CN103919908B - 一种预防和治疗废用性骨质疏松的药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防和治疗废用性骨质疏松的药物及其制备方法，所述药物包括以下原料药制成：熟地、续断、桑寄生、当归、桃仁、红花、牛膝、骨碎补和甘草，为补肾活血方。还可以包括黄芪和太子参，为益气补肾活血方。本发明的药物可改善废用性骨质疏松大鼠的骨代谢；可以降低ALP、BAP的含量，明显增加血Ca、BGP、BMP-2、HOP、HOP/Cr和TRAP的含量；可以降低TNF-α、IL-4、IL-6的含量，还可促进骨髓间充质干细胞增殖，有效增加BALP的活性，可增加骨形成，有助于治疗废用性骨质疏松；可明显促进破骨细胞增殖，可提高骨形成，降低骨吸收，促进骨量的增加，对废用性骨质疏松有一定得预防作用。

Description

一种预防和治疗废用性骨质疏松的药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种预防和治疗废用性骨质疏松的药物及其制备方法。

背景技术

废用性骨质疏松（DisuseOsteoporosisDOP），是由于机械应力对骨的作用减少从而导致机体局部或全身的骨量丢失和骨质量降低而出现的一种局部或全身的骨质疏松现象。临床中因各种疾病原因而必须长期卧床、运动能力受限和外科制动的患者以及宇航员都有可发生DOP。当制动导致骨的正常负荷减弱或者消失时，与外力负荷相对应的骨重建随之发生，引起机械强度下降，骨质萎缩。有研究表明，当病人卧床4周时，髂骨松质骨骨量开始下降，至卧床25周时骨量下降约为33%虽然在主动活动后可以慢慢恢复，但往往时间较长，已经成为骨关节疾病、外伤、骨关节手术后必须接受长期制动的患者术后恢复的重要障碍，甚至发生废用性骨质疏松骨折，进而影响原发病的治疗和康复。如何在卧床期间预防和减少骨量丢失，有效降低再次骨折的几率，缓解骨质疏松并发的疼痛，是医学界一直在探索的问题。

中医药独特的整体观念、辨证论治的思想和确定的临床效果，被广泛的运用到治疗骨质疏松的过程中，古代医籍中虽无废用性骨质疏松之病名，但根据其症状表现，可将其归于中医“骨痿”的范畴。在辨证论治的基础上，根据“肾主骨生髓”的理论，其临床治疗中多以补肾为主进行古方加减或自拟方进行治疗。如周志昆等用黄芪三仙汤治疗绝经后骨质疏松症，结果显示治疗组骨碱性磷酸酶(AKP)、4小时尿钙/肌酐及经脯氨酸/肌酐(HyP/cr)均显著性降低，而骨密度和血清雌二醇均显著升高，检测BMD和血雌二醇水平均显著性升高,提示黄芪三仙汤可提高雌激素水平,从而改善骨代谢,防止骨丢失,这可能是通过提高患者垂体-性腺轴功能来实现的。邹小娟等用补肾壮骨通痹汤为基础方,治疗肾虚络痹所致的原发性骨质疏松；康毅用淫羊藿、白术、黄芪等组成补骨胶囊,用补肾健脾法治疗原发性骨质疏松症；何小琦等从补肾养血入手，用淫羊藿、巴戟天、金樱子、当归、白芍、大枣、何首乌等药治疗绝经后骨质疏松症，均取得较好的疗效。中医药治疗骨质疏松的不断发展有效提高了临床效果。

目前，现有中医药治疗骨质疏松起到一定的疗效，但并不理想。因废用性骨质疏松起病隐匿，未得到足够的认识，因此治疗废用性骨质疏松的方剂较少。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种预防和治疗废用性骨质疏松的药物，即益气补肾活血方，并通过建立废用性骨质疏松大鼠模型，模拟临床上废用性骨质疏松的生理病理过程，从多方面研究了益气补肾活血方对废用性骨质疏松的预防治疗作用。

为了实现上述目的，本发明提出如下技术方案：

一种预防和治疗废用性骨质疏松的药物，所述药物包括以下原料药制成：

熟地、续断、桑寄生、当归、桃仁、红花、牛膝、骨碎补和甘草。

优选的，各原料药的重量份数为：熟地20－30份，续断10－20份，桑寄生10－20份，当归10－15份，桃仁8－10份，红花10－15份，牛膝20－40份，骨碎补10－15份，甘草5－8份。

优选的，各原料药的重量份数为：熟地22－25份，续断14－17份，桑寄生12－16份，当归11－13份，桃仁8－10份，红花10－13份，牛膝28－33份，骨碎补10－13份，甘草5－7份。

优选的，各原料药的重量份数为：熟地24份，续断15份，桑寄生15份，当归12份，桃仁9份，红花12份，牛膝30份，骨碎补12份，甘草6份。

优选的，还包括以下重量份的原料药：黄芪50－70份，太子参10－20份。

优选的，各原料药的重量份数为：黄芪55－65份，太子参13－16份，熟地22－25份，续断14－17份，桑寄生12－16份，当归11－13份，桃仁8－10份，红花10－13份，牛膝28－33份，骨碎补10－13份，甘草5－7份。

