CN103952488A - 检测人18、13号和性染色体str基因型的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种单管复合扩增检测人类18号、13号染色体和性染色体STR基因型的试剂盒，由扩增试剂和扩增产物检测试剂组成，主要包含22对引物混合物、分子量内标、等位基因分型标准品等成分，避免了试剂配置过程中产生的污染或误差，保证了结果的准确性和稳定性,有利于控制实验室质量。本发明试剂盒检测灵敏度高，在25μL扩增反应体系中，DNA模板量低至0.12ng的条件下也可检出全部22个基因座；检测特异性强，加入一定浓度的DNA量进行复合扩增，不产生22个基因座以外的扩增产物，适用标本类型多，并实现检测结果的质量可控和标准化，具有临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及荧光定量PCR技术(QF-PCR)，具体涉及一种快速高通量检测人类18号、13号常染色体和X、Y性染色体STR基因型的试剂盒，主要用于上述染色体非整倍体的检测。
背景技术
18三体综合征(爱德华氏综合征)是常见的三体综合征之一，新生儿发病率约为1/8000-1/3500，该综合征患者存在严重的智力低下和多种生理缺陷，如胎儿生长受限，脉络膜囊肿，心脏畸形，脑室轻度积水等，很少能存活至成年；13三体综合征(Patau综合征)，新生儿中的发病率约为1/7000-1/5000，表现为严重的脏器畸形和智力低下，多在婴儿期夭折。这两类染色体异常为严重出生缺陷且目前无法治疗，主要通过产前诊断进行预防。
性染色体异常综合征主要有：Klinefelter综合征(47，XXY)，超雄综合征(47，XYY)，超雌综合征(47，XXX)，Turner综合征(45，X)等，这些疾病患者的共同临床特征是男性或女性性器官发育不全，患者可伴有其他脏器结构或功能异常，或伴有一定智力低下或精神神经障碍等临床表现，早期诊断和干预可以有效缓解病情。
三倍体综合征是一种严重的、致死性的染色体病，能活到出生的三倍体患儿极为罕见，存活者都是二倍体/三倍体的嵌合体。其主要症状为智力与身体发育障碍、畸形。绝大部分的三倍体胎儿在孕早期即流产，是自然流产组织染色体异常中较常见的类型。检测胚胎绒毛染色体数目异常有助于指导下次妊娠。
我国大规模开展上述染色体病诊断的主要手段是染色体核型分析技术，产前是采集绒毛、羊水或脐血做胎儿染色体核型分析，出生后诊断则直接采集外周血进行染色体检查。染色体核型分析方法准确、可靠，但建立在手工操作基础上，依赖人工分析和经验积累，存在需要进行细胞培养、检测周期长(2-3周时间)、检测通量低下等诸多局限性。另一临床常用的荧光原位杂交技术(FISH)一般用于染色体异常的辅助检测，可在48小时内快速诊断，但该方法手工操作繁琐、检测通量低下。因此，发展一种快速、准确、通量高、自动化程度强的诊断方法十分必要。
QF-PCR是一种基于STR(短串联重复序列)基因型分析的快速分子诊断技术。STR是第二代遗传分子标记，遵循孟德尔遗传规律，具有高度多态性、易于检测等优点，通过定性、定量分析STR基因型能用于目标染色体数目的检测。基于多色荧光标记技术、PCR扩增技术和毛细管电泳，能够实现STR基因型分析的半自动化检测，有助于突破目前染色体核型分析的技术瓶颈，达到快速、准确、高通量诊断目标染色体数目异常的目的。但是目前用于染色体数目检测的QF-PCR商品化试剂盒，如英国的Aneufast、Elucigene QSTR，瑞典的ChromoQuent、Deryser，美国ABI的TrueScienceTM Aneuploidy STR Kits，所选择的高多态性基因座都是基于白人(或高加索人)的群体样本，可能未必适用于中国人群。国内自主开发的QF-PCR试剂盒或专利(如专利申请号：200710028600.9.)缺乏对STR基因型分析的标准化，检测结果表述难以统一，并且检测通量相对较低，一般需要多组反应体系才能实现多条染色体的检测，不利于临床检测的常规开展和质量控制。
发明内容
本发明的目的是提供一种单管复合扩增检测人类18号、13号染色体和性染色体STR基因型的试剂盒，是一种采用五色荧光标记的快速高通量单管复合扩增QF-PCR试剂盒，用于检测18号、13号染色体和性染色体的数目，主要用于诊断18三体综合征、13三体综合征和性染色体非整倍体异常。
