CN103966140A

CN103966140A - 一种培养葡糖醋杆菌的方法

Info

Publication number: CN103966140A
Application number: CN201410208851.5A
Authority: CN
Inventors: 王志国; 王锡彬
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2014-05-16
Filing date: 2014-05-16
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2034-05-16
Also published as: CN103966140B

Abstract

本发明涉及微生物培养技术领域，公开了一种培养葡糖醋杆菌的方法。本发明所述方法将保存在固体培养基上的葡糖醋杆菌用液体培养基依次进行菌种活化、种子液制备，然后种子液转接到新鲜的液体培养基中进行产纤维素培养，同时在培养容器内设置筛网。本发明针对葡糖醋杆菌在培养时易出现负变异菌株的问题，通过安装筛网这种简便的方式，让菌体产生纤维素时，可附着于筛网上，既避免了负变异菌株的出现，同时又提高了纤维素产量，能够广泛应用于葡糖醋杆菌的培养中。

Description

一种培养葡糖醋杆菌的方法

技术领域

本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种培养葡糖醋杆菌的方法。

背景技术

葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)，原是醋杆菌属下(Acetobacter)的葡糖醋杆菌亚属，该亚属于1997年被Yamada等人在16S rRNA序列分析和泛醌类型研究基础上，提升为葡糖醋杆菌属。该属下目前有16个种，其中7个种能产生纤维素，分别为Ga.europaeus,Ga.intermedius,Ga.hansenii,Ga.xylinus,Ga.swingsii,Ga.rhaeticus,Ga.nataicola,Ga.kombuchae。在以前的文献及现在的一些文献中所提及的木醋杆菌(Acetobacter xylinum)就等同于Ga.xylinus(或G.xylinus)。

葡糖醋杆菌产生的纤维素又称为细菌纤维素(Bacterial cellulose,BC)，因其纯度、结晶度、持水力、杨氏模量高及生物相容性好等独特性能，广泛应用于食品、医药、造纸、音响等领域。

常用的培养葡糖醋杆菌有3种方式：浅盘静置培养、振荡培养、气升式培养。

浅盘静置方式培养时，在收获BC前不宜触动，否则气/液界面很难成膜，这使发酵过程中的氧气浓度、pH维持及营养成分的补充都无法实现，从而降低了生产效率。但当装液量大时，易出现负变异菌株，导致BC产量降低。

振荡培养时，发酵过程中的氧气浓度、pH维持及营养成分都便于控制，因此，得以广泛研究，但振荡培养时的最大的缺点是在剪切力的作用下，葡糖醋杆菌易出现不产BC的负变异菌株，从而降低了BC的产量。

气升式培养时，发酵过程中的氧气浓度、pH维持及营养成分的补充便于控制，但其缺点是在气体冲击下，菌体运动加剧，易出现负变异菌株，导致BC产量下降。

可以看出，现有的常规培养方法都会出现负变异菌株，导致BC产量的降低。因此，需要提供一种简便的培养方法来解决此问题，提高生产效率。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种培养葡糖醋杆菌的方法，使得所述方法能够显著提高细菌纤维素的产量；

本发明的另一个目的在于提供一种培养葡糖醋杆菌的方法，使得所述方法能够完全避免负变异菌株的产生。

为实现以上发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种培养葡糖醋杆菌的方法，将保存在固体培养基上的葡糖醋杆菌用液体培养基依次进行菌种活化、种子液制备，然后种子液转接到新鲜的液体培养基中进行产纤维素培养，同时在培养容器内设置筛网。

针对现有的常规培养方式易产生负变异菌株，导致细菌纤维素产量不高的缺陷，本发明采用在培养容器中设置筛网的简便方式，避免负变异菌株的产生，提高细菌纤维素的产量。

本发明所述方法中菌种活化、种子液制备以及所采用的培养基可按照本领域常规方法进行相关操作。作为优选，本发明菌种活化、种子液制备具体为：

固体培养基(100mL)：2g葡萄糖、0.5g酵母膏、0.5g蛋白胨、0.27g Na₂HPO₄、0.115g柠檬酸，2g琼脂，121℃，15min灭菌，适用于菌种保存；