优选的，各原料药的重量份数为：黄芪60份，太子参15份，熟地24份，续断15份，桑寄生15份，当归12份，桃仁9份，红花12份，牛膝30份，骨碎补12份，甘草6份。

本发明还提供上述的药物的制备方法，其特征在于，步骤是：称取配方量的原料药加药材体积5倍水，浸泡2h，第一次煎煮45min，倒出水煎液，加适量水，再次煎煮40min，合并两次水煎液，浓缩成一定浓度（剂量为480mg生药/ml），即得。

本发明的药物可显著改善废用性骨质疏松大鼠的骨代谢，明显增加大鼠骨密度（BMD）和骨矿含量（BMC），有效增加骨湿重和骨干重，显著改善大鼠股骨的结构和功能，促进生物力学指标的优化；益气补肾活血方可以明显的降低血清碱性磷酸酶（ALP）、骨特异性碱性磷酸酶（BAP），明显增加血Ca、骨钙素（BGP）、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、尿羟脯氨酸HOP、HOP/Cr和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的含量；益气补肾活血方可以比较明显的降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-6（IL-6）的含量，还可明显促进骨髓间充质干细胞增殖，有效增加骨源性碱性磷酸酶（BALP）的活性，通过显微镜下观察可发现交过骨髓间充质干细胞转化为了成骨细胞，一定程度上说明了益气补肾活血方可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化，影响骨代谢，增加骨形成，有助于治疗废用性骨质疏松；可明显促进破骨细胞增殖，有效降低骨吸收陷窝的数量，说明了益气补肾活血方可在一定程度上提高骨形成，降低骨吸收，促进骨量的增加，对废用性骨质疏松有一定得预防作用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但不能理解为对本发明的限制。

实施例：益气补肾活血方和补肾活血方及其制备方法

称取黄芪60g，太子参15g，熟地24g，续断15g，桑寄生15g，当归12g，桃仁9g，红花12g，牛膝30g，骨碎补12g，甘草6g；加药材体积5倍水，浸泡2h，第一次煎煮45min，倒出水煎液，加适量水，再次煎煮40min，合并两次水煎液，浓缩成一定浓度（剂量为480mg生药/ml），即得，称为益气补肾活血方剂。

按上法称取熟地24g，续断15g，桑寄生15g，当归12g，桃仁9g，红花12g，牛膝30g，骨碎补12g，甘草6g。加药材体积5倍水，浸泡2h，第一次煎煮45min，倒出水煎液，加适量水，再次煎煮40min，合并两次水煎液，浓缩成一定浓度（剂量为480mg生药/ml），即得，称为补肾活血方剂。

下面通过实验例1－4对本实施例制备的益气补肾活血方和补肾活血方治疗废用性骨质疏松的疗效进行评价。其中：

实验材料：药品为本实施例制备的益气补肾活血方和补肾活血方，购自济南市建联中药店（批号：20120501；生产许可证号：鲁20100043）；戊巴比妥钠（PentobarbitalSodium），规格：25g/瓶，美国Sigma（货号：P3761）；钙尔奇碳酸钙D3片（CalciumCarbonateandVitaminD3Tablets），规格：复方，惠氏制药有限公司（批号：20100735）。

动物：老年雄性SD大鼠，体重（350±20）g，SPF级，购于济宁市任城区鲁原动物饲料经营部，动物许可证号：SCXK鲁20080002。

大鼠废用性骨质疏松模型的建立：

实验用大鼠分组：见具体实验例。

麻醉各实验组大鼠：将定量戊巴比妥钠加适量蒸馏水配制成1%质量百分浓度，实验组大鼠按照40mg/kg的浓度腹腔注射进行麻醉，待动物失去知觉时方可进行实验；空白对照组不做任何措施。

建立模型：用75%酒精将大鼠的右后肢和尾部近段进行消毒，同时对直径为1.2mm的医用钢丝进行消毒，然后将医用钢丝穿过大鼠的右后肢踝部和肛门开口远侧约1.5cm处的尾部，适当调整松紧程度进行打节固定，建模过程中若有出血的话即刻利用脱脂棉进行压迫止血，然后用石膏进行固定，使用聚氨酯石膏绷带缠绕至髋关节处2至3层，保持膝关节和踝关节于伸直位。整个过程完成后放入大鼠专用饲养笼中，每笼5只，在清洁级动物房中进行饲养，调整室温（20±2）℃，空气湿度为40～60%，每日按照自然昼夜12h间隔照明，为了避免石膏松动和肢体压疮，每2周更换一次石膏。

