聚合物FreeStyleTM Max(Invitrogen，USA，16447-100)按照制造商的说明书进行细胞的瞬时转染。转染前一天，将生长在EX-CELL293无血清培养基(Sigma，14571C；下文中称作“EX-CELL293培养基”)中的F2N细胞(KCTC11309BP)离心，并用FreeStyle293无血清培养基(Gibco，12338)替换该培养基。以0.8×106细胞/ml的细胞浓度将50ml的细胞各自接种到两个250ml摇瓶中。在转染当天，使用OptiPRO SFM II培养基(Invitrogen，12309)将125μg含有嵌合抗体基因的pCT234DNA和125μl的FreeStyleTM Max试剂各自稀释至2mI的体积，随后温和搅拌。在搅拌过程之后，立即将含有在其中稀释的FreeStyleTM Max试剂的溶液与含有在其中稀释的DNA的溶液混合，并且经混合的溶液在室温孵育17分钟。在室温孵育17分钟期间，对将用于转染的经接种F2N细胞的数目进行计数，并且用FreeStyle293培养基将细胞稀释到1.0×106细胞的细胞浓度。孵育17分钟后，处理并且用含有DNA和FreeStyleTM Max试剂的经混合溶液转染F2N细胞。在转染后一天，将相同量的EX-CELL293培养基添加到经转染的细胞，其随后被孵育7天，从而产生单克隆抗体。
实施例4：嵌合单克隆抗体之效力的检测
实施例4-1：体外实验
从实施例3中产生的单克隆抗体中筛选到6个嵌合型候选者。在这些候选者中，选择了具有最高效价的嵌合抗体#13-6(参见表6)。
表6：嵌合型单克隆抗体的浓度
单克隆抗体 效价(IU/mL) IU/mg
嵌合抗体#1-262-71-3 5(0.05) 0.05
嵌合抗体#1-662-71-3 5(0.05) 0.05
嵌合抗体#3-262-71-3 5(0.05) 0.05
嵌合抗体#3-662-71-3 5(0.05) 0.05
嵌合抗体#8-662-71-3 50(0.48) 4.8
嵌合抗体#13-662-71-3 ≥1400(13.3) ≥133
将所选择的嵌合抗体#13-6稀释到合适的浓度(稀释多至抗体储液的10倍)，并且通过RFFIT测试中和典型狂犬病病毒的能力。测试的结果在下表7中显示。
表7
结果显示，本发明的嵌合抗体具有中和源自蝙蝠(AZ蝙蝠，TN269，和CA3860)和狗(泰国狗(Thai Dog)、002Phil、狗Phil(Dog Phil)、中国狗2005(China Dog2005)和Rv342)的狂犬病病毒的能力。
实施例4-2：体内动物实验
为了检测上述实施例中选择的62-71-3嵌合抗体#17是否在体内具有针对狂犬病病毒的治疗效力，使用叙利亚仓鼠(Syrian hamster)按以下方式进行动物实验。在这个动物实验中，使用中国狗狂犬病病毒Rv342。
实验动物被划分为下列5组：1)单独注射Rv342病毒的组；2)注射Rv342病毒和疫苗(人二倍体Sanofi Pasteur)的组；3)注射Rv342病毒和62-71-3嵌合抗体#17的组；4)注射Rv342病毒、62-71-3嵌合抗体#17和疫苗(人二倍体Sanofi Pasteur)的组；以及5)注射Rv342病毒和人狂犬病免疫球蛋白(HRIGRabies-HT，Sanofi Pasteur)的组。基于MICLD50/ml将Rv342病毒稀释100倍，并且将50μl的稀释物肌内注射。对于疫苗，以约2.5IU或更多/mi的浓度注射50μl的疫苗病毒株(0、3、7和14天)。以0.614mg/mL且对应于约20IU/kg的浓度注射50μl的嵌合抗体#17，并且以与嵌合抗体相同的量注射HRIG。疫苗、嵌合抗体#17和HRIG中的每一种均在注射Rv342病毒后24小时注射。
实验的结果在下表8和图2中示出。在注射了病毒和62-71-3嵌合抗体#17的情况下(组3)，动物大部分生存直至第45天(观察期)(91.7％存活率)，但在单独注射病毒(组1)或注射病毒和疫苗(组2)的情况下，动物全部死亡。在注射病毒、62-71-3嵌合抗体#17和疫苗的情况下(组4)，显示出100％的存活率。此外，目前用作治疗剂的HRIG显示出33.3％的存活率(即使其以与62-71-3嵌合抗体#17相同的量注射)。
表8：体内动物实验的结果
＊观察期：病毒感染后45天
尽管已经参考示例性实施方案描述了本发明，本领域的技术人员将会理解，在不背离本发明的范围的情况下可以做出多种改变和变化，并且等同方案可以取代其要素。因此，意图是，本发明不受限于作为考虑用于进行本发明之最佳方式公开的特定实施方案，而且本发明将包括落入所附权利要求之范围内的所有实施方案。

Claims (25)

1.具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子，所述结合分子包含可变区，所述可变区包含根据Kabat方法确定的CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区包含SEQ ID NO：23所示的多肽，所述CDR2区包含SEQ ID NO：24所示的多肽，所述CDR3区包含SEQ ID NO：25所示的多肽。
2.具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子，所述结合分子包含可变区，所述可变区包含根据Kabat方法确定的CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区包含SEQ ID NO：26所示的多肽，所述CDR2区包含SEQ ID NO：27所示的多肽，所述CDR3区包含SEQ ID NO：28所示的多肽。
