CN101696242A

CN101696242A - 人源抗狂犬病毒中和抗体Fab及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101696242A
Application number: CN200910180629A
Authority: CN
Inventors: 李琛; 朱进
Original assignee: Inst Of Military Medicine Nanjing Military Area Pla
Current assignee: Inst Of Military Medicine Nanjing Military Area Pla
Priority date: 2009-10-26
Filing date: 2009-10-26
Publication date: 2010-04-21
Anticipated expiration: 2029-10-26
Also published as: CN101696242B

Abstract

本发明通过噬菌体抗体展示技术筛选出一株高亲和力的针对G蛋白的人源抗狂犬病毒抗体scFv，运用基因重组技术，将scFv的重链可变区，轻链可变区同人IgG1的CH1，Cλ进行重组，扩增Fab片段。构建人源Fab抗体片段的原核表达质粒并进行可溶性表达，建立了表达蛋白的纯化方法，获得了高纯度的具有中和活性的可溶性蛋白，在狂犬病的诊疗药物中具有潜在的应用前景。

Description

人源抗狂犬病毒中和抗体Fab及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于免疫学或分子生物学技术领域，涉及利用基因重组技术，对人源抗狂犬病毒scFv抗体进行改造，得到一种抗狂犬病毒的中和抗体Fab分子，用于狂犬病的诊断和治疗。

背景技术

抗体的研究最早是在血清学和氨基酸水平上开展的，异源性鼠抗体在人体内诱生免疫应答，产生抗小鼠抗体；人单克隆杂交瘤制备困难，生产量少，稳定性差；获得特异性类别抗体比较困难。随着分子生物学技术的发展，对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，使得抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。

当前，治疗性抗体药物研发已成为生物技术药物领域的热点，抗体药物小型化和高效化也是时下的研究重点。抗体Fab片段由重链Fd段和完整的轻链组成，是完整抗体分子的三分之一，属于小分子抗体，具有穿透力强，半衰期短，较scFv更加稳定的优势，尤其适用于人体疾病的诊疗。

狂犬病治疗是一个世界性的医学难题，人类一旦发病，死亡率几乎是100％。中和抗体因其能够与血液中的狂犬病毒相结合，阻止病毒感染神经细胞，协助清除病毒颗粒，从而抑制狂犬病毒在组织中的扩散。狂犬病毒糖蛋白(G蛋白)是诱导产生抗病毒免疫保护的一种主要抗原，同时也是诱导产生病毒中和抗体并与之反应的唯一抗原。

发明内容

技术问题：本发明通过噬菌体抗体展示技术筛选出一株高亲和力的针对G蛋白的人源抗狂犬病毒抗体scFv，运用基因重组技术，将scFv的重链可变区，轻链可变区同人IgG1的CH1，Cλ进行重组，扩增Fab片段。构建人源Fab抗体片段的原核表达质粒并进行可溶性表达，建立了表达蛋白的纯化方法，获得了高纯度的具有中和活性的可溶性蛋白，在狂犬病的诊疗药物中具有潜在的应用前景。

技术方案：一种人源抗狂犬病毒中和抗体Fab，所述抗体的V_H链的互补决定区CDR具有以下的CDR氨基酸序列：SEQ ID NO.1所示的CDR1；SEQ ID NO.2所示的CDR2；SEQ ID NO.3所示的CDR3；并且所述抗体的V_L链的互补决定区CDR具有以下的CDR氨基酸序列：SEQ ID NO.5所示的CDR5；SEQ ID NO.6所示的CDR6；SEQ ID NO.7所示的CDR7。所述抗体的V_H链具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，V_L链具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。一种人源抗狂犬病毒中和抗体Fab，所述抗体Fd链的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，抗体L链的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。一种DNA分子，编码人源抗狂犬病毒中和抗体Fab氨基酸序列。一种DNA分子，如SEQ ID NO.11所示编码人源抗狂犬病毒中和抗体Fab Fd链的氨基酸序列氨基酸序列，如SEQ ID NO.12所示编码人源抗狂犬病毒中和抗体Fab L链的氨基酸序列氨基酸序列。一种药物组合物，含有上述任一条所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。

