CN103980196A - 一种海南暗罗根提取物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海南暗罗根提取物的制备方法，是取海南暗罗根的干燥粉末用碱水润湿后，加入溶剂提取；提取液经过滤、减压浓缩得到总提取物，加水混悬，用氯仿萃取，减压回收得到氯仿萃取部位，即为海南暗罗根亲脂性总生物碱部位，该部位包括四个咔唑类、三个阿朴菲类和一个酰胺类生物碱。本发明制得的提取物得率高，工艺流程简单，成本低廉，适合较大规模的制备，提取物具有很好的广谱抗肿瘤活性，可以应用于预防和治疗肿瘤药物中。

Description

一种海南暗罗根提取物的制备方法
技术领域
本发明属于天然植物有效成分的提取分离技术领域，涉及一种海南暗罗根提取物的制备方法。
背景技术
番荔枝科(Annonaceae)暗罗属(Polyalthia)植物，常为直立灌木。据中国植物志记载，该属植物全世界约有200种，分布于马来西亚、菲律宾、印度、斯里兰卡等亚热带地区[中国科学院华南植物研究所.海南植物志.第1卷.北京:科学出版社.1964,p247]。在印度民间，暗罗属植物被用作传统退烧药、堕胎药、降压药等。目前化学成分研究已从暗罗属植物中得到了生物碱类、二萜类(主要为克罗烷和对映贝壳衫烷)、三萜类等多种结构类型化学成分，同时药理研究发现部分化合物表现出良好抗肿瘤[Tuchinda P,Munyoo B,Pohmakotr M et al.Cytotoxic styryl lactones from the leaves and twigs of Polyalthia crassa.J.Nat.Prod.,2006,12,1728-33；Lee T.H,Wang M.J,Chen P.Y.et al.Constituents of Polyalthialongifolia var.pendula.J.Nat.Prod.,2009,72:1960–1963]、抗菌[Murthya M.M,Subramanyama M,Bindub M.H et al.Antimicrobial activity of clerodanediterpenoids from Polyalthia longifolia seeds.Fitoterapia,2005,76:336–339；RashidM.A,Hassain M.A,Hasan C.M et al.Antimicrobial diterpene from Polyalthialongifolia var pendulla.Phytother Res.,1996,10:79-81]等生物活性。
暗罗属植物我国有17种，主要分布于云南、广东、广西南部及海南。在海南民间，该属植物被用于治疗气滞腹痛、痛经、梅核气等疾病。其中，海南暗罗(Polyalthia laui Merr.)为我国特有植物，仅分布于海南岛。前期初步研究发现，海南暗罗的乙醇提取物具有很好的抗肿瘤活性[Yuan Y,Huang G.J,Wang T.S etal.In vitro screening of five Hainan plants of Polyalthia(Annonaceae)against humancancer cell lines with MTT assay.Phytother.Res.,2010,27:1-15]，但目前国内外未见到有关生物碱提取及相关生物活性的研究报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种海南暗罗根提取物的制备方法，利用简单的提取分离方法对海南暗罗的根部位中亲脂性总生物碱进行制备，完成抗肿瘤活性测试，经多次柱层析，阐明其化学成分。
本发明所采用的技术方案：
一种海南暗罗根提取物的制备方法，其步骤如下：
1、取海南暗罗根的干燥粉末，用碱水润湿后，加入溶剂进行提取。所述碱水是5～30％的石灰乳溶液、5～30％的Na2CO3溶液或10％氨水；所述溶剂是85～95％的乙醇或甲醇溶液。