本发明试剂盒由独立包装的扩增试剂和扩增产物检测试剂组成，扩增试剂包括引物混合物、热启动C-Taq酶、扩增反应液、质控品，采用体外聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，扩增反应液包含PCR缓冲液、MgCl2和dNTP；扩增产物检测试剂包括分子量内标、等位基因分型标准品(Allelic Ladder)，在单通道或多通道毛细管电泳仪上检测扩增产物；引物混合物包括22对引物(SEQ ID NO.1-44)，质控品优选9947A女性DNA和9948男性DNA或已知基因型的其它DNA，用于控制实验室质量，同时检测22个基因座的扩增产物，分别是：Amelogenin、D18S535、D13S797、DXS1187、DXYS267、D13S305、TAF9b、DXS6803、D13S628、DXS981、XHPRT、D18S386、D13S634、D18S390、D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742、D18S391、X22、D18S499和SRY。
本发明试剂盒是根据复合检测的要求对22个基因座的扩增引物进行了设计，引物均对应于基因座的侧翼序列，分别用五种荧光染料标记每对引物中的一条引物的5’端。所述引物混合物中，Amelogenin、D18S535、D13S797、DXS1187、DXYS267和D13S305等6个基因座的引物采用FAM(蓝色)标记；TAF9b、DXS6803、D13S628、DXS981、XHPRT、D18S386和D13S634等7个基因座的引物采用HEX(绿色)标记；D18S390、D18S1002、D13S258、DXS6809和D13S742等5个基因座的引物采用TAMRA(黄色)标记；D18S391、X22、D18S499和SRY等4个基因座的引物采用ROX(红色)标记。
所述的22对引物的核苷酸序列和对应的22对基因座分别是：Amelogenin：SEQ ID NO.1～2；D18S535：SEQ ID NO.3～4；D13S797：SEQ ID NO.5～6；DXS1187：SEQ ID NO.7～8；DXYS267：SEQ ID NO.9～10；D13S305：SEQ ID NO.11～12；TAF9b：SEQ ID NO.13～14；DXS6803：SEQID NO.15～16；D13S628：SEQ ID NO.17～18；DXS981：SEQ ID NO.19～20；XHPRT：SEQ ID NO.21～22；D18S386：SEQ ID NO.23～24；D13S634：SEQ ID NO.25～26；D18S390：SEQ ID NO.27～28；D18S1002：SEQ ID NO.29～30；D13S258：SEQ ID NO.31～32；DXS6809：SEQ ID NO.33～34；D13S742：SEQ ID NO.35～36；D18S391：SEQ ID NO.37～38；X22：SEQ ID NO.39～40；D18S499：SEQ ID NO.41～42；SRY：SEQ ID NO.43～44。
引物信息具体如表1：
表1QF-PCR试剂盒22对引物信息表
等位基因分型标准品是Amelogenin、D18S535、D13S797、DXS1187、DXYS267、D13S305、TAF9b、DXS6803、D13S628、DXS981、XHPRT、D18S386、D13S634、D18S390、D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742、D18S391、X22、D18S499和SRY22个基因座的等位基因标准品。
本发明试剂盒能快速、高通量地检测人18号、13号常染色体和X、Y性染色体的数目异常，与发明人前期已申请公开的专利“检测人类21号染色体STR基因型的试剂盒”(201310020780.1)联合，可用于人类常见染色体异常的临床诊断，包括21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征，以及性染色体数目异常等。
本发明试剂盒主要针对中国人群18三体综合征、13三体综合征和性染色体非整倍体异常的临床诊断进行设计。与现有发明专利或同类型试剂盒相比，其优势在于：
1.单管复合扩增：采用了五色荧光标记技术，能在同一个PCR管中对22个基因座进行扩增、检测，做到操作便捷、快速、高通量、自动化；
2.较高的诊断效能比：所采用的22个STR基因座包含18号染色体的6个基因座、13号染色体的6个基因座和性染色体上的10个基因座，在中国汉族人群中均具有较高的多态性，能够达到准确诊断目标染色体数目的目的；
3.有助于诊断X染色体数目异常：所选用的X染色体STR基因座及TAF9b基因座联用，能够有效的判断X染色体数目异常，尤其能提高对X单体的诊断率；
4.结果标准化和质量控制：采用了包含14个片段长度(75-500bp)的分子量内标，用于检测等位基因的片段长度，保证结果的一致性和可比性；提供了等位基因分型标准品(Allelic Ladder)，可以做到STR等位基因的精确分型，使STR基因型检测结果标准化；采用了具有已知基因型的质控品9947A女性DNA和9948男性DNA，用于PCR扩增及产物检测过程的质量监测。这些措施保障了临床应用时的质量控制和监督。
