CN103923875A - 一种兔体外单层肝细胞系模型建立及传代为连续性肝细胞株的培养及储存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兔体外单层肝细胞系模型建立方法，以及将其传代为连续性肝细胞株的培养及储存方法，属于肝细胞体外培养技术领域；本发明旨在寻求一种可以替换代价昂贵的应用动物实验繁殖兔肝球虫病原收集的方法，通过兔体外单层肝细胞系模型建立及传代为连续性肝细胞株的培养及储存方法体外建立，能够稳定的实现兔体外肝细胞快速、便捷、经济的传代，以便能够在后续实验中实现体外繁殖球虫病原的目的；本发明通过摸索和研究兔年龄、击杀方式、消化酶的选择、培养方式的选择、消化时间、细胞浓度、血清的选择、培养瓶的选择、湿度的控制及贴壁试剂的筛选等，成功的解决了兔单层肝细胞模型培养的建立并可顺利的传代，并摸索了细胞的冻存及保存的方式。

Description

一种兔体外单层肝细胞系模型建立及传代为连续性肝细胞株的培养及储存方法

技术领域

本发明涉及兔体外单层肝细胞系模型建立方法，以及将其传代为连续性肝细胞株的培养及储存方法，属于肝细胞体外培养技术领域。

背景技术

兔球虫是家兔最常见的一种寄生虫，对养兔业危害极大，幼兔感染率高达90％以上，死亡率高达40-70％，除兔斯氏艾美尔/肝球虫斯氏艾美尔球虫独立寄生于兔肝胆管上皮细胞外，其余13种都寄生于肠。各类球虫免疫没有交叉保护性，肠球虫可以通过粪便收集提纯而获得虫株，然后进行疫苗的研制，但肝球虫的虫株病料不易收集，只能在兔子屠宰后从内脏中收集，这样使得肝球虫虫株提纯收集及繁殖受到极大地限制，从而影响疾病的诊断及治疗。目前，国内外对斯氏艾美尔球虫即兔肝球虫的研究不多，对它造成的危害性也没有引起足够的重视，实用性的研究成果基本上处于零的状态。

如果能够建立兔体外单层肝细胞系模型，并得到肝细胞株的连续传代培养及储存方法，就可以模拟兔斯氏艾美尔/肝球虫体内生长循环模式，进而达到体外获得极难取得的病源——具有无限繁殖能力的球虫虫株的目的。目前通过杀兔取肝得到球虫虫株，获得的球虫虫株数量有限且试验成本很高，遏制了兔肝球虫疫苗的研究。因此体外培养兔肝细胞并获得球虫虫株，不仅可以减少对兔子的杀戮，带来动物福利；还可以降低成本，减少购买兔子的费用，最重要的是为解决兔肝球虫疫苗虫株的大量生产奠定了基础，为广大兔养殖户带来更高的经济效益。

但是兔肝原代细胞的培养难度很大，特别是单层细胞的培养。在产品方面，2013年才从网上查到有一家公司在出售兔肝细胞，但经咨询后为悬浮细胞，没有贴壁细胞，且据说仅能传代10代左右。在理论方面，虽然有论文发表，但依据其提供的方法并不能培养成功，同时细胞培养所需的环境及技术要求较高，原代细胞培养成功后，大部分的报道不能超过3代进行传代。国内文献参考了《乳兔和成年兔肝细胞体外分离及培养的比较研究》，国外文献参考了《Identification of Carbohydrates on Eimeria stiedai Sporozoites and Their Role in Invasion of Cultured Cells in vitro. Department of Veterinary Physiology》（Research Center for Molecular Protozoology, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, Obihiro 080, Japan）。 但按其参考文献的流程程序，均未能培养出单层肝细胞，尤其是在应用胰酶、胶原酶消化的浓度和时间方面的数据，与发明人的试验数据具有较大出入。同时文献中提到的乳兔肝细胞仅仅能传代4代、成年兔为2代，不可能培养出连续性的肝细胞株。