给药方案：制备大鼠废用性骨质疏松模型1周后，对各实验组大鼠分别进行灌胃给药，益气补肾活血方组：将益气补肾活血方剂按照4800mg/kg的浓度对大鼠进行灌胃，1次/天；补肾活血方组：将补肾活血方剂按照4800mg/kg的浓度对大鼠进行灌胃，1次/天；模型组和空白对照组：每只大鼠按照10ml/kg给予生理盐水进行灌胃，1次/天；钙尔奇组：将钙尔奇碳酸钙D3片用研钵研成细微粉末，然后用无菌蒸馏水配制成混悬液（1ml混悬液含有0.36mg钙尔奇碳酸钙D3），然后按照3.6mg/kg的浓度对该组大鼠进行灌胃，1次/天；每组均连续给药1个月。

实验例1：益气补肾活血方和补肾活血方对废用性骨质疏松大鼠骨密度的影响

1骨密度（BMD）和骨矿含量（BMC）的测定

用1%戊巴比妥钠按照40mg/kg的浓度对各实验组大鼠腹腔注射进行麻醉，然后用注射器在每只大鼠的颈动脉处进行穿刺放血处死，铺一次性中单，将大鼠放置在骨密度仪检查床上，骨密度仪探头下，选用动物全身骨密度测定软件对被测大鼠进行全身扫描。

选择慢速扫描模式，76Kv电压，150μA。在双能X射线骨密度分析仪的测量方式选项中选择系统默认标准测量对各实验组大鼠的全身、股骨和脊柱进行骨密度分析，并准确记录数据，测定各实验组大鼠的骨密度（BMD）和骨矿含量（BMC），分别精确至0.01g和0.01g/cm²。

2骨湿重的测定：通过上述实验将各实验组大鼠麻醉处死并测定全身、股骨和脊柱的骨密度（BMD）和骨矿含量（BMC）后，切下每只大鼠的右后肢，用镊子小心剔除干净软组织，去除附着的肌肉组织和结缔组织，收取股骨进行骨湿重的实验测定，同时剥离胫骨，放入70%乙醇中固定，以备研究骨组织形态计量学的研究。用电子分析天平准确称取各实验组大鼠的新鲜股骨湿重，实验数据精确至0.01mg，并及时作好记录。

全部大鼠的股骨骨湿重测量完毕后，用浸透生理盐水的纱布将每组的右侧股骨包好，置于—20℃低温保存，以备下面的生物力学检测。

3股骨干重、灰重测量：进行完大鼠股骨生物力学的测定后，将各组大鼠的股骨标本收集好，全部置于高温炉（105±2）℃中烘烤1小时后称量股骨干重；精确记录各组大鼠股骨干重后，将各组标本置于800℃的马福炉中5.5小时，待其充分灰化后用1/10万电子分析天平测各组灰重。

4数据处理：全部数据采用SPSS18.0统计软件进行处理，数据结果以“均数±标准差”表示，各实验组结果之间采用单因素方差方法进行统计分析，P＜0.05为差异具有统计学意义，采用盲法评估。

5实验结果

5.1骨密度（BMD）和骨矿含量（BMC）结果

各实验组大鼠全身骨密度（BMD）和骨矿含量（BMC）的结果见表1-1。

表1-1益气补肾活血方对废用性骨质疏松大鼠全身BMD和BMC的影响

注：与空白对照组比较，※P﹤0.05；与模型组比较，＃P﹤0.05

由上表可以看出，实验后益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠全身BMD分别为0.365、0.352、0.291、0.386、0.379g/cm²，和空白对照组相比，模型组大鼠全身BMD显著降低（P﹤0.05），说明我们建立废用性骨质疏松模型很成功；益气补肾活血方组和钙尔奇组大鼠全身BMD相比无统计学差异，补肾活血方组和空白对照组相比大鼠全身BMD显著降低（P﹤0.05），效果较复方的益气补肾活血方祖较差，钙尔奇组和空白对照组相比大鼠BMD无明显差异。和模型组相比，益气补肾活血方组、补肾活血方组、空白对照组和钙尔奇组大鼠全身BMD显著增加（P﹤0.05），说明我们研究的益气补肾活血方可有效增加废用性骨质疏松大鼠的全身BMD，对治疗废用性骨质疏松有一定效果。

实验后益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠全身平均BMC分别为0.305、0.295、0.283、0.313、0.308g。和空白对照组相比，补肾活血方组和模型组大鼠全身BMC均显著下降（P﹤0.05）；和模型组比较，益气补肾活血方组、空白对照组和钙尔奇组大鼠全身BMC均显著增加（P﹤0.05），补肾活血方组大鼠全身平均BMC和模型组相比无明显差异；益气补肾活血方组大鼠全身BMC和钙尔奇组相比亦无明显变化，说明中药益气补肾活血方治疗废用性骨质疏松的效果和西药钙尔奇效果相当，具有临床研究价值。