5.成品试剂盒：本发明试剂盒包括独立包装的扩增试剂和扩增产物检测试剂，包含了引物混合物、分子量内标、等位基因分型标准品(Allelic Ladder)等成分，避免了试剂配置过程中产生的污染或误差，保证了结果的准确性和稳定性,有利于控制实验室质量。
为实现操作简便、检测稳定可靠、结果标准化，本发明在前期实验中不断优化，实现了以下技术目标：
1.同一反应管内扩增22个目标基因座。对于PCR扩增体系而言，扩增目标基因座越多，引物竞争导致的扩增平衡难度越大。本试剂盒通过反复优化引物序列、平衡不同基因座引物浓度、控制复合扩增参数等措施，实现了上述22个基因座在同一反应管内的均衡扩增，简便了操作，并得到可靠的等位基因相对定量分析结果。
2.QF-PCR检测结果标准化。检测标准化是临床普及应用的重要前提。目前市场的同类型产品和已有的专利缺乏对STR等位基因的精确分型，检测结果表述难以统一，不利于临床常规应用和实验室质量控制。本发明试剂盒所述等位基因分型标准品(Allelic Ladder)是由各STR基因座的等位基因片段经混合调平衡后制备而成，包含中国汉族人群在22个STR基因座中的常见等位基因(表2)，这些等位基因经扩增、克隆和DNA测序证实其序列组成，按照国际法医遗传学协会推荐的原则命名；使用时加入电泳混合液与待测样本一起电泳，经ABIGeneMapper IDv3.2软件分析，能够直观、精确地显示待测标本在22个STR基因座的基因型。
表2等位基因分型标准品包含的基因座常见等位基因和性别基因型
3.检测灵敏度高、特异性强。本发明试剂盒检测灵敏度高，在25μL扩增反应体系中，DNA模板量低至0.12ng的条件下也可检出全部22个基因座；检测特异性强，加入一定浓度的DNA量(在试剂盒规定范围内)进行复合扩增，不产生22个基因座以外的扩增产物。
4.适用标本类型多。本发明试剂盒适用于血液或血痕、羊水、绒毛、毛发、精液或精斑、唾液斑、肌肉等多种组织来源的DNA样品的检测分析。
附图说明
图1a是等位基因分型标准品在Amelogenin、D18S535、D13S797、DXS1187、DXYS267、D13S305基因座的基因型。
图1b是等位基因分型标准品在TAF9b、DXS6803、D13S628、DXS981、XHPRT、D18S386、D13S634基因座的基因型。
图1c是等位基因分型标准品在D18S390、D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742基因座的基因型。
图1d是等位基因分型标准品在D18S391、X22、D18S499、SRY基因座的基因型。
图2是分子量内标电泳图谱。分子量内标采用荧光染料SIZ标记，包括75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500等14个片段长度，用于检测等位基因的片段长度，保证结果的一致性和可比性。
图3a是质控品9947A在Amelogenin、D18S535、D13S797、DXS1187、DXYS267、D13S305基因座的基因型图谱。
图3b是质控品9947A在TAF9b、DXS6803、D13S628、DXS981、XHPRT、D18S386、D13S634基因座的基因型图谱。
图3c是质控品9947A在D18S390、D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742基因座的基因型图谱。
图3d是质控品9947A在D18S391、X22、D18S499、SRY基因座的基因型图谱。
图3e是质控品9948在Amelogenin、D18S535、D13S797、DXS1187、DXYS267、D13S305基因座的基因型图谱。
图3f是质控品9948在TAF9b、DXS6803、D13S628、DXS981、XHPRT、D18S386、D13S634基因座的基因型图谱。
图3g是质控品9948在D18S390、D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742基因座的基因型图谱。
图3h是质控品9948在D18S391、X22、D18S499、SRY基因座的基因型。
图4是13三体综合征胎儿羊水标本在D13S258、D13S742基因座的特征性STR等位基因型。
图5是Klinefelter综合征(47XXY)血液标本在Amelogenin、DXS1187、DXYS267基因座的特征性STR等位基因型。
图6是超雄综合征(47XYY)胎儿羊水标本在Amelogenin、DXYS267基因座的特征性STR等位基因型。