液体培养基(100mL)：2g葡萄糖、0.5g酵母膏、0.5g蛋白胨、0.27g Na₂HPO₄、0.115g柠檬酸，121℃，15min灭菌，适用于静置培养；

液体培养基(100mL)：2g葡萄糖、0.5g酵母膏、0.5g蛋白胨、0.27g Na₂HPO₄、0.115g柠檬酸，1g乙醇，121℃，15min灭菌，适用于气升式培养和振荡培养；

液体培养基(100mL)：自然发酵椰子水20-99mL、4g白砂糖、0.3g(NH₄)₂SO₄、0.1g KH₂PO₄、0.05g MgSO₄，pH4.5，105℃，15min消毒，适用于振荡培养结合气升式培养；

挑取固体培养基上的葡糖醋杆菌于50mL液体培养基中进行菌种活化，30℃静置培养4d；菌种活化液按5％(v/v)的接种量转接于100mL液体培养基，30℃静置培养4d，制备种子液。

作为优选，所述培养为静置培养、振荡培养、气升式培养或振荡培养结合气升式培养。进一步优选地，所述静置培养培养温度为30℃，所述振荡培养培养温度为30℃，转速120rpm，所述气升式培养培养温度为30℃，通气率为2.5L/min，所述振荡培养结合气升式培养的培养温度为30℃，转速120rpm，通气率为2.5L/min。

作为优选，所述种子液接种量为5％，即每100mL中接种5mL种子液。

作为优选，所述设置筛网的方式具体为：

设置2个或2个以上第一筛网，所述各第一筛网相互平行且沿竖直方向依次排布，各第一筛网之间相距3-8cm，各第一筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm，位于顶层的第一筛网距液面距离为3-8cm，位于底层的第一筛网距容器底面为3-8cm，示意图见图1；

或，

设置2个或2个以上第二筛网，所述各第二筛网沿竖直方向延伸并相互交叉于其竖直轴心线上，各第二筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm，第二筛网至少高于液面0.5cm，第二筛网距容器底面为0cm，示意图见图2；

或，

设置2个或2个以上第三筛网，所述各第三筛网沿竖直方向延伸并相互交叉于其竖直轴心线上，在所述各第三筛网横截面上设置有2个或2个以上的第四筛网，所述各第四筛网相互平行且沿竖直方向依次排布，各第四筛网之间相距3-8cm，位于顶层的第四筛网距液面距离为3-8cm，位于底层的第四筛网距容器底面为3-8cm；各第三筛网和第四筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm，所述第三筛网至少高于液面0.5cm，第三筛网距容器底面为0cm，示意图见图3。

本发明所举示意图只是为了便于理解筛网设置方式，并不对其形状、数量、高度等起限定作用，其中筛网数量可根据容器的体积合理设置，本发明示意图均以2个为例。

更优选地，所述设置筛网的方式具体为：

设置2个第一筛网，所述2个第一筛网相互平行且沿竖直方向依次均布，所述2个第一筛网的中心位于同一竖直轴线上，各第一筛网之间相距3-8cm，各第一筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm，位于顶层的第一筛网距液面距离为3-8cm，位于底层的第一筛网距容器底面为3-8cm，示意图见图1；

或，

设置2个第二筛网，所述2个第二筛网沿竖直方向延伸并相互垂直交叉于其竖直轴心线上，所述2个第二筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm，第二筛网至少高于液面0.5cm，第二筛网距容器底面为0cm，示意图见图2；

或，

设置2个第三筛网，所述2个第三筛网沿竖直方向延伸并相互垂直交叉于其竖直轴心线上，在所述2个第三筛网横截面上设置有2个第四筛网，所述2个第四筛网相互平行且沿竖直方向依次均布，所述2个第四筛网的中心位于同一竖直轴线上，各第四筛网之间相距3-8cm，位于顶层的第四筛网距液面距离为3-8cm，位于底层的第四筛网距容器底面为3-8cm；各第三筛网和第四筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm，所述第三筛网至少高于液面0.5cm，第三筛网距容器底面为0cm，示意图见图3。