各实验组大鼠股骨骨密度（BMD）和骨矿含量（BMC）的结果见表1-2。

表1-2益气补肾活血方对废用性骨质疏松大鼠股骨BMD和BMC的影响

注：与空白对照组比较，※P﹤0.05；与模型组比较，＃P﹤0.05

由上表可以看出，实验后益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠股骨BMD分别为0.241、0.237、0.198、0.253、0.242g/cm²。和空白对照组相比，模型组合补肾活血方组大鼠股骨BMD在一定程度上显著降低（P﹤0.05），益气补肾活血方组和补肾活血方组大鼠股骨BMD差异不明显；和模型组比较，益气补肾活血方组、补肾活血方组、空白对照组和钙尔奇组大鼠股骨BMD均明显增加（P﹤0.05），充分说明我们建立废用性骨质疏松模型是非常成功的，益气补肾活血方组和钙尔奇组大鼠股骨BMD无统计学差异，说明中药益气补肾活血方组治疗废用性骨质疏松的效果仅次于西药，为临床研究中药益气补肾活血方治疗骨质疏松提供了理论依据。

实验后益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠股骨平均BMC分别为0.049、0.045、0.040、0.052、0.050g,和空白对照组相比，模型组和补肾活血方组大鼠股骨BMC均明显减少（P﹤0.05），钙尔奇组大鼠股骨平均BMC和空白对照组相比无明显差异；和模型组比较，益气补肾活血方组、空白对照组和钙尔奇组大鼠股骨BMC均明显增加（P﹤0.05），补肾活血方组大鼠股骨BMC和模型组相比无明显差异，益气补肾活血方组大鼠股骨BMC和补肾活血方组相比显著增加（P﹤0.05），益气补肾活血方组大鼠股骨BMC和钙尔奇组相比无明显差异，效果仅次于西药，充分说明了中药益气补肾活血方组可有效治疗废用性骨质疏松。

5.2骨湿重测定结果：各实验组大鼠股骨湿重测定结果见表1-3。

表1-3益气补肾活血方对废用性骨质疏松大鼠股骨湿重的影响

注：与空白对照组比较，※P﹤0.05；与模型组比较，＃P﹤0.05

由上表可看出，实验后益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠股骨湿重分别为458.58、394.76、358.03、785.70、583.68mg。和空白对照组相比，益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组和钙尔奇组大鼠股骨湿重有显著性减少（P＜0.05）；和模型组相比，钙尔奇组大鼠股骨湿重有显著性增加（P＜0.05）；补肾活血方组大鼠股骨湿重和模型组相比无显著性差异，和钙尔奇组相比有显著性减少（P＜0.05），和益气补肾活血方组相比稍有减少，但差异不明显；钙尔奇组大鼠股骨湿重和益气补肾活血方组相比稍有增加，但无显著性差异。

5.3股骨干重、灰重测定结果：各实验组大鼠股骨干重和灰重的检测结果见表1-4。

表1-4益气补肾活血方对废用性骨质疏松大鼠股骨干重和灰重的影响

注：与空白对照组比较，※P﹤0.05；与模型组比较，＃P﹤0.05

通过实验检测各实验组大鼠股骨干重，我们发现益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠股骨干重分别为0.650、0.620、0.598、0.754、0.690g。和空白对照组相比较，益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组大鼠股骨干重有显著性减少（P＜0.05）；和模型组相比较，益气补肾活血方组和钙尔奇组大鼠股骨干重有显著性增加（P＜0.05）；益气补肾活血方组大鼠股骨干重和补肾活血方组相比较稍有增加，但差异不明显，益气补肾活血方组大鼠股骨干重和钙尔奇组相比较稍有降低，但差异亦不明显；补肾活血方组大鼠股骨干重和模型组相比较无明显差异；补肾活血方组大鼠股骨干重和钙尔奇组相比有显著性减少（P＜0.05）。

通过实验检测各实验组大鼠股骨灰重，我们发现益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠股骨灰重分别为0.409、0.392、0.380、0.428、0.416g。和空白对照组相比较，补肾活血方组和模型组大鼠股骨灰重降低有显著性差异（P＜0.05）；和模型组相比较，益气补肾活血方组和钙尔奇组大鼠股骨灰重有显著性增加（P＜0.05）；补肾活血方组大鼠股骨灰重和模型组相比较稍有增加，但无显著性差异；益气补肾活血方组大鼠股骨灰重和补肾活血方组相比稍有增加，但无显著性差异，益气补肾活血方组大鼠股骨灰重和钙尔奇组相比有显著性降低（P＜0.05），补肾活血方组大鼠股骨灰重和钙尔奇组大鼠相比有显著性降低（P＜0.05）。

通过检测各实验组大鼠股骨干重和灰重，我们发现益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠股骨灰重/干重（%）分别为0.629、0.632、0.635、0.576、0.602。和空白对照组相比较，益气补肾活血方组、补肾活血方组和模型组大鼠股骨灰重/干重（%）有显著性增加（P＜0.05）；和模型组相比较，钙尔奇组大鼠股骨灰重/干重（%）有显著性降低（P＜0.05）；补肾活血方组大鼠股骨灰重/干重（%）和模型组相比较无明显差异，益气补肾活血方组大鼠股骨灰重/干重（%）和补肾活血方组相比较稍有降低，但无显著性差异；益气补肾活血方组大鼠股骨灰重/干重（%）和钙尔奇组大鼠相比较有显著性增加（P＜0.05），补肾活血方组大鼠股骨灰重/干重（%）和钙尔奇组大鼠相比较有显著性增加（P＜0.05）。