图7是X三体综合征(47XXX)胎儿羊水标本在Amelogenin、DXS1187、DXS6809基因座的特征性STR等位基因型。
图8a是三倍体(69XXY)胚胎绒毛标本在Amelogenin、TAF9b基因座的特征性STR等位基因型。
图8b是三倍体(69XXY)胚胎绒毛标本在X22、D18S499、D13742基因座的特征性STR等位基因型。
图9是三倍体(69XXX)胚胎绒毛标本在Amelogenin、D18S535、DXS1187、DXYS267、D13S305基因座的特征性STR等位基因型。
图10a是父亲DNA样本在D18S390、D18S535、D18S386基因座的分型结果。
图10b是母亲DNA样本在D18S390、D18S535、D18S386基因座的分型结果。
图10c是羊水DNA样本在D18S390、D18S535、D18S386基因座的分型结果。
图11a是父亲DNA样本在TAF9b、DXS6803、DXS961、XHPTR基因座的分型结果。
图11b是母亲DNA样本在TAF9b、DXS6803、DXS961、XHPTR基因座的分型结果。
图11c是胚胎绒毛样本在TAF9b、DXS6803、DXS961、XHPTR基因座的分型结果。
图11d是胚胎绒毛样本在Amelogenin、SRY基因座的分型结果。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1：22个基因座的确定
本发明提供的试剂盒共选取以下22个基因座，依据是：
STR具有人群的特异性，因此，选择本人群中多态性好、杂合度高的STR基因座，更易获得有诊断价值的基因型、达到准确诊断染色体数目的目的。本发明所选基因座均为中国汉族人群中多态性较高的基因座。在前期研究中，通过对文献报道和对中国汉族175例无血缘关系个体的基因型检测分析，优选出多态性好、具有较高临床诊断价值的22个STR基因座。具体见表3。
表3175例中国汉族人群无关个体在19个STR基因座的多态信息量(PIC)分析
| 基因座 | PIC | 基因座 | PIC | 基因座 | PIC |
| D18S535 | 0.79 | DXS981 | 0.81 | DXS6809 | 0.77 |
| D13S797 | 0.51 | XHPRT | 0.66 | D13S742 | 0.87 |
| DXS1187 | 0.75 | D18S386 | 0.90 | D18S391 | 0.86 |
| DXYS267 | 0.60 | D13S634 | 0.85 | X22 | 0.75 |
| D13S305 | 0.79 | D18S390 | 0.63 | D18S499 | 0.72 |
| DXS6803 | 0.52 | D18S1002 | 0.77 | ||
| D13S628 | 0.86 | D13S258 | 0.85 |
基于STR多态性和基因组正常变异的复杂性，STR检测用于特定染色体的数目诊断时需要联用多个STR基因座，所用目标染色体上的STR基因座的数目越多，多态性越好，诊断价值就越大。因此，本发明试剂盒选择检测均匀分布在18号、13号和性染色体(以下简称目标染色体)上具有高度遗传多态性的22个STR基因座，分别为Amelogenin、D18S535、D13S797、DXS1187、DXYS267、D13S305、TAF9b、DXS6803、D13S628、DXS981、XHPRT、D18S386、D13S634、D18S390、D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742、D18S391、X22、D18S499和SRY。其特征在于，在每条目标染色体上至少选择了6个及以上的STR基因座(18号染色体的6个STR基因座，13号染色体的6个STR基因座和性染色体上的10个STR基因座)，确保了有足够STR基因座用于染色体数目的分析，能够可靠地诊断目标染色体数目的异常；所选择的22个STR基因座均为4-5核苷酸重复，多态性好，杂合度高，能够在同一反应管中扩增和检测。
X染色体数目异常非常常见，也是检测中的难点。为能够明确检测X染色体数目，本发明试剂盒中特别选用了TAF9b基因座。该基因座同时存在于3号染色体与X染色体上，在正常女性中(含两条3号染色体与两条X染色体)，其等位基因定量比应为1:1，在正常男性中(含两条3号染色体与一条X染色体)，其等位基因定量比应为2:1，因此可以利用该基因座来指示X染色体的相对数量。以Turner综合征(45X)为例，采用Amelogenin、DXS1187等性别基因座仅表现为单个等位基因，诊断价值不充分；采用TAF9b基因座，能够非常直观清晰呈现出基因量近似2:1的双等位基因，从而明确诊断。
实施例2：试剂盒组成及诊断标准的确定
(1)试剂盒组成(200人份)见表4。