作为优选，本发明所述筛网为不锈钢筛网、塑料筛网、棉布筛网、陶瓷筛网或硅胶筛网。

作为优选，本发明所述筛网网格大小≥18目。

作为优选，本发明所述筛网网格形状为方形或圆形。

作为优选，本发明所述筛网为圆形或矩形。

在本发明所述方法和未安装筛网的常规培养方法的对比试验中，保证其他所有培养条件一致，仅存在设置筛网和未设置筛网的区别，结果显示，本发明所述方法在培养过程中，负变异率为0，而对照的方法负变异率在28-60％，细菌纤维素产量也得到显著提高。

由以上技术方案可知，本发明针对葡糖醋杆菌在培养时易出现负变异菌株的问题，通过安装筛网这种简便的方式，让菌体产生纤维素时，可附着于筛网上，既避免了负变异菌株的出现，同时又提高了纤维素产量，能够广泛应用于葡糖醋杆菌的培养中。

附图说明

图1所示为本发明筛网设置方式示意图；其中h即表示顶层第一筛网距液面的距离，也表示各第一筛网之间的距离，d表示各第一筛网侧边缘距容器内侧壁的距离；

图2所示为本发明筛网设置方式示意图；其中，h表示第二筛网高于液面的高度，d表示各第二筛网侧边缘距容器内侧壁的距离；

图3所示为本发明筛网设置方式示意图；其中，h表示第三筛网高于液面的高度，d表示各第三筛网和第四筛网侧边缘距容器内侧壁的距离；

图4所示为负变异菌株和正常菌株的对比图，其中箭头所指为负变异菌株。

具体实施方式

本发明公开了一种培养葡糖醋杆菌的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的一种培养葡糖醋杆菌的方法做进一步说明。

实施例1：静置培养

液体液体培养基(100mL)：2g葡萄糖、0.5g酵母膏、0.5g蛋白胨、0.27gNa₂HPO₄、0.115g柠檬酸，121℃，15min灭菌。

菌种活化：挑取固体培养基上的葡糖醋杆菌于50mL种子培养液中，30℃静置培养4d。

种子液制备：菌种活化液按5％(v/v)的接种量转接于100mL液体培养液，30℃静置培养4d。

静置培养生产：种子液按5％(v/v)的接种量转接于800mL液体培养液，30℃，4d，以不安装筛网作对照，每个实验重复3次。

此处采用的筛网结构如图1所示，具体设置方式如下描述：

设置2个第一筛网，所述2个第一筛网相互平行且沿竖直方向依次均布，所述2个第一筛网的中心位于同一竖直轴线上，各第一筛网之间相距3-8cm(3次重复试验分别为3cm、5cm、8cm)，各第一筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm(3次重复试验分别为1cm、0.5cm、0.2cm)，位于顶层的第一筛网距液面距离为3-8cm(3次重复试验分别为3cm、5cm、8cm)，位于底层的第一筛网距容器底面为3-8cm(3次重复试验分别为3cm、5cm、8cm)。

分析方法：

纤维素产量分析：筛网上的纤维素用镊子剥取，没有筛网中的纤维素通过16层纱布过滤后获取，置于80℃，0.1mol/L NaOH溶液中，维持2h，冷却后用0.1mol/L HCl中和、自来水充分洗涤，在80℃下干燥至恒重，称重。

负变异株率：将种子液取1mL，加入9mL无菌0.85％生理盐水，稀释至一定浓度，取0.1mL稀释液涂布于固体平板上，置于30℃静置培养6d，计数，负变异率＝负变异株菌落数/总菌落数(以百分率表示)。负变异株呈现个体变大、粘稠状(见图4箭头所指菌株)，与野生型菌株的菌落形态明显不同。

结果如表1所示。

表1筛网对葡糖醋杆菌静置培养中负变异率的控制及BC产量的影响

筛网	BC产量(g/L)	均值(g/L)	负变异率(％)	均值(％)
					有	3.98、4.13、3.79	3.97	0、0、0	0
无	2.97、3.21、2.86	3.01	32.4、33.8、36.7	34.3