有益效果：本发明是利用基因重组技术对一株人源的抗狂犬病毒抗体scFv进行改造，即将scFv的重链可变区、轻链可变区分别和人IgG₁抗体的CH1和Cλ片段重组，再通过重叠延伸PCR扩增到一个全长为1.6kb左右的抗狂犬病毒Fab抗体片段的核苷酸片段Fab抗体片段的核苷酸片段和原核表达质粒pComb3XSS分别用SfiI限制性内切酶酶切后进行连接，构建嵌合Fab片段的原核表达载体，转入大肠杆菌TOP10F′后诱导表达Fab抗体片段，其中Fd段分子量约为34KD，嵌合L链分子量约为26KD，两者通过链间二硫键连接组成人源抗狂犬病毒抗体Fab分子。该蛋白在用于狂犬病诊疗药物中具有潜在的应用前景。

附图说明

图1：人源抗狂犬病单克隆抗体V_H，V_L，Fd，L链和Fab基因的PCR扩增产物电泳；1：DNA Marker(TaKaRa，DL2000)2-6：依次为VH，VL，Fd，L链和Fab基因的PCR扩增产物

图2：以pComb3Xλ为模板扩增的人IgG1的轻链恒定区及重链恒定区1片段电泳结果；1：DNA Marker(TaKaRa，DL2000)2：人Cλ的PCR扩增产物3：人IgG1的CH1的PCR扩增产物

图3：以纯化的Fab为抗原，标记HRP的羊抗人Fab抗体的WB结果；1：纯化的Fab片段2：Protein Marker(fermatas，#0441)

图4：Fab纯化蛋白SDS-PAGE电泳结果；1：纯化的Fab片段2：ProteinMarker(fermatas，#0671)

图5：以狂犬病毒CTN为抗原，抗狂犬病毒抗体Fab分子为一抗的ELISA结果图；1-7：倍比稀释Fab(0.2μg)5×至320×，8：阳性参照9：阴性参照图6：以狂犬病毒CTN为抗原，抗狂犬病毒抗体Fab分子为一抗的WB结果；1：60KD大小处为狂犬病毒糖蛋白，26KD大小处为狂犬病毒基质蛋白。2：Protein Marker

图7：质谱图。狂犬病毒基质蛋白；

图8：狂犬病毒糖蛋白；

图9：质粒pComb3Xλ图谱；

图10：质粒pComb3XSS图谱。

具体实施方式

实施例中如无特别说明，各物质浓度均为质量比浓度，

实施例1.

1)Fab基因的扩增：

噬菌体抗体展示技术进行抗体库的筛选过程如下：

(1)用灭活的狂犬病毒CTN(武汉生物制剂研究所馈赠)为抗原(5μg/mL)包被6孔板，包被液为PBS(pH7.4)，4℃包板过夜。

(2)PBS洗涤6孔板3次，每次5min。

(3)在6孔板中加满2％BSA，37℃封闭2h。

(4)去除封闭液，加入扩增的噬菌体抗体，37℃孵育2h。

(5)去除未结合的噬菌体抗体，PBST缓冲液洗涤6孔板10次(第一轮洗涤10次，以后每轮洗涤20次)。

(6)1mg/mL胰蛋白酶500μl加入6孔板，37℃孵育30min，反复吹打，洗脱特异性结合的噬菌体抗体。

(7)500μl洗脱液感染3.5mL对数生长期E.coli TG1，37℃水浴30min。

(8)滴定洗脱噬菌体的数量：

a.取上一步菌液40μl加入360μl 2×TY培养基，充分混匀。

b.取a液4μl加入396μl 2×TY培养基，充分混匀。

c.取b液4μl加入396μl 2×TY培养基，充分混匀。

d.取c液4μl加入396μl 2×TY培养基，充分混匀。

e.将b、c、d液各取100μl铺于TYE培养板上(含终浓度100μg/mL Amp)，37℃培养过夜。

(9)将过夜培养的菌液以10000g离心5min，去上清，沉淀用1mL 2×TY培养基重悬，混匀后铺于TYE培养板上，37℃培养过夜。

(10)次日，TYE培养板上加入2mL 2×TY培养基(含终浓度15wt％甘油)，用玻璃推子轻刮下所有菌落，混匀。

(11)取50μl菌液加入50mL 2×TY培养基(含终浓度100μg/mL Amp+1wt％葡萄糖)，250rpm，37℃振摇培养至OD_600nm约为0.4。其余菌液加入终浓度15％甘油，-70℃保存。