表4
(2)主要仪器设备
PCR扩增仪、ABI3130型遗传分析仪、高速离心机、生物安全柜或洁净工作台、微量移液器、紫外分光光度计、恒温水浴箱、冰箱等。
(3)DNA提取
标本为0.2ml新鲜EDTA抗凝全血或10ml羊水，用Chelex-100法(Chelex试剂为Bia-rad产品)提取DNA,用紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度，加入纯水将提取的样本DNA稀释至浓度约0.1ng/μL-0.5ng/μL。
(4)PCR反应体系(25μL)见表5。
表5
(5)PCR循环参数
95℃2分钟→(94℃30秒,60℃60秒，72℃60秒；30个循环)→72℃20分钟→4℃维持。
(6)扩增产物电泳
扩增产物3000rpm离心5分钟，取1μL产物或Allelic Ladder与0.5μL SIZ-500分子量内标和12μL去离子甲酰胺混合，95℃变性3分钟，冰浴3分钟。瞬时离心混合物，在ABI3130型遗传分析上按默认电泳条件进行检测，应用GeneMapper ID v3.2软件进行基因分型。
(7)结果判断与诊断标准
原理：STR遵循孟德尔遗传规律，每个STR基因座与所在染色体具有连锁关系，能够代表相应染色体的数量。具体来说，正常染色体有两条，在特定STR基因座上可表现为1个等位基因(来源于父母的两个等位基因一致，也称纯合子，电泳图谱上表现为单峰)或基因量相等的2个等位基因(来源于父母的两个等位基因不同，也称杂合子，电泳图谱上表现为等位基因量比例为1:1的双峰)。而染色体非整倍体异常，以18三体综合征为例而言，多余的1条18号染色体来自于母亲或父亲，由于STR的多态性有限，实际检测时在18号染色体STR基因座可能出现三种基因型情况：第一种为1个等位基因(单峰)，即3条染色体的STR等位基因相同；第二种为2个等位基因(非正常比例双峰)，即3条染色体中有两条的等位基因一致，但两个等位基因的基因量有差别，约为1:2或2:1的比例；第三种为3个等位基因(三等峰)，即3条染色体的等位基因各不相同，其基因量比例近似为1:1:1。后两种基因型能够提示染色体数量为3条，都具有诊断价值。
三体诊断标准：在所检测的同种染色体基因座中，若出现2个及2个以上有三体特征的峰型，即可诊断该种染色体三体。
非三体诊断标准：指所检测基因座中，呈单峰和正常比例的双峰，或出现有三体特征的峰型少于2个。
X单体诊断标准：TAF9b基因座呈基因量为2:1的双峰，SRY基因座未出现Y染色体峰，并且其余性别基因座均显示为单峰。
注释：
(1)三体特征的峰型：包括三峰和双峰两种情况。前者是指在某个基因座上有接近1：1：1比例的3个单峰，后者是指在某个基因座上出现双峰时，较短的片段峰面积除以较长的片段峰面积，其比例≤0.6或≥1.8。
(2)正常比例的双峰：是指在某个基因座上出现双峰时，较短的片段峰面积除以较长的片段峰面积，其比例在0.8～1.4之间。
实施例3：用本试剂盒快速产前诊断目标染色体异常综合征
采用临床常规染色体核型分析剩余的羊水、绒毛、血液样本600份，其中羊水取样0.5-1ml，绒毛取样少量(0.1-0.5g)，血液样本取样0.2ml，按实施例1最终确定的试剂盒优选组成和检测方法进行盲法检测分析。本试剂盒在600份样本中共检测出3例18三体、3例13三体、5例45X、1例47XXY、4例47XYY、1例47XXX、3例69XXY和1例69XXX(均为完全型，无嵌合体和易位型)，与金标准染色体核型结果相比，本方法的检测准确性达100％，无漏检，无扩增失败；每份样本可在24小时内获得检测结果，从单个样本检测时间来看，采用荧光检测试剂盒费时只有传统染色体核型分析方法的1/10。由于采用的分子诊断平台具有高通量特性，对大批量样本检测效率会更高。
1例13三体综合征胎儿羊水标本在D13S258、D13S742基因座的特征性STR等位基因型分析，扩增结果如图4。D13S258的基因型呈现为基因量比例近似为1:2双等位基因峰；D13S742的基因型呈现为基因量比例近似为1:1:1的三个等位基因峰，上述两种基因型都具有13三体诊断价值。
1例Klinefelter综合征(47XXY)血液标本在Amelogenin、DXS1187、DXYS267基因座的特征性STR等位基因型分析，扩增结果如图5所示。Amelogenin、DXS1187的基因型呈现为基因量比例近似为2:1双等位基因峰；DXYS267的基因型呈现为基因量比例近似为1:1:1的三个等位基因峰。上述两种基因型都具有47XXY诊断价值。
1例超雄综合征(47XYY)胎儿羊水标本在Amelogenin、DXYS267基因座的特征性STR等位基因型分析，扩增结果如图6所示。Amelogenin、DXYS267的基因型呈现为基因量比例近似为1:2双等位基因峰，上述两种基因型都具有47XYY诊断价值。