由表1可以看出，本发明所述方法完全避免负变异菌株的出现，同时显著提高了BC产量。

实施例2：气升式培养

液体培养基(100mL)：2g葡萄糖、0.5g酵母膏、0.5g蛋白胨、0.27gNa₂HPO₄、0.115g柠檬酸，1g乙醇，121℃，15min灭菌。

菌种活化及种子液制备见实施例1。

气升式培养生产：种子液按5％(v/v)的接种量转接于1000mL液体培养基，30℃，通气率2.5L/min，4d。以不安装筛网作对照，每个实验重复3次。此处采用的筛网结构如图1所示，具体设置方式如下描述：

设置2个第一筛网，所述2个第一筛网相互平行且沿竖直方向依次均布，所述2个第一筛网的中心位于同一竖直轴线上，各第一筛网之间相距3-8cm(3次重复试验分别为4cm、6cm、7cm)，各第一筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm(3次重复试验分别为0.8cm、0.3cm、0cm)，位于顶层的第一筛网距液面距离为3-8cm(3次重复试验分别为4cm、6cm、7cm)，位于底层的第一筛网距容器底面为3-8cm(3次重复试验分别为4cm、6cm、7cm)。

分析方法见实施例1。

结果见表2。

表2筛网对葡糖醋杆菌气升式培养中负变异率的控制及BC产量的影响

筛网	BC产量(g/L)	均值(g/L)	负变异率(％)	均值(％)
					有	7.21、7.06、7.88	7.38	0、0、0	0
无	3.98、4.21、4.15	4.11	34.6、28.8、30.0	31.1

由表2可以看出，本发明所述方法完全避免负变异菌株的出现，同时显著提高了BC产量。

实施例3：摇床振荡培养

液体培养基，菌种活化及种子液制备见实施例2。

振荡培养生产：种子液按5％(v/v)的接种量转接于500mL培养液，30℃，120rpm，4d，以不安装筛网作对照，每个实验重复3次。此处采用的筛网结构如图2所示，具体设置方式如下描述：

设置2个第二筛网，所述2个第二筛网沿竖直方向延伸并相互垂直交叉于其竖直轴心线上，所述2个第二筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm(3次重复试验分别为1cm、0.4cm、0cm)，第二筛网至少高于液面0.5cm(3次重复试验分别为0.5cm、1cm、3cm)，第二筛网距容器底面为0cm。

分析方法见实施例1。

结果如表3所示。

表3筛网对葡糖醋杆菌振荡培养中负变异率的控制及BC产量的影响

筛网	BC产量(g/L)	均值(g/L)	负变异率(％)	均值(％)
					有	6.25、5.98、6.56	6.26	0、0、0	0
无	3.21、2.65、3.42	3.09	67.8、78.3、73.2	73.1

由表3可以看出，本发明所述方法完全避免负变异菌株的出现，同时显著提高了BC产量。

实施例4：振荡及气升式培养

液体培养基(100mL)：自然发酵椰子水20-99mL(3次重复试验分别为20mL、99mL、60mL)、白砂糖4％、0.3％(NH₄)2SO₄、0.1％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄，用10％NaOH或10％HCl调节pH至4.5，105℃，15min消毒。

菌种活化及种子液制备见实施例1。

振荡及气升式培养：种子液按5％(v/v)的接种量转接于800mL培养液，30℃，120rpm，通气率2.5L/min，4d，以不安装筛网作对照，每个实验重复3次。此处采用的筛网结构如图3所示，具体设置方式如下描述：

设置2个第三筛网，所述2个第三筛网沿竖直方向延伸并相互垂直交叉于其竖直轴心线上，在所述2个第三筛网横截面上设置有2个第四筛网，所述2个第四筛网相互平行且沿竖直方向依次均布，所述2个第四筛网的中心位于同一竖直轴线上，各第四筛网之间相距3-8cm(3次重复试验分别为3cm、5cm、8cm)，位于顶层的第四筛网距液面距离为3-8cm(3次重复试验分别为3cm、5cm、8cm)，位于底层的第四筛网距容器底面为3-8cm(3次重复试验分别为4cm、6cm、7cm)；各第三筛网和第四筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm(3次重复试验分别为1cm、0.5cm、0cm)，所述第三筛网至少高于液面0.5cm(3次重复试验分别为0.5cm、2cm、4cm)，第三筛网距容器底面为0cm。