结论：本实验主要是探讨益气补肾活血方对废用性骨质疏松大鼠BMD、BMC、骨湿重、股骨生物力学、股骨干重和灰重以及骨组织形态计量学的影响。实验结果我们发现益气补肾活血方可以明显增加废用性骨质疏松大鼠的骨密度和骨矿含量，通过观察股骨生物力学指标我们可以发现废用性骨质疏松模型组大鼠的股骨抗应力刚性明显下降，包括骨强度和韧性都有所降低。废用性骨质疏松模型组大鼠股骨强度下降可能是因为骨矿物质减少造成了骨量减少、骨弹性力度显著下降以及韧度相对下降偏少。益气补肾活血方可明显增加废用性模型大鼠股骨的硬度、韧性和抗骨折的能力，免疫组化显示益气补肾活血方也能明显增加骨组织中TGF的表达，起到治疗改善废用性骨质疏松的作用。

实验例2：益气补肾活血方和补肾活血方对废用性骨质疏松大鼠骨转化生化指标的影响

1实验材料：另外还有：血清碱性磷酸酶检测试剂盒，上海复星长征医学科技有限公司；尿DPD检测试剂盒，美国QUIDEL公司；骨源性碱性磷酸酶BAP试剂盒，北京金域高科技术有限公司；大鼠BGP放射免疫分析试剂盒，长城生物有限公司；大鼠骨形态发生蛋白-2（BMP-2）；ELISA定量检测试剂盒，武汉博士得生物工程有限公司。

2实验方法

2.1大鼠废用性骨质疏松模型的建立：实验用大鼠分组：将50只SD大鼠以区组随机法随机分为5组：益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组、钙尔奇组，用来测定大鼠骨形成指标血清碱性磷酸酶(ALP）、骨钙素（BGP）、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、Ca；、HYP含量与HOP/Cr比值。两部分大鼠的建模方法和给药方式完全相同。建模方法同实验例1。

2.2骨形成指标的测定：各实验组大鼠给药1个月后，分别进行血样采集，采血前各实验组动物禁食不禁水16h以上，用1%戊巴比妥钠按照40mg/kg的浓度分别对各实验组大鼠腹腔注射进行麻醉，然后开腹并用一次性无菌注射器从各实验组大鼠腹主动脉进行采血，分别置于无菌离心管中并且分别进行标号，然后在1500r/min转速下离心10min，无菌分离血清，将血清经56℃，30min灭活，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装入无菌小瓶，置-20℃冰箱中保存，备用。

采用全自动生化仪检测碱性磷酸酶（ALP）、血Ca和P的含量：实验时先把各实验组标本血清从冰箱中拿出来，放置室温下使其慢慢融化，分别取各实验组上清液0.5mL，采用全自动生化仪对各实验组大鼠血液中碱性磷酸酶（ALP）、血Ca和P等生化指标进行测定来研究益气补肾活血方对废用性骨质疏松的作用，每个样本读值3次，然后取平均值，作好记录。

采用放射免疫法检测骨钙素（BGP）的含量：我们按照大鼠BGP试剂盒上的说明方法进行操作，步骤如下：（单位：μl）

充分混匀后，在室温放置20min，将标本在4℃下3500r/min离心20min,测沉淀CPM。

用N/T、B/T计算NSB、S0结合百分率，用B/B0计算标准及待测物结合百分率，在半对数坐标纸上绘出标准曲线，查出样品值或者在自动γ放射免疫计数器上直接读出结果。组织样品乘法以稀释倍数，然后换算成ng/ml组织。

采用酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测骨形态发生蛋白（BMP-2）的含量

（一）配制试剂：将标准品1200ng/L进行倍比稀释，配成1200ng/L、600ng/L、300ng/L、150ng/L、75ng/L、37.5ng/L标准品。

（二）操作步骤：按照武汉博士得生物有限公司提供的大鼠骨形态发生蛋白-2（BMP-2）ELISA试剂盒说明书进行操作，步骤如下：

1、取出试剂盒，放置于室温（20-25℃）下进行复温，平衡30分钟。

2、用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。

3、取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品中加入标准品50μL，待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL，空白对照孔不加。

4、将酶标板用封口胶密封后，在孵育箱中温育60min（温度为37℃）。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次。

6、每孔加入酶标工作液50μL，空白对照组不加。

7、在孵育箱中温育30min（温度为37℃）。

8、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次。

9、每孔先加入显色剂A液50μL，再加入显色剂B液50μL，用手轻轻震荡混匀30s，37℃避光显色15min。

10、取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。

11、以空白孔调零，在终止后30分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。

根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。（实际浓度=测定浓度×5）

2.3骨吸收指标的测定：各实验组大鼠给药1个月后，次日清晨分别收集各实验组大鼠的空腹中段尿3-5ml，分别进行标记，

随后用1%戊巴比妥钠按照40mg/kg的浓度分别对各实验组大鼠腹腔注射进行麻醉，然后开腹并用一次性无菌注射器从各实验组大鼠腹主动脉进行采血，分别置于无菌离心管中并且分别进行标号，然后在1500r/min转速下离心10min，无菌分离血清，将血清经56℃，30min灭活，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装入无菌小瓶，置-20℃冰箱中保存，备用。