2、将海南暗罗的根提取液经过滤、减压浓缩得到总提取物，提取物加水混悬，氯仿萃取，减压回收得到氯仿萃取部位，即亲脂性总生物碱。
3、氯仿萃取部位经反复柱层析，得到8个生物碱类化合物，其中4个为咔唑类、3个为阿朴菲类、1个为酰胺类生物碱。
上述方法中，所述海南暗罗根的干燥粉末是将海南暗罗的根经阴干后粉碎得到。
上述方法中，所述提取方法包括室温浸泡、加热或超声提取。
上述方法中，海南暗罗根药材与溶剂的体积比为1：1～1：10。
上述方法中，柱层析用填料为柱层析用硅胶或葡聚糖凝胶。
上述方法中，8个生物碱类化合物(4个为咔唑类，3个阿朴菲类和1个为酰胺类)，分别为Darienine、Isooncodine、Onychine、5,8-dihydroxy-6-methoxy-onychine、Liridine、Liriodenine、Oxostephanine和香豆酰基酪胺。
本发明的提取物具有广谱抗肿瘤活性，可以广泛应用于预防和治疗肿瘤药物中。
本发明的优点在于：
1)利用简单的提取分离方法，对海南暗罗的根部位中亲脂性总生物碱进行提取制备，抗肿瘤活性筛选，并经多次柱层析，阐明该活性部位的化学成分。
2)本发明所得提取物的化学成分明确。
3)所得提取物具有很好的广谱抗肿瘤活性，可以广泛用于预防和治疗肿瘤药物中。
4)本法明制得的提取物得率高，工艺流程简单，成本低廉，适合较大规模的制备。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
海南暗罗根提取物的制备方法步骤如下：
1)、将粉碎后的海南暗罗根药材(过20～80目筛)用碱水(是5～30％的石灰乳溶液、5～30％的Na2CO3溶液或10％氨水等)润湿后，加入85～95％的乙醇或甲醇溶液，室温浸泡、加热或超声提取，提取时间为60分钟至7天，料液比为1：1～1：10。
2)、将海南暗罗的根提取液过滤、减压回收得到总提取物，提取物加水混悬，采用氯仿萃取，减压回收得到氯仿部位，即亲脂性总生物碱。
3)、对氯仿部位进行反复柱层析：石油醚-乙酸乙酯(10:1,v/v)硅胶柱层析得到化合物(5)；石油醚-氯仿(5:1,v/v)硅胶柱层析得到化合物(6)；石油醚-乙酸乙酯(4:1,v/v)重结晶得到化合物(1)；氯仿-乙酸乙酯(20:1-1:10，v/v)硅胶柱层析，再经氯仿-甲醇(1:10,v/v)凝胶色谱纯化得到化合物(7)；石油醚-乙酸乙酯(3:1,v/v)制备薄层色谱纯化得到化合物(2)；氯仿-乙酸乙酯(6:1,v/v)洗脱，再经制备薄层色谱纯化石油醚-乙酸乙酯(2:1,v/v)得到化合物(3)；氯仿-乙酸乙酯(5:1,v/v)硅胶柱层析纯化得到化合物(4)；氯仿-乙酸乙酯(2:1,v/v)硅胶柱层析纯化得到化合物(8)。
4)、综合应用多种光谱和波谱技术(包括IR、UV、MS、1D/2D NMR)结合相关文献参考，对纯化得到的单体化合物进行结构鉴定，上述8个化合物都为生物碱类化合物(分别为4个咔唑类，3个阿朴菲类和1个酰胺类)，具体结构为Darienine(1)、Isooncodine(2)、Onychine(3)、5,8-dihydroxy-6-methoxy-onychine(4)、Liridine(5)、Liriodenine(6)、Oxostephanine(7)和香豆酰基酪胺(8)，测定结构可靠。
下面结合实施例对本发明作详细说明。
实例一、海南暗罗的根部位的亲脂性总生物碱的制备
取海南暗罗的根(10Kg)阴干后粉碎，10％氨水润湿，室温下采用95％乙醇室温浸泡3次，7天/次，合并提取液，减压浓缩得总提取物(0.5Kg)，加水悬浮分散，采用氯仿萃取，得氯仿萃取部位(25g)。