分析方法见实施例1。

结果见表4。

表4筛网对葡糖醋杆菌振荡及气升式培养中负变异率的控制及BC产量的影响

筛网	BC产量(g/L)	均值(g/L)	负变异率(％)	均值(％)
					有	7.36、7.57、7.92	7.62	0、0、0	0
无	4.32、4.67、4.47	4.49	54.6、58.6、58.3	57.2

由表4可以看出，本发明所述方法完全避免负变异菌株的出现，同时显著提高了BC产量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种培养葡糖醋杆菌的方法，其特征在于，将保存在固体培养基上的葡糖醋杆菌用液体培养基依次进行菌种活化、种子液制备，然后种子液转接到新鲜的液体培养基中进行产纤维素培养，同时在培养容器内设置筛网。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述产纤维素培养为静置培养、振荡培养、气升式培养或振荡结合气升式培养。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述设置筛网的方式具体为：

设置2个或2个以上第一筛网，所述各第一筛网相互平行且沿竖直方向依次排布，各第一筛网之间相距3-8cm，各第一筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm，位于顶层的第一筛网距液面距离为3-8cm，位于底层的第一筛网距容器底面为3-8cm；

或，

设置2个或2个以上第二筛网，所述各第二筛网沿竖直方向延伸并相互交叉于其竖直轴心线上，各第二筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm，第二筛网至少高于液面0.5cm，第二筛网距容器底面为0cm；

或，

设置2个或2个以上第三筛网，所述各第三筛网沿竖直方向延伸并相互交叉于其竖直轴心线上，在所述各第三筛网横截面上设置有2个或2个以上的第四筛网，所述各第四筛网相互平行且沿竖直方向依次排布，各第四筛网之间相距3-8cm，位于顶层的第四筛网距液面距离为3-8cm，位于底层的第四筛网距容器底面为3-8cm；各第三筛网和第四筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm，所述第三筛网至少高于液面0.5cm，第三筛网距容器底面为0cm。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述设置筛网的方式具体为：

设置2个第一筛网，所述2个第一筛网相互平行且沿竖直方向依次均布，所述2个第一筛网的中心位于同一竖直轴线上，各第一筛网之间相距3-8cm，各第一筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm，位于顶层的第一筛网距液面距离为3-8cm，位于底层的第一筛网距容器底面为3-8cm；

或，

设置2个第二筛网，所述2个第二筛网沿竖直方向延伸并相互垂直交叉于其竖直轴心线上，所述2个第二筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm，第二筛网至少高于液面0.5cm，第二筛网距容器底面为0cm；

或，

设置2个第三筛网，所述2个第三筛网沿竖直方向延伸并相互垂直交叉于其竖直轴心线上，在所述2个第三筛网横截面上设置有2个第四筛网，所述2个第四筛网相互平行且沿竖直方向依次均布，所述2个第四筛网的中心位于同一竖直轴线上，各第四筛网之间相距3-8cm，位于顶层的第四筛网距液面距离为3-8cm，位于底层的第四筛网距容器底面为3-8cm；各第三筛网和第四筛网侧边缘距容器内侧壁距离≤1cm，所述第三筛网至少高于液面0.5cm，第三筛网距容器底面为0cm。

5.根据权利要求1-4任意一项所述方法，其特征在于，所述筛网为不锈钢筛网、塑料筛网、棉布筛网、陶瓷筛网或硅胶筛网。

6.根据权利要求1-4任意一项所述方法，其特征在于，所述筛网网格大小≥18目。

7.根据权利要求1-4任意一项所述方法，其特征在于，所述筛网网格形状为方形或圆形。

8.根据权利要求1-4任意一项所述方法，其特征在于，所述筛网为圆形或矩形。