(12)从50mL 2×TY培养基中取10mL，加入5×10¹⁰pfu辅助噬菌体KM13，37℃水浴30min。

(13)3300g离心30min，去上清，沉淀用50mL 2×TY培养基(含终浓度100μg/mLAmp+50μg/mL Kana+0.1％葡萄糖)重悬，250rpm，30℃振摇培养过夜。

(14)3300g离心15min，收集上清约40mL，加入10mL PEG/Nacl溶液，混匀后置于冰上1h。

(15)3300g离心30min，沉淀用2mL PBS重悬，充分混匀。

(16)10800g离心10min，取上清约2mL。参照方法2(7)，滴定加入噬菌体的数量，1mL上清用于下一轮筛选，剩余约1mL上清置于4℃保存。

(17)重复以上筛选步骤，共进行五轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选并经ELISA鉴定。

筛选获得的scFv的DNA序列如下：

①V_H的核苷酸序列为：

GAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGA

CTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGG

TCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCGATTAATCGTT

CTGGTGATATTACAACGTACGCAGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTC

CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC

CGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAAGACGCGGCGTTTTGACTA

CTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC

V_H对应的氨基酸序列为：

ELLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSINRSGD

ITTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKKTRRFDYWGQG

TLVTVSS

下划线部分为三个CDR区。

②V_L的核苷酸序列为：

GAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAG

TCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATATTGGTGGTTATAACTTTGT

CTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGA

TGCCACTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCT

GGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCT

GATTATTACTGCTGCTCATATGCAGGCGACTACACCCCGGGCGTGGTTTTCG

GCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA

V_L对应的氨基酸序列为：

ESALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDIGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYDATKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGDYTPGVVFGGGTKLTVL

下划线部分为三个CDR区

以scFv基因为模板，用一组扩增人源抗体的上游引物和下游引物扩增Fab的重链可变区和轻链可变区基因。V_H的上游引物是V_HF：5’-GCT GCC CAA CCAGCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG-3’，下游引物为V_HR：5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGTTCC-3’。在V_HF的5′端引入了和人IgG1的Cλ下游引物互补的21个碱基序列即斜体部分序列，V_HR的5′端引入了和人IgG1的CH1上游引物互补的21个碱基序列，即斜体部分，以利于抗狂犬病毒抗体的V_H与人IgG1的CH1片段的重叠PCR扩增。V_L的上游引物为V_LF：5’-GGG CCC AGG CGG CCC AGT CTGCCC TGA CTC AGC CTC GCT CAG TGT CCG GG-3’，下游引物为V_LR：5’-CGAGGG GGC AGC CTT GGG CTG ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC TCCGCC GAA AAC CAC-3’，在V_LF的5’端引入了SfiI的酶切识别位点即下划线部分序列，V_LR的5’端引入了与人的Cλ上游引物5’端互补的21个碱基即斜体部分序列，以V_L与人IgG1的Cλ片段的重叠PCR扩增扩增条件为：94℃变性30s→60℃退火30s→72℃延伸60s，共循环25次。PCR产物经琼脂糖电泳鉴定后，过DNA纯化柱纯化(图1)。

(1)人IgG1抗体的CH1和Cλ段的扩增：

以质粒pComb3Xλ(由scripps institute馈赠，图9)为模板，分别扩增人IgG1抗体的Cλ和CH1核苷酸片段；Cλ段的上游引物为CλF：5′-CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC-3′，下游引物为CλR：5′-GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC-3′；CH1的上游引物为CH1F：5′-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3′，下游引物为CH1R：AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3′。扩增条件均为95℃4分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃60秒，25个循环；72℃延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳，分别扩增出约350bp的条带(见图2)，胶回收纯化扩增条带，溶于去离子水内，-20℃冻存备用；

(2)L链、Fd段基因片段的扩增：

以扩增的人源抗狂犬病毒抗体的V_L及人IgG1抗体的Cλ的PCR扩增产物为模板，用上游引物LF：5′-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGACATTGTGATGACACAGTC-3′和下游引物LR：5′-GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC-3′进行重叠延伸PCR扩增L链，扩增条件为95℃，4分钟；94℃，15秒、56℃，15秒、72℃，2分钟，15个循环；72℃，延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳，扩增出约750bp的条带(见图1)，胶回收扩增条带，溶于去离子水内，-20℃冻存备用。