1例X三体综合征(47XXX)胎儿羊水标本在Amelogenin、DXS1187、DXS6809基因座的特征性STR等位基因型分析,扩增结果如图7所示。Amelogenin的基因型呈现为单等位基因峰；DXS1187的基因型呈现为基因量比例近似为2:1双等位基因峰；DXS6809的基因型呈现为基因量比例近似为1:1:1的三个等位基因峰。上述三种基因型都具有47XXX诊断价值。
1例69XXY三倍体综合征胚胎绒毛标本在Amelogenin、TAF9b、X22、D18S499、D13S742基因座的特征性STR等位基因型分析,扩增结果如图8a、图8b所示。Amelogenin、TAF9b、D18S499的基因型呈现为基因量比例近似为2:1双等位基因峰；X22、D13S742的基因型呈现为基因量比例近似为1:1:1的三个等位基因峰。上述两种基因型提示18、13号染色体和性染色体都出现三倍型，具有69XXY诊断价值。
1例69XXX三倍体综合征胚胎绒毛标本在Amelogenin、D18S535、DXS1187、DXYS267、D13S305基因座的特征性STR等位基因型分析,扩增结果如图9所示。Amelogenin的基因型呈现为单等位基因峰；TAF9b的基因型呈现为基因量近似相等的双等位基因峰；D18S535、DXYS267的基因型呈现为基因量比例近似为1:2或2:1的双等位基因峰；DXS1187、D13S305的基因型呈现为基因量比例近似为1:1:1的三个等位基因峰。上述基因型具有69XXX诊断价值。
实施例4：判断三体综合征胚胎额外染色体的来源
采集实施例2中确诊为18三体胎儿的父源和母源的外周血样本(2ml EDTA抗凝血)，以及本实验室存留的确诊18三体的羊水样本及其父源和母源外周血样本，应用本发明试剂盒中按实施案例1进行检测、分析。结果显示，本试剂盒通过检测可清晰判断多余染色体的亲缘来源，有助于下次妊娠指导。图10是18三体综合征胎儿羊水标本在D18S390、D18S535、D18S386基因座的特征性STR等位基因型及多余染色体的来源分析，其中图10a是父亲DNA样本的分型结果；图10b是母亲DNA样本的分型结果；图10c是羊水DNA样本的分型结果，羊水DNA样本在D18S390的基因型呈现为基因量比例近似为2:1双等位基因峰；D18S535、D18S386的基因型呈现为基因量比例近似为1:1:1的三个等位基因峰。上述两种基因型都具有18三体诊断价值。由于胚胎的等位基因分别来自于父母亲，基因型比对显示标本在D18S390、D18S535、D18S386基因座上的多余等位基因来自于母亲，即提示该多余染色体来自于母亲。
实施例5：用本试剂盒快速产前诊断Turner综合征并判断缺失染色体的来源
采集实施例2中确认为Turner综合征(45X)的父源和母源的外周血样本(2ml EDTA抗凝血)，以及本实验室存留的确诊Turner综合征的羊水样本，应用本发明试剂盒中按实施案例1进行检测、分析。结果显示，本试剂盒通过检测可明确诊断并清晰判断X染色体缺失并能分析来源，有助于下次妊娠指导。图11是Turner综合征(45X)胚胎绒毛标本在TAF9b、DXS6803、DXS961、XHPTR基因座的基因型及缺失染色体的来源分析，其中图11a是父亲DNA样本的分型结果；图11b母亲DNA样本的分型结果；图11c、图11d是羊水DNA样本的分型结果，羊水DNA样本在Amelogenin基因座呈现为单等位基因峰，在SRY基因座未出现等位基因峰，而在TAF9b基因座的基因型呈现为基因量比例近似为2:1双等位基因峰；在DXS6803、DXS961、XHPRT等性别基因座呈现为单等位基因峰。上述基因型提示缺失一条X染色体，具有45X综合征诊断价值。由于胚胎的等位基因分别来自于父母亲，基因型比对显示缺失等位基因来源于父亲，即提示胚胎丢失了来源于父亲的性别染色体。
<110> 浙江大学医学院附属妇产科医院,无锡中德美联生物技术有限公司,杭州博圣生物技术有限公司
<120> 检测人18、13号和性染色体STR基因型的试剂盒
<160> 44
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 1
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<213>人工序列
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GCAGTAGCTTTCAGCTTAAACTTT 24
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ATTCTTTCTCTCACCCCTGTCTATG 25
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GAGTCAGGAGAATCACTTGGAAC 23