3.具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子，所述结合分子包含：重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含根据Kabat方法确定的CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区包含SEQ ID NO：23所示的多肽，所述CDR2区包含SEQ ID NO：24所示的多肽，所述CDR3区包含SEQ ID NO：25所示的多肽；所述轻链可变区包含根据Kabat方法确定的CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述CDR1区包含SEQ ID NO：26所示的多肽，所述CDR2区包含SEQ ID NO：27所示的多肽，所述CDR3区包含SEQ ID NO：28所示的多肽。
4.具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子，所述结合分子包含可变区，所述可变区包含SEQ ID NO：29所示的多肽序列。
5.具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子，所述结合分子包含可变区，所述可变区包含SEQ ID NO：30所示的多肽序列。
6.具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子，所述结合分子包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：29所示的多肽序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：30所示的多肽序列。
7.具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子，所述结合分子包含重链，所述重链包含可变区和恒定区，所述可变区包含SEQ ID NO：29所示的多肽序列，所述恒定区包含SEQ ID NO：31所示的多肽序列。
8.具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子，所述结合分子包含轻链，所述轻链包含可变区和恒定区，所述可变区包含SEQ ID NO：30所示的多肽序列，所述恒定区包含SEQ ID NO：32所示的多肽序列。
9.具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子，所述结合分子包含：重链和轻链，所述重链包含可变区和恒定区，所述可变区包含SEQ IDNO：29所示的多肽序列，所述恒定区包含SEQ ID NO：31所示的多肽序列；所述轻链包含可变区和恒定区，所述可变区包含SEQ ID NO：30所示的多肽序列，所述恒定区包含SEQ ID NO：32所示的多肽序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子是抗体。
11.根据权利要求3或6所述的结合分子，其中所述结合分子是Fab片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的结合分子，其中所述狂犬病病毒源自选自以下的任意一种：蝙蝠、狗、牛、獴、臭鼬和狼。
13.免疫缀合物，其包含与权利要求1至9中任一项所述的结合分子连接的至少一种标签。
14.核酸分子，其编码权利要求1至9中任一项所述的结合分子。
15.表达载体，其包含插入所述表达载体中的权利要求14所述的核酸分子。
16.细胞系，其包含权利要求15所述的表达载体，所述表达载体被转化入宿主细胞以产生具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子。
17.权利要求16所述的细胞系，其中所述宿主细胞为选自以下的任意一种：CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞和HEK293T细胞。
18.用于产生具有结合并中和狂犬病病毒之能力的结合分子的方法，所述方法包括以下步骤：
i)培养权利要求16所述的细胞系；以及
ii)回收在所述细胞系中表达的结合分子。
19.药物组合物，其包含权利要求1至9中任一项所述的结合分子以及可药用赋形剂。
20.用于治疗和预防狂犬病的药物组合物，所述组合物包含权利要求1至9中任一项所述的结合分子以及可药用赋形剂。
21.用于诊断狂犬病的试剂盒，所述试剂盒包含：
i)权利要求1至9中任一项所述的结合分子；以及
ii)容器。
22.用于治疗和预防狂犬病的药盒，所述药盒包含：
i)权利要求1至9中任一项所述的结合分子；以及
ii)容器。
23.用于诊断狂犬病的方法，其包括以下步骤：
i)将来自对象的样品与权利要求1至9中任一项所述的结合分子相接触，以及
ii)分析步骤i)的结果以确定所述对象是否感染有狂犬病。
24.用于预防和治疗狂犬病的方法，所述方法包括向经确认感染有狂犬病的对象施用治疗有效量的权利要求1至9中任一项所述的结合分子。
25.用于检测狂犬病病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
i)将来自对象的样品与权利要求1至9中任一项所述的结合分子相接触，以及
ii)测量所述结合分子是否与所述样品特异性结合。
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