采用全自动生化仪对各实验组大鼠血液中HYP和HOP/Cr比值进行检测，采用金标法检测各实验组大鼠血液中BAP的表达，在分子水平来研究益气补肾活血方对废用性骨质疏松的作用。

3实验结果

3.1骨形成指标测定结果

3.1.1血清碱性磷酸酶（ALP）、血Ca和P含量测定结果：我们采用全自动生化仪检测了各实验组大鼠血清中与骨形成相关的指标，分别有血清碱性磷酸酶（ALP）、血Ca和P等，结果见表2-1。

表2-1益气补肾活血方对废用性骨质疏松大鼠骨形成指标的影响1

注：与空白对照组比较，※P﹤0.05；与模型组比较，＃P﹤0.05

通过检测各实验组大鼠血清ALP的含量我们发现，益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠血清中ALP的含量分别为73.49、79.78、97.56、66.47、70.35（U/L）。和空白对照组相比，模型组和补肾活血方组大鼠血清中ALP的含量增加有显著性差异（P＜0.05）；和模型组相比，益气补肾活血方组和钙尔奇组大鼠血清中ALP的含量减少有显著性差异（P＜0.05）；益气补肾活血方组和钙尔奇组相比大鼠血清ALP的含量无显著性差异，补肾活血方组和益气补肾活血方组相比大鼠血清中ALP的含量增加有显著性差异（P＜0.05）。通过观察各实验组大鼠血清中ALP含量的变化我们发现，空白组大鼠血清ALP的含量最低，然后依次是钙尔奇组、益气补肾活血方组、补肾活血方组和模型组，通过检测大鼠血清中ALP的含量我们可以推测出益气补肾活血方对治疗废用性骨质疏松是有一定效果的，补肾活血方组治疗废用性骨质疏松效果比益气补肾活血方组稍差。

通过检测各实验组大鼠血清中血Ca的含量我们发现，益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠血清中血Ca的含量分别为2.01、1.95、1.84、2.47、2.35（mmol/L）。和空白对照组相比，补肾活血方组和模型组大鼠血清中血Ca的含量降低有显著性差异（P＜0.05）；和模型组相比，钙尔奇组大鼠血清中血Ca的含量增加有显著性差异（P＜0.05）；补肾活血方组和模型组相比大鼠血清中血Ca的含量无明显差异，益气补肾活血方组和补肾活血方组相比大鼠血清中血Ca的含量亦无明显差异，益气补肾活血方组和钙尔奇组相比大鼠血清中血Ca的含量稍有降低，但是差异不明显。通过检测各实验组大鼠血清中血P的含量我们发现，益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠血清中血P的含量分别为1.11、1.09、1.08、1.06、1.12（mmol/L）。各实验组大鼠血清中血P的含量相比均无明显差异。以上实验结果我们发现实验前后各实验组大鼠血清中血Ca的含量稍有差别，但血P的含量差别不是很大，可能是因为机体对骨盐的溶解和沉积具有很强的调控作用，所以导致了各实验组大鼠血清中血Ca和血P的含量只在很小的范围内变化。

3.1.2骨钙素（BGP）和骨形态发生蛋白（BMP-2）的含量测定结果：我们采用了放射免疫法检测了各实验组大鼠血清中BGP的含量，采用酶联免疫吸附方法（ELISA法）检测了各实验组大鼠血清中BMP-2的含量，结果见表2-2。

表2-2益气补肾活血方对废用性骨质疏松大鼠骨形成指标的影响2

注：与空白对照组比较，※P﹤0.05；与模型组比较，＃P﹤0.05

通过检测各实验组大鼠血清中骨钙素（BGP）的含量我们发现，益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠血清中骨钙素（BGP）的含量分别为6.53、5.68、2.42、8.51、7.65（ng/mL）。和空白对照组相比较，模型组大鼠血清中骨钙素（BGP）的含量降低有显著性差异（P＜0.05）；和模型组相比较，益气补肾活血方组、补肾活血方组和钙尔奇组大鼠血清中骨钙素（BGP）的含量增加有显著性差异（P＜0.05）；益气补肾活血方组大鼠血清中骨钙素（BGP）的含量和补肾活血方组相比无显著性差异，益气补肾活血方组大鼠血清中骨钙素（BGP）的含量和钙尔奇组相比亦无显著性差异。