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CCATGAAGTAGCTAAGCAGGTAGAA 25
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GTAATTTCCATTGCCCTATCTTTAAGTT 28
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ATTTGAATGTTGCCACACTACTGG 24
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<213>人工序列
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TCACCTGGATGACTGTACTTCCCT 24
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<212> DNA
<213>人工序列
<220>
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GAACAGATTGTAGAAGAACAAGGATG 26
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<212> DNA
<213>人工序列
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<400> 29
AACAGCAAACTTTACAGGGAAAAA 24
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TGTGTTTATTTGTTTGACTCAATGGAT 27
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<212> DNA
<213>人工序列
<220>
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TACCAGGAGGAGAGGGACTACC 22
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<212> DNA
<213>人工序列
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GGGATGAGAGAGGAAGACAGAG 22
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<212> DNA
<213>人工序列
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CTTGGCCTCACTTAATGGATGA 22
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<211>22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
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<400> 34
AAGGAGGACCATGTTTCACTGG 22
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<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 35
TGGGCTAGGAATGGAAATAGGT 22
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<213>人工序列
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GTGCTGGCAGTTCTGAAGGAT 21
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AGGCAATGTGACTTGAGGAAGAGAG 25
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<212> DNA
<213>人工序列
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GAACCCAGTTAGACTTCACTATTCCCA 27
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<212> DNA