以扩增的人源抗狂犬病毒抗体的V_H及人IgG1抗体的CH1的PCR扩增产物为模板，用上游引物FdF：5′-GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCTCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3′和下游引物FdR：5′-AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3′进行重叠延伸PCR扩增Fd片段，扩增条件为95℃，4分钟；94℃，15秒、56℃，15秒、72℃，30秒，15个循环；72℃，延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳，扩增出约750bp的条带(见图1)，胶回收扩增条带，溶于去离子水内，-20℃冻存备用。

(3)Fab基因片段的扩增：

以扩增获得的Fd段和L链核苷酸序列的胶回收纯化产物为模板，用上游引物FabF：5′-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGACATTGTGATGACACAGTC-3′和下游引物FabR：5′-AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3′进行重叠延伸PCR扩增，扩增时，先不加引物，94℃4分钟；94℃50秒、56℃50秒、72℃3分钟，6个循环；而后加入FabF、FabR引物后94℃50秒、56℃50秒、72℃2分钟，20个循环；72℃延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳扩增出约1.6kb的条带(见图1)，胶回收纯化扩增条带，溶于去离子水内，-20℃冻存备用。

3)Fab原核表达载体的构建和鉴定：

提取质粒pComb3XSS(由scripps institute馈赠，图10)，质粒及Fab片段的PCR胶回收产物用SfiI限制性内切酶在50℃酶切12-16h，电泳后胶回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水中。取pComb3XSS、Fab扩增产物的酶切产物按1：4摩尔比混匀，在同一离心管内用T4连接酶16℃连接12-16h。

将连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10F’，涂布含氨苄青霉素(100μg/mL)LB平板，置37℃12-16h。次日随机挑取转化菌及空质粒转化对照菌，37℃摇菌3.5小时后，分别用Fab的特异引物对对菌液进行PCR扩增鉴定，含有插入Fab片段质粒的菌株扩增出一条约1.6kb左右的条带。菌液PCR验证扩增出大小正确条带的菌液送生物公司进行测序，DNA序列分析证实在重组质粒中含有构建的嵌合Fab片段，序列正确，其中横线部分为前导序列pelB，方框内TAA为L链翻译终止密码子：(1615bp)

GACTGATTCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTAGGAGGAGGAGG

AGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCT

CCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATATTGGTGGTTATA

ACTTTGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAT

GCCACTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACA

CGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCTGC

TCATATGCAGGCGACTACACCCCGGGCGTGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCG

TCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAG

CTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCG

TGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCA

CACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCC

TGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCAC

CGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTC

TTCTAGATAATTAATTAGGAG

GAATTTAAAATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGC

CCAACCAGCCATGGCCGAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGG

TCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTG

GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCGATTAATCGTTCTGGT

GATATTACAACGTACGCAGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGAGACAATT

CCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTAT

ATTACTGTGCGAAAAAGACGCGGCGTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCAC

CGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGA

GCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTTAAGGACTACTTCCCCGAACC

GGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT

GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG

CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTG

GACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTAGTGGCCAGGCCGGCCAGCAC

CATCACCATCACCATGGCGCATACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCTTCTCTCCTCCT

CCTCCTCCTCAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG

将含有正确重组质粒的菌液按1∶100转入2mL LB溶液中，氨苄青霉素工作浓度为100μg/mL，37℃摇菌过夜；过夜的细菌10000g离心15分钟，弃去上清液，而后用2mL SB重悬，将重悬后的菌液按1∶100转入2mLLB中(氨苄青霉素终浓度为100μg/mL)，37℃培养OD600＝1.0左右，加入异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，25℃振荡培养20h。离心收集菌体，分别处理培养上清、菌体超声上清及超声沉淀，进行SDS-PAGE及western-blot检测，结果Fab片段在菌体超声上清及超声沉淀中均有表达，其中可溶性蛋白存在于菌体超声上清中，Fd段分子量约为34KD，L段分子量约为26KD。

4)表达蛋白的纯化

细菌大量诱导表达后菌液10000g离心15分钟，弃培养上清，沉淀中加入原菌液1/10体积的20mM磷酸盐平衡缓冲液(含0.5M/L NaCl，10mM咪唑)，将细菌重悬；而后对菌液进行超声，超5秒，停5秒，共超40分钟，而后4℃12000rpm离心30分钟，弃沉淀，超声上清用0.22μm滤膜过滤，然后用1mLHistrap HP柱子进行纯化。先用用5倍柱体积的水以1mL/min的速度洗柱子，而后用至少10倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，然后以1mL/min的速度上样；用平衡缓冲液平衡镍柱至基线，分别用5倍柱体积的含50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM咪唑的缓冲液洗柱子，并收集相应浓度咪唑的洗脱液，进行12％SDS-PAGE电泳及Western blot，观察蛋白纯化情况(见图3，4)。结果含100mM咪唑的洗脱液中见纯化的Fab蛋白，用10KD的millpore超滤柱子进行除盐浓缩，PBS洗3次。