发明内容

本发明旨在寻求一种可以替换代价昂贵的应用动物实验繁殖兔肝球虫（斯氏艾美尔球虫）病原收集的方法，通过兔体外单层肝细胞系模型建立及传代为连续性肝细胞株的培养及储存方法体外建立，能够稳定的实现兔体外肝细胞的快速、便捷、经济的传代，以便能够在后续实验中实现体外繁殖球虫病原的目的。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种兔体外单层肝细胞系模型建立方法，包括如下步骤：

a、兔子肝脏的获取：将兔子击昏脑部致死后，置于消毒液中0.5-2分钟后取出，沥净消毒液后，无菌取出兔子的肝脏放入培养皿中；一般兔子的击杀方式为颈静脉放血致死和颈动脉放血致死，这两种方式在实验过程中均不能得到贴壁肝细胞，经过研究人员的缜密探讨和大胆尝试，最终确定了击打兔子后脑的不放血击杀方式，且击杀兔子后应尽快获取肝细胞；

b、兔子肝脏的预处理：将兔子肝脏在培养皿中用平衡盐溶液洗净血液后，更换新的平衡盐溶液，将兔子肝脏边剪碎边用平衡盐溶液清洗，将兔子肝脏剪成约1mm³的碎块；剪碎过程中应当将血管、胆管等肥肝组织剔除；

c、消化得到分散兔子肝细胞：将剪碎的兔子肝细胞放入珠瓶中，震荡打散，然后加入消化液，将珠瓶放入37℃的恒温水浴箱中消化8~15分钟；所述消化液为0.025%胰酶；此处所述珠瓶为盛有玻璃微珠的三角瓶，玻璃微珠占三角瓶体积的1/4左右；吹打分散的方法不能够很好的适用于本发明，采用珠瓶，利用震荡时玻璃微珠之间及其与瓶壁纸件的摩擦和碰撞，能够很好的对剪碎的肝组织进行分散；

d、收集细胞悬液：取出珠瓶，加入DMEM液充分震荡至溶液浑浊，经4-6层纱布过滤到小烧杯内，重复收集步骤4-5次，得到含有消化好的兔子肝细胞的悬液；

e、离心：将所述悬液分装入10mL的离心管中，800-1000r/min离心5-7分钟；

f、培养：弃去上清液，将离心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入细胞培养瓶中，然后加入180-210μL双抗、1mL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度线，将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养3-6天，得到兔体外单层肝细胞系模型。所述恒温培养箱为隔水式。

上述步骤中b-d、f均需在超净工作台上进行。

本发明所用的兔子购自山西医科大学实验动物中心，要求体重500g左右的灰色家兔幼兔，体重可在±30g范围内浮动。

本发明采用的细胞培养瓶，瓶盖有透气孔，或者瓶盖旋紧后拧松1圈。

上述方法中所述的0.025%胰酶可以用1%的I型胶原酶替换；所述消毒液为新洁尔灭消毒液。

将得到的兔体外肝细胞单层模型传代为连续性肝细胞株的培养方法，包括如下步骤：

第一步，收集细胞

将细胞培养瓶中的原有细胞生长液倾出，加入0.02%的Versene溶液2mL，摇晃3-6次倒掉，重复该操作一次，然后加入Versene胰蛋白酶溶液，放置至细胞培养瓶的边缘有小点状的透明出现，立刻倒掉细胞培养瓶中的液体，以手拍击细胞培养瓶，细胞呈流沙样脱落；若细胞未呈流沙样脱落，则利用倾倒后细胞培养瓶中剩余的液体继续放置一段时间，直至出现流沙样情况；然后加入DMEM液2mL，吹打细胞直至瓶壁透亮，得到细胞悬液；

第二步，细胞的传代培养

将细胞悬液分成两份接种到2个细胞培养瓶中，然后加入200μL双抗、1mL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度线，将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂恒温培养箱。

根据细胞的生长情况，也可以按1：2-4将细胞悬液分装到培养瓶中。

得到的连续性肝细胞株的储存方法，包括如下步骤：

用Versene胰蛋白酶溶液常规消化培养得到的细胞单层，然后以500×g离心10min收集细胞；按照25mL细胞培养瓶中培养7-9天的细胞消化离心后收集到的细胞添加1mL细胞冷冻保存液于1只安瓶；