通过检测各实验组大鼠血清中骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的含量我们发现，益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠血清中BMP-2的含量分别为705.86、686.91、623.07、807.78、735.64(pg/ml)。和空白对照组相比较，补肾活血方组和模型组大鼠血清中BMP-2的含量降低有显著性差异（P＜0.05）；和模型组相比较，益气补肾活血方组和钙尔奇组大鼠血清中BMP-2的含量增加有显著性差异（P＜0.05）；补肾活血方组大鼠血清中BMP-2的含量和模型组相比无显著性差异，益气补肾活血方组大鼠血清中BMP-2的含量和钙尔奇组相比亦无显著性差异，补肾活血方组大鼠血清中BMP-2的含量与益气补肾活血方组相比稍有下降，一定程度上说明复方益气补肾活血方剂治疗废用性骨质疏松的效果要优于补肾活血方剂。

3.2骨吸收指标测定结果：

采用全自动生化仪检测了各实验组大鼠血清中HOP含量和HOP/Cr的比值，采用金标法检测了各实验组大鼠血清中骨特异性碱性磷酸酶（BAP）的含量，放免法检测了各实验组大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的含量。实验结果见表2-3，每组实验大鼠有12只。

表2-3益气补肾活血方对废用性骨质疏松大鼠骨吸收指标的影响

注：与空白对照组比较，※P﹤0.05；与模型组比较，＃P﹤0.05

我们采用金标法检测了各实验组大鼠血清中骨特异性碱性磷酸酶（BAP）的含量，发现益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白组和钙尔奇组大鼠血清中骨特异性碱性磷酸酶（BAP）的含量分别为170、185、207、153、169（U/L）。和空白对照组相比较，模型组大鼠血清中骨特异性碱性磷酸酶（BAP）的含量有显著性的增加（P＜0.05）；和模型组相比较，益气补肾活血方组和钙尔奇组大鼠血清中骨特异性碱性磷酸酶（BAP）的含量有显著性的减少（P＜0.05）；益气补肾活血方组大鼠血清中骨特异性碱性磷酸酶（BAP）的含量和钙尔奇组相比无显著性差异，补肾活血方组大鼠血清中骨特异性碱性磷酸酶（BAP）的含量和益气补肾活血方组相比稍有增加。通过建立了大鼠废用性骨质疏松模型我们发现，废用性骨质疏松大鼠有较强的骨吸收率，而强的骨吸收率又导致骨形成的代偿性增加，一定程度上导致了血BAP的水平增加，通过阳性对照组钙尔奇和益气补肾活血方组治疗后我们发现大鼠骨特异性碱性磷酸酶（BAP）的含量均有一定程度的降低，反映废用性骨质疏松症的治疗程度。

我们采用放免法检测了各实验组大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的含量，发现益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白组和钙尔奇组大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的含量分别为7.13、6.58、3.82、10.36、8.25（IU/L）。和空白对照组相比，模型组大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的含量降低有显著性差异（P＜0.05）；和模型组相比，益气补肾活血方组和钙尔奇组大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的含量增加有显著性差异（P＜0.05）；益气补肾活血方组大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的含量和补肾活血方组相比无明显差异，益气补肾活血方组大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的含量和钙尔奇组相比亦无明显差异。

我们采用全自动生化分析仪检测了各实验组大鼠血清中尿羟脯氨酸（HOP）的含量，实验发现益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白组和钙尔奇组大鼠血清中尿羟脯氨酸（HOP）的含量分别为20.76、15.73、7.52、30.35、25.76（mg/L）。和空白对照组相比较，模型组大鼠血清中尿羟脯氨酸（HOP）的含量降低有显著性差异（P＜0.05）；和模型组相比较，益气补肾活血方组、补肾活血方组和钙尔奇组大鼠血清中尿羟脯氨酸（HOP）的含量增加有显著性差异（P＜0.05）；补肾活血方组大鼠血清中尿羟脯氨酸（HOP）的含量和益气补肾活血方组相比无显著性差异，益气补肾活血方组大鼠血清中尿羟脯氨酸（HOP）的含量和钙尔奇组相比亦无明显差异。

实验发现益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白组和钙尔奇组大鼠血清中HOP/Cr值分别为1.472、1.397、1.235、1.491、1.483(mg/μmoL)。和空白对照组相比较，模型组大鼠血清中HOP/Cr值降低有显著性差异（P＜0.05），其他各实验组大鼠血清中HOP/Cr值之间均无显著性差异。

结论：通过实验我们发现益气补肾活血方可以明显的降低血清碱性磷酸酶（ALP）、骨特异性碱性磷酸酶（BAP）的含量，明显增加血Ca、骨钙素（BGP）、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、尿羟脯氨酸HOP、HOP/Cr和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的含量，在一定程度上预防废用性骨质疏松的发生。

实验例3益气补肾活血方和补肾活血方对促进成骨细胞增殖的细胞因子的影响

1实验材料：还包括大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA定量检测试剂盒，大鼠血清白细胞介素-4（IL-4）ELISA定量检测试剂盒、大鼠血清白细胞介素-6（IL-6）ELISA定量检测试剂盒、大鼠血清白细胞介素-10（IL-10）ELISA定量检测试剂盒（武汉博士得生物工程有限公司）。

2大鼠废用性骨质疏松模型的建立

实验用大鼠分组：将50只SD大鼠以区组随机法随机分为5组：益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组、钙尔奇组，用来测定促进各实验组大鼠成骨细胞增殖的细胞因子水平的变化。