氯仿萃取部位经过反复硅胶、葡聚糖凝胶(Sephdex LH-20)柱层析，得到4个咔唑类，3个阿朴菲类和1个酰胺类生物碱，分别为：石油醚-乙酸乙酯(10:1,v/v)硅胶柱层析Liridine(5)7.6mg；石油醚-氯仿(5:1,v/v)硅胶柱层析得到Liriodenine(6)10.5mg；石油醚-乙酸乙酯(4:1,v/v)重结晶得到Darienine(1)6.3mg；氯仿-乙酸乙酯(20:1-1:10，v/v)硅胶柱层析，再经氯仿-甲醇(1:10,v/v)凝胶色谱纯化得到Oxostephanine(7)3.1mg；石油醚-乙酸乙酯(3:1,v/v)制备薄层色谱纯化得到Isooncodine(2)7.4mg；氯仿-乙酸乙酯(6:1,v/v)洗脱，再经制备薄层色谱纯化石油醚-乙酸乙酯(2:1,v/v)得到Onychine(3)3.4mg；氯仿-乙酸乙酯(5:1,v/v)硅胶柱层析纯化得到5,8-dihydroxy-6-methoxy onychine(4)2.2mg；氯仿-乙酸乙酯(2:1,v/v)硅胶柱层析纯化得到香豆酰基酪胺(8)2.2mg。化学结构如下：
实施例二、海南暗罗根氯仿萃取部位(亲脂性总生物碱部位)抗肿瘤活性研究
1、实验方法：将四种肿瘤细胞株K562、SPCA-1、SGC-7901，BEL-7402用含10％小牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养。采用MTT法进行细胞增殖抑制试验，主要操作为：取对数生长期的肿瘤细胞株，用0.25％的胰蛋白酶消化，10％新生小牛血清的RPMI-1640培养液调制成5×104个/ml-1的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种180μL。在37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养8-10h，待其贴壁，每个孔加入用PBS配制的样品液，使得样品终浓度分别为1，10，和100μg/mL。每个浓度平行3孔，继续培养44h后，每孔加入50μL MTT(1mg/mL-1,PBS配制)，在37℃、5％CO2条件下继续温育4h，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μL DMSO，在微型振荡器上摇匀15min，结晶溶解后，在酶联免疫检测仪上选择570nm，测定各孔的吸光值，同时设置空白组(仅加入含细胞的培养液)和对照组(以培养液替代药物)，计算细胞增殖抑制率。抑制率(％)＝(1-实验组3孔OD值平均值/对照组3孔OD值平均值)×100％。以抑制率作纵坐标，作回归曲线，计算出样品IC50值。采用SPSS13.0统计软件包进行数据处理及统计分析。
2、实验结果(见表1)
由实施例1得到的海南暗罗根氯仿萃取部位对所选肿瘤细胞株K562、SPCA-1、SGC-7901、BEL-7402均显示不同程度的增殖抑制活性。
表1海南暗罗根亲脂性总生物碱部位的抗肿瘤活性
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种海南暗罗根提取物的制备方法，其特征在于，其步骤如下：
1)、取海南暗罗根的干燥粉末，用碱水润湿后，加入溶剂进行提取；所述碱水是5～30％的石灰乳溶液、5～30％的Na2CO3溶液或10％氨水；所述溶剂是85～95％的乙醇或甲醇溶液；
2)、将海南暗罗的根提取液经过滤、减压浓缩得到总提取物，提取物加水混悬，氯仿萃取，减压回收得到氯仿萃取部位，即亲脂性总生物碱；
3)、氯仿萃取部位经反复柱层析，得到8个生物碱类化合物，其中4个为咔唑类、3个为阿朴菲类、1个为酰胺类生物碱。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述海南暗罗根的干燥粉末是将海南暗罗的根经阴干后粉碎得到。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述提取方法包括室温浸泡、加热或超声提取。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：海南暗罗根药材与溶剂的体积比为1：1～1：10。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：柱层析用填料为柱层析用硅胶或葡聚糖凝胶。
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