将安瓶集中放在盒中，分三步缓慢降温：（1）4℃放置2h，（2）-20℃放置1h，（3）置于-70℃超低温冰箱或液氮中保存。

所述安瓶降温步骤的第（2）步，-20℃放置的时间严禁超过1h。

冷冻后的兔传代肝细胞株的复苏方法，包括如下步骤：

（1）迅速解冻，取出安瓶后拿止血钳夹好，立即投入37℃水浴中，至全部溶解；不可让水没过管盖；

（2）用70%酒精浸泡消毒后打开安瓶，将细胞悬液转入离心管中，补加细胞生长液，以500×g离心10min后，倒掉液体；

（3）加细胞生长液使细胞浓度为0.2%；按1只安瓶复苏1瓶25mL的细胞；

（4）观察细胞贴壁后，轻轻倒出旧细胞生长液，换新的细胞生长液继续培养。

与现有技术相比本发明具有以下有益效果。

1、兔肝细胞是兔斯氏艾美尔/肝球虫高选择性的生长部位，本发明建立了兔体外单层肝细胞系模型及传代为连续性肝细胞株的培养及储存方法，从而使得模拟兔斯氏艾美尔/肝球虫体内生长循环模式，达到球虫虫株无限制的繁殖，体外获得极难取得的病源能够实现，解决了兔肝球虫疫苗虫株难以大量生产的遏制瓶颈。

2、本发明不仅可以成功的培养出兔体外单层肝细胞模型，同时又将其连续不断的培养繁殖下去，成功的建立了肝细胞株；同时将方法进行简化，使细胞培养由原来繁琐的步骤改变为快速、便捷的培养方式。从而建立起兔体外单层肝原代细胞体外培养方式，同时又保持了兔肝细胞良好的结构和功能，为后续的科研奠定了良好的基础。

3、本发明得到的兔肝原代细胞为贴壁细胞。通过研究得出的连续性兔肝贴壁细胞株能够很好的保持兔肝细胞的生理生化性状，在筛选细胞时，形成特有的细胞株，并且有别于现有的兔肝悬浮细胞，可以供研究和观察兔肝球虫的生命周期及繁殖。

4、本发明建立的兔体外单层肝细胞系模型，能够顺利的传代至11代，且得到的11代细胞仍具有良好的活性，能够继续传代。同时并摸索了传代细胞的冻存和保存方式，从而形成连续性兔肝细胞株，为兔肝球虫疫苗的研究奠定了良好的基础。

5、本发明通过体外培养兔肝原代细胞株，替代了实验兔的选用，极大地节约了研发成本。

附图说明

图1为采用0.025胰酶消化10min的兔肝。

图2为胰酶消化的兔肝细胞生长5天的贴壁情况。

图3为培养23天的单核和双核的兔肝细胞。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种兔体外单层肝细胞系模型建立方法，包括如下步骤：

a、兔子肝脏的获取：将兔子击昏脑部致死后，置于新洁尔灭消毒液中2分钟后取出，沥净消毒液后，无菌取出兔子的肝脏放入培养皿中；

b、兔子肝脏的预处理：将兔子肝脏在培养皿中用平衡盐溶液洗净血液后，更换新的平衡盐溶液，将兔子肝脏边剪碎边用平衡盐溶液清洗，将兔子肝脏剪成约1mm³的碎块；

c、消化得到分散兔子肝细胞：将剪碎的兔子肝细胞放入珠瓶中，震荡打散，然后加入消化液，将珠瓶放入37℃的恒温水浴箱中消化8分钟；所述消化液为0.025%胰酶；

d、收集细胞悬液：取出珠瓶，加入DMEM液充分震荡至溶液浑浊，经4层纱布过滤到小烧杯内，重复收集步骤4次，得到含有消化好的兔子肝细胞的悬液；

e、离心：将所述悬液分装入10mL的离心管中，800r/min离心6分钟；

f、培养：弃去上清液，将离心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入细胞培养瓶中，然后加入180μL双抗、1mL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度线，将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养3天，得到兔体外单层肝细胞系模型；