实施例2Fab抗体片段的活性鉴定：

I酶联免疫法

用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释狂犬病毒CTN(武汉生物制剂研究所馈赠)至2μg/mL包被ELISA 96孔板，每孔加入50μl，4℃过夜；PBST(PBS含0.5％Tween20)5％BSA洗涤缓冲液封闭，37℃孵育2h；PBST洗涤5次后，每个孔中加入50μl抗狂犬病毒Fab分子(200μg/mL起始浓度，7个浓度梯度稀释)4℃过夜；以1∶2000稀释的羊抗人Fab二抗50μl/孔加入到孔内，37℃孵育30分钟；过氧化物酶底物显色液50μl/孔，室温下15分钟后用2M硫酸中止反应，上机检测比色采用双波长450nm/630nm。结果如图5示，Fab抗体片段能与狂犬病毒CTN起抗原抗体反应。

II免疫印迹法

取20μl狂犬病毒CTN进行SDS page，并电转到硝酸纤维膜上，用5wt％的脱脂奶粉封4℃闭过夜，纯化的Fab 1∶100稀释作为一抗室温至于脱色摇床上2h，1∶2000稀释的HRP标记的羊抗人IgGFab作为二抗，室温至于脱色摇床上2h。DAB显色。可见有两条清晰的条带大小分别为24KD，60KD左右(图6)。MS质谱指纹分析结果显示(图7～8)：24KD大小处对应的为狂犬病毒属基质蛋白，60KD大小处对应的是狂犬病毒属糖蛋白。

以上结果显示制备的人源抗狂犬病毒抗体Fab能够特异地与狂犬病毒结合，并具有较高的中和活性。

本发明与以往技术相比有以下优点：

(1)全人源抗体克服了鼠源抗体的HAMA反应和过敏反应。

(2)小分子抗体Fab较scFv具有更长的半衰期，稳定性更强。

(3)原核表达载体易于构建，可大量表达，生产快速且便于纯化。

(4)具有中和活性的Fab，能够进一步改造为全分子IgG，可用于人类狂犬病的临床治疗的研究。

实施例3：

狂犬病荧光抗体病毒中和试验(FAVN)

Fab按3¹，3²，3³，...3¹²进行稀释；加入100TCID₅₀的CVS-11在37℃湿化培养箱(5％CO₂)感作60min；然后加入BHK-21细胞，培养48h；丙酮固定细胞后，加荧光标记抗狂犬病毒抗体染色，荧光显微镜下读取结果。以100TCID₅₀CVS-11的复制完全被抑制(即没有一个荧光细胞)作为最终抑制效价判定结果，以0.5IU/mL作为狂犬病最低保护单位，制备的Fab中和效价约为10.26IU/mL，显示中和抗体阳性。

序列表

<110>中国人民解放军南京军区军事医学研究所

<120>人源抗狂犬病毒中和抗体Fab及其制备方法和应用

<130>

<141>2009-10-09

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

<210>2

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Ile Asn Arg Ser Gly Asp Ile Thr

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Ala Lys Lys Thr Arg Arg Phe Asp Tyr

<210>4

<211>114

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Glu Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met

Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser

Ile Asn Arg Ser Gly Asp Ile Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

Lys Thr Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

Ser Ser

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr Asn Phe

<210>6

<211>3

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

Asp Ala Thr

<210>7

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>7

Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr Thr Pro Gly Val Val

<210>8

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

Glu Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr

Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

Met Ile Tyr Asp Ala Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp

Tyr Thr Pro Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

<210>9

<211>226

<212>PRT

<213>人工序列

<400>9

Glu Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met

Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser

Ile Asn Arg Ser Gly Asp Ile Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

Lys Thr Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser Gly Gln Ala

Gly Gln

<210>10

<211>218

<212>PRT

<213>人工序列

<400>10

Glu Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr

Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

Met Ile Tyr Asp Ala Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp

Tyr Thr Pro Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

<210>11

<211>678

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

1 GAGCTGTTGG AGTCTGGGGG AGGCTTGGTA CAGCCTGGGG GGTCCCTGAG ACTCTCCTGT

61 GCAGCCTCTG GATTCACCTT TAGCAGCTAT GCCATGAGCT GGGTCCGCCA GGCTCCAGGG

121 AAGGGGCTGG AGTGGGTCTC ATCGATTAAT CGTTCTGGTG ATATTACAAC GTACGCAGAC

181 TCCGTGAAGG GCAGGTTCAC CATCTCCAGA GACAATTCCA AGAACACGCT GTATCTGCAA

241 ATGAACAGCC TGAGAGCCGA GGACACGGCC GTATATTACT GTGCGAAAAA GACGCGGCGT

301 TTTGACTACT GGGGCCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GCGCCTCCAC CAAGGGCCCA

361 TCGGTCTTCC CCCTGGCACC CTCCTCCAAG AGCACCTCTG GGGGCACAGC GGCCCTGGGC

421 TGCCTGGTTA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT CGTGGAACTC AGGCGCCCTG

481 ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTC CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC

541 AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGCACCCAGA CCTACATCTG CAACGTGAAT

601 CACAAGCCCA GCAACACCAA GGTGGACAAG AAAGTTGAGC CCAAATCTTG TGACAAAACT

661 AGTGGCCAGG CCGGCCAG

<210>12

<211>654

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

1 GAGTCTGCCC TGACTCAGCC TCGCTCAGTG TCCGGGTCTC CTGGACAGTC AGTCACCATC

61 TCCTGCACTG GAACCAGCAG TGATATTGGT GGTTATAACT TTGTCTCCTG GTACCAACAA

121 CACCCAGGCA AAGCCCCCAA ACTCATGATT TATGATGCCA CTAAGCGGCC CTCAGGGGTC

181 CCTGATCGCT TCTCTGGCTC CAAGTCTGGC AACACGGCCT CCCTGACCAT CTCTGGGCTC

241 CAGGCTGAGG ATGAGGCTGA TTATTACTGC TGCTCATATG CAGGCGACTA CACCCCGGGC

301 GTGGTTTTCG GCGGAGGGAC CAAGCTGACC GTCCTAGGTC AGCCCAAGGC TGCCCCCTCG

361 GTCACTCTGT TCCCGCCCTC CTCTGAGGAG CTTCAAGCCA ACAAGGCCAC ACTGGTGTGT

421 CTCATAAGTG ACTTCTACCC GGGAGCCGTG ACAGTGGCCT GGAAGGCAGA TGGCAGCCCC

481 GTCAAGGCGG GAGTGGAGAC CACCACACCC TCCAAACAAA GCAACAACAA GTACGCGGCC

541 AGCAGCTATC TGAGCCTGAC GCCTGAGCAG TGGAAGTCCC ACAGAAGCTA CAGCTGCCAG

601 GTCACGCATG AAGGGAGCAC CGTGGAGAAG ACAGTGGCCC CTACAGAATG TTCA

Claims

1.一种人源抗狂犬病毒中和抗体Fab，其特征在于，所述抗体的V_H链的互补决定区CDR具有以下的CDR氨基酸序列：

SEQ IDNO.1所示的CDR1；

SEQ ID NO.2所示的CDR2；

SEQ ID NO.3所示的CDR3；

并且所述抗体的VL链的互补决定区CDR具有以下的CDR氨基酸序列：

SEQ ID NO.5所示的CDR5；

SEQ ID NO.6所示的CDR6；

SEQ ID NO.7所示的CDR7。

2.根据权利要求1所述的人源抗狂犬病毒中和抗体Fab，其特征在于，所述抗体的V_H链具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，V_L链具有如SEQID NO.8所示的氨基酸序列。

3.一种人源抗狂犬病毒中和抗体Fab，其特征在于，所述抗体Fd链的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，抗体L链的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

4.一种DNA分子，其特征在于，编码权利要求1所述人源抗狂犬病毒中和抗体Fab氨基酸序列。

5.一种DNA分子，其特征在于，编码权利要求2所述人源抗狂犬病毒中和抗体Fab氨基酸序列。

6.一种DNA分子，其特征在于，如SEQ ID NO.11所示编码权利要求3所述人源抗狂犬病毒中和抗体Fab Fd链的氨基酸序列氨基酸序列，如SEQID NO.12所示编码权利要求3所述人源抗狂犬病毒中和抗体Fab L链的氨基酸序列氨基酸序列。

7.一种药物组合物，其特征在于含有上述权利要求任一条所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。