<213>人工序列
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<400> 39
CCCATTGTTGCTACTTGAGACTTGG 25
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<212> DNA
<213>人工序列
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ATGAGAGTTGGAAAGAAAAGGAAAGC 26
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<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 41
ACTGACAGATTACCCAGAAATGAG 24
<210>42
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 42
GCATCTGAGCCCAGTTTGAGC 21
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<211>22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 43
CTGCTATGTTAAGCGTATTCAA 22
<210>44
<211>19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 44
GATCTGCGGGAAGCAAACT 19
Claims (3)
1.一种检测人18、13号和性染色体STR基因型的试剂盒，由扩增试剂和扩增产物检测试剂组成，所述的扩增试剂包括引物混合物、热启动C-Taq酶、扩增反应液、质控品，所述扩增反应液包含PCR缓冲液、MgCl2和dNTP；所述的扩增产物检测试剂包括分子量内标、等位基因分型标准品；其特征在于，所述的引物混合物包括22对引物SEQ ID NO.1-44，质控品优选9947A女性DNA和9948男性DNA或已知基因型的其它DNA，同时扩展的22个基因座是：Amelogenin、D18S535、D13S797、DXS1187、DXYS267、D13S305、TAF9b、DXS6803、D13S628、DXS981、XHPRT、D18S386、D13S634、D18S390、D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742、D18S391、X22、D18S499和SRY。
2.根据权利要求1所述的一种检测人18、13号和性染色体STR基因型的试剂盒，其特征在于，所述的用于扩增22个基因座的22对引物混合物核苷酸序列分别是：Amelogenin：SEQ ID NO.1～2；D18S535：SEQ ID NO.3～4；D13S797：SEQ ID NO.5～6；DXS1187：SEQ ID NO.7～8；DXYS267：SEQ ID NO.9～10；D13S305：SEQ ID NO.11～12；TAF9b：SEQ ID NO.13～14；DXS6803：SEQ ID NO.15～16；D13S628：SEQ ID NO.17～18；DXS981：SEQ ID NO.19～20；XHPRT：SEQ ID NO.21～22；D18S386：SEQ ID NO.23～24；D13S634：SEQ ID NO.25～26；D18S390：SEQ ID NO.27～28；D18S1002：SEQ ID NO.29～30；D13S258：SEQ ID NO.31～32；DXS6809：SEQ ID NO.33～34；D13S742：SEQ ID NO.35～36；D18S391：SEQ ID NO.37～38；X22：SEQ ID NO.39～40；D18S499：SEQ ID NO.41～42；SRY：SEQ ID NO.43～44。
3.根据权利要求1所述的一种检测人类18、13号和性染色体STR基因型的试剂盒，其特征在于，所述的等位基因分型标准品是Amelogenin、D18S535、D13S797、DXS1187、DXYS267、D13S305、TAF9b、DXS6803、D13S628、DXS981、XHPRT、D18S386、D13S634、D18S390、D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742、D18S391、X22、D18S499和SRY 22个基因座的等位基因标准品。
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