所述步骤b-d、e均在超净工作台上进行。

实施例2

一种兔体外单层肝细胞系模型建立方法，包括如下步骤：

a、兔子肝脏的获取：将兔子击昏脑部致死后，置于新洁尔灭消毒液中0.5分钟后取出，沥净消毒液后，无菌取出兔子的肝脏放入培养皿中；

b、兔子肝脏的预处理：将兔子肝脏在培养皿中用平衡盐溶液洗净血液后，更换新的平衡盐溶液，将兔子肝脏边剪碎边用平衡盐溶液清洗，将兔子肝脏剪成约1mm³的碎块；

c、消化得到分散兔子肝细胞：将剪碎的兔子肝细胞放入珠瓶中，震荡打散，然后加入消化液，将珠瓶放入37℃的恒温水浴箱中消化10分钟；所述消化液为0.025%胰酶；

d、收集细胞悬液：取出珠瓶，加入DMEM液充分震荡至溶液浑浊，经5层纱布过滤到小烧杯内，重复收集步骤4次，得到含有消化好的兔子肝细胞的悬液；

e、离心：将所述悬液分装入10mL的离心管中，900r/min离心6分钟；

f、培养：弃去上清液，将离心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入细胞培养瓶中，然后加入190μL双抗、1mL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度线，将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养5天，得到兔体外单层肝细胞系模型；

所述步骤b-d、e均在超净工作台上进行。

实施例3

一种兔体外单层肝细胞系模型建立方法，包括如下步骤：

a、兔子肝脏的获取：将兔子击昏脑部致死后，置于新洁尔灭消毒液中1分钟后取出，沥净消毒液后，无菌取出兔子的肝脏放入培养皿中；

b、兔子肝脏的预处理：将兔子肝脏在培养皿中用平衡盐溶液洗净血液后，更换新的平衡盐溶液，将兔子肝脏边剪碎边用平衡盐溶液清洗，将兔子肝脏剪成约1mm³的碎块；

c、消化得到分散兔子肝细胞：将剪碎的兔子肝细胞放入珠瓶中，震荡打散，然后加入消化液，将珠瓶放入37℃的恒温水浴箱中消化12分钟；所述消化液为0.025%胰酶；

d、收集细胞悬液：取出珠瓶，加入DMEM液充分震荡至溶液浑浊，经4层纱布过滤到小烧杯内，重复收集步骤5次，得到含有消化好的兔子肝细胞的悬液；

e、离心：将所述悬液分装入10mL的离心管中，800r/min离心7分钟；

f、培养：弃去上清液，将离心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入细胞培养瓶中，然后加入200μL双抗、1mL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度线，将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养4天，得到兔体外单层肝细胞系模型；

所述步骤b-d、e均在超净工作台上进行。

实施例4

一种兔体外单层肝细胞系模型建立方法，包括如下步骤：

a、兔子肝脏的获取：将兔子击昏脑部致死后，置于新洁尔灭消毒液中1.5分钟后取出，沥净消毒液后，无菌取出兔子的肝脏放入培养皿中；

b、兔子肝脏的预处理：将兔子肝脏在培养皿中用平衡盐溶液洗净血液后，更换新的平衡盐溶液，将兔子肝脏边剪碎边用平衡盐溶液清洗，将兔子肝脏剪成约1mm³的碎块；

c、消化得到分散兔子肝细胞：将剪碎的兔子肝细胞放入珠瓶中，震荡打散，然后加入消化液，将珠瓶放入37℃的恒温水浴箱中消化15分钟；所述消化液为0.025%胰酶；

d、收集细胞悬液：取出珠瓶，加入DMEM液充分震荡至溶液浑浊，经6层纱布过滤到小烧杯内，重复收集步骤5次，得到含有消化好的兔子肝细胞的悬液；

e、离心：将所述悬液分装入10mL的离心管中，1000r/min离心5分钟；

f、培养：弃去上清液，将离心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入细胞培养瓶中，然后加入210μL双抗、1mL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度线，将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养6天，得到兔体外单层肝细胞系模型；

所述步骤b-d、e均在超净工作台上进行。

实施例5

以实施例3得到的原代兔体外单层肝细胞系模型为例，一种兔体外单层肝细胞系模型传代为连续性肝细胞株的培养方法，包括如下步骤：

第一步，收集细胞

将细胞培养瓶中的原有细胞生长液倾出，加入0.02%的Versene溶液2mL，摇晃3-6次倒掉，重复该操作一次，然后加入Versene胰蛋白酶溶液，放置至细胞培养瓶的边缘有小点状的透明出现，立刻倒掉细胞培养瓶中的液体，以手拍击细胞培养瓶，细胞呈流沙样脱落，然后加入细胞生长液2mL，吹打细胞直至瓶壁透亮；上述步骤以手拍击细胞培养瓶时，若细胞未呈流沙样脱落，则利用倾倒后细胞培养瓶中剩余的液体继续放置一段时间，直至出现流沙样情况；

第二步，细胞的传代培养

将吹打分散后的细胞分成两份，每份装入一个细胞培养瓶中，然后加入200μL双抗、1mL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度线，将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂恒温培养箱。

一、所用Versene溶液（0.02%）采用如下原料配制：

NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH₂PO₄ 0.2g、Na₂HPO₄ 1.15g（或Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g）、乙二胺四醋酸二钠（EDTA）0.2g、双蒸水1000mL。

配好后于121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。

二、所用Versene胰蛋白酶溶液采用如下原料配制：

无钙、镁PBS胰蛋白酶溶液（0.25%）0.2mL、上述Versene溶液（0.02%）2mL。

三、无钙、镁磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：

NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄ 1.15g、KH₂PO₄ 0.2g、双蒸水1000mL；

依次称取各试剂并依次溶解在双蒸水中，将得到的溶液于121℃下15min高压灭菌，冷却后装入灭菌瓶，取样检验无菌后置于普通冰箱贮存。

四、无钙、镁PBS胰蛋白酶溶液（0.25%）的配制：

原料：上述无钙、镁PBS 1000mL、胰蛋白酶（1：250）2.5g；

将胰蛋白酶加入上述无钙、镁PBS中搅拌至溶解，用赛氏滤器过滤除菌，装入灭菌瓶中，取样检验无菌后于-20℃贮存。

实施例6

一种兔体外肝细胞单层模型传代为连续性肝细胞株的储存方法，包括如下步骤：

用Versene胰蛋白酶溶液常规消化培养得到的细胞单层，然后以500×g离心10min收集细胞；按照25mL细胞培养瓶中培养7-9天的细胞消化离心后收集到的细胞添加1mL细胞冷冻保存液于1只安瓶；

将安瓶集中放在盒中，分三步缓慢降温：（1）4℃放置2h，（2）-20℃放置1h，（3）置于-70℃超低温冰箱或液氮中保存。

所述安瓶降温步骤的第（2）步，-20℃放置的时间不得超过1h。

细胞冷冻后的复苏方法为：

（1）迅速解冻，取出安瓶后拿止血钳夹好，立即投入37℃水浴中，至全部溶解；不可让水没过管盖；

（2）用70%酒精浸泡消毒后打开安瓶，将细胞悬液转入离心管中，补加细胞生长液，以500×g离心10min后，倒掉液体；

（3）加细胞生长液使细胞浓度为0.2%；按1只安瓶复苏1瓶25mL的细胞；

（4）观察细胞贴壁后，轻轻倒出旧细胞生长液，换新的细胞生长液继续培养。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从那一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (10)

1.一种兔体外单层肝细胞系模型建立方法，其特征在于包括如下步骤：

a、兔子肝脏的获取：将兔子击昏脑部致死后，置于消毒液中0.5-2分钟后取出，沥净消毒液后，无菌取出兔子的肝脏放入培养皿中；

b、兔子肝脏的预处理：将兔子肝脏在培养皿中用平衡盐溶液洗净血液后，更换新的平衡盐溶液，将兔子肝脏边剪碎边用平衡盐溶液清洗，将兔子肝脏剪成约1mm³的碎块；

c、消化得到分散的兔子肝细胞：将剪碎的兔子肝细胞放入珠瓶中，震荡打散，然后加入消化液，将珠瓶放入37℃的恒温水浴箱中消化8~15分钟；所述消化液为0.025%胰酶；

d、收集细胞悬液：取出珠瓶，加入DMEM液充分震荡至溶液浑浊，经4-6层纱布过滤到小烧杯内，重复收集步骤4-5次，得到含有消化好的兔子肝细胞的悬液；

e、离心：将所述悬液分装入10mL的离心管中，800-1000r/min离心5-7分钟；

f、培养：弃去上清液，将离心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入细胞培养瓶中，然后加入180-210μL双抗、1mL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度线，将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养3-6天，得到兔体外单层肝细胞系模型；

所述步骤b-d、f均在超净工作台上进行。

2.根据权利要求1所述的一种兔体外单层肝细胞系模型建立方法，其特征在于：作为肝脏来源的兔子为体重470-530g的幼兔。

3.根据权利要求1所述的一种兔体外单层肝细胞系模型建立方法，其特征在于：所述步骤e离心后得到的压积的肝细胞进行步骤f的培养操作时，按照每1mL细胞传6个细胞培养瓶。

4.根据权利要求1所述的一种兔体外单层肝细胞系模型建立方法，其特征在于：所述0.025%胰酶替换为1%的I型胶原酶，消化时间则为13-16min。

5.根据权利要求1所述的一种兔体外单层肝细胞系模型建立方法，其特征在于：所述消毒液为新洁尔灭消毒液。

6.一种权利要求1得到的兔体外肝细胞单层模型传代为连续性肝细胞株的培养方法，其特征在于包括如下步骤：

第一步，收集细胞

将细胞培养瓶中的原有细胞生长液倾出，加入0.02%的Versene溶液2mL，摇晃3-6次倒掉，重复该操作一次，然后加入Versene胰蛋白酶溶液，放置至细胞培养瓶的边缘有小点状的透明出现，立刻倒掉细胞培养瓶中的液体，以手拍击细胞培养瓶，细胞呈流沙样脱落，然后加入DMEM液2mL，吹打细胞直至瓶壁透亮，得到细胞悬液；

第二步，细胞的传代培养

将细胞悬液分成两份接种到2个细胞培养瓶中，然后加入200μL双抗、1mL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度线，将细胞培养瓶置于37℃、5%CO₂恒温培养箱。

7.根据权利要求6所述的兔体外肝细胞单层模型传代为连续性肝细胞株的培养方法，其特征在于：以手拍击细胞培养瓶时，若细胞未呈流沙样脱落，则利用倾倒后细胞培养瓶中剩余的液体继续放置一段时间，直至出现流沙样情况，再进行后续操作。

8.根据权利要求6或7所述的兔体外肝细胞单层模型传代为连续性肝细胞株的储存方法，其特征在于包括如下步骤：

用Versene胰蛋白酶溶液常规消化培养得到的细胞单层，然后以500×g离心10min收集细胞；按照25mL细胞培养瓶中培养7-9天的细胞消化离心后收集到的细胞添加1mL细胞冷冻保存液于1只安瓶；

将安瓶集中放在盒中，分三步缓慢降温：（1）4℃放置2h，（2）-20℃放置1h，（3）置于-70℃超低温冰箱或液氮中保存。

9.根据权利要求8所述的兔体外肝细胞单层模型传代为连续性肝细胞株的储存方法，其特征在于：所述安瓶降温步骤的第（2）步，-20℃放置的时间不得超过1h。

10.根据权利要求8所述的细胞冷冻后的复苏方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）迅速解冻，取出安瓶后拿止血钳夹好，立即投入37℃水浴中，至全部溶解；不可让水没过管盖；

（2）用70%酒精浸泡消毒后打开安瓶，将细胞悬液转入离心管中，补加细胞生长液，以500×g离心10min后，倒掉液体；

（3）加细胞生长液使细胞浓度为0.2%；按1只安瓶复苏1瓶25mL的细胞；

（4）观察细胞贴壁后，轻轻倒出旧细胞生长液，换新的细胞生长液继续培养。