按照实验例1的实验方法建立废用性骨质疏松大鼠模型。

3对促进成骨细胞增殖的细胞因子的测定

各实验组大鼠给药1个月后，分别进行血样采集，采血前各实验组动物禁食不禁水16h以上，用1%戊巴比妥钠按照40mg/kg的浓度分别对各实验组大鼠腹腔注射进行麻醉，然后开腹并用一次性无菌注射器从各实验组大鼠腹主动脉进行采血，分别置于无菌离心管中并且分别进行标号，然后在1500r/min转速下离心10min，无菌分离血清，将血清经56℃，30min灭活，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装入无菌小瓶，置-20℃冰箱中保存，备用。

实验时先把各实验组标本血清从冰箱中拿出来，放置室温下使其慢慢融化，分别取各实验组上清液0.5mL，采用酶联免疫吸附试验（ELISA法）对各实验组大鼠血清中促进成骨细胞增殖的细胞因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）]的水平进行测定，来进一步研究研究益气补肾活血方对废用性骨质疏松的作用，作好实验记录。

4实验结果

通过采用ELISA法检测各实验组大鼠血清中促进成骨细胞增殖的细胞因子的含量我们发现，各实验组大鼠血清中促进成骨细胞增殖的细胞因子TNF-α、IL-4、IL-6的含量分别见表3-1。

表3-1益气补肾活血方对废用性骨质疏松大鼠促进成骨细胞增殖的细胞因子的影响

注：与空白对照组比较，※P﹤0.05；与模型组比较，＃P﹤0.05

我们采用酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测了废用性骨质疏松大鼠血清中TNF-α的含量，发现益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠血清中TNF-α的含量分别为1.31、1.43、1.53、0.95、1.13（ng/ml）。和空白对照组相比较，益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组大鼠血清中TNF-α的含量升高有显著性差异（P＜0.05）；和模型组相比，益气补肾活血方组和钙尔奇组大鼠血清中TNF-α的含量降低有显著性差异（P＜0.05）；益气补肾活血方组大鼠血清中TNF-α的含量和补肾活血方组相比稍有降低，但无显著性差异；益气补肾活血方组大鼠血清中TNF-α的含量和钙尔奇组相比显著升高（P＜0.05）。

结果发现益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠血清中IL-4的含量分别为1.37、1.56、1.69、0.97、1.23（ng/ml）。和空白对照组相比较，补肾活血方组和模型组大鼠血清中IL-4的含量有显著性增高（P＜0.05）；和模型组相比较，益气补肾活血方组和钙尔奇组大鼠血清中IL-4的含量有显著性降低（P＜0.05）；补肾活血方组大鼠血清中IL-4的含量和模型组相比无明显差异，益气补肾活血方组大鼠血清中白细IL-4的含量和补肾活血方组相比稍有下降，但没有显著性差异；益气补肾活血方组大鼠血清IL-4的含量和钙尔奇组相比稍有增加，但亦无明显差异，补肾活血方组大鼠血清中IL-4的含量和钙尔奇组相比有显著性增加（P＜0.05）。

通过实验我们发现益气补肾活血方组、补肾活血方组、模型组、空白对照组和钙尔奇组大鼠血清中IL-6的含量分别为10.36、12.86、15.73、6.81、8.25（ng/ml）。和空白对照组相比较，模型组和补肾活血方组大鼠血清中IL-6的含量增加有显著性差异（P＜0.05）；和模型组相比，益气补肾活血方组和钙尔奇组大鼠血清中IL-6的含量减少有显著性差异（P＜0.05）；益气补肾活血方组大鼠血清中IL-6的含量和补肾活血方组相比无显著性差异；益气补肾活血方组大鼠血清中IL-6的含量和钙尔奇组相比亦无显著性差异。通过实验我们发现，经过益气补肾活血方治疗废用性骨质疏松大鼠后，大鼠血清IL-6的含量明显降低，初步说明中药益气补肾活血方可以有效的治疗废用性骨质疏松症。

结论：通过实验我们发现益气补肾活血方可以比较明显的降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-6（IL-6）的含量，为临床研发抗废用性骨质疏松药物提供了理论依据。

实验例4益气补肾活血方和补肾活血方对骨髓间充质干细胞增殖的影响

1.实验材料：还包括DMEM培养液、胰蛋白酶（美国Invitrogen公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料研究所），链霉素，青霉素，，二甲基亚砜DMSO（美国Sigma公司），MTT液（Sigma公司），PBS磷酸盐缓冲剂（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），Percoll细胞分离液（英国Amersham-Phamacia公司），麦胚凝集素（Sigma公司）。

2实验方法

2.1含药血清的制备：将20只SD大鼠随机均分为4组，分别是益气补肾活血方组、补肾活血方组、空白对照组和钙尔奇组。益气补肾活血方组和补肾活血方组分别按照相应的中药方剂对大鼠进行灌胃，空白对照组用生理盐水进行灌胃，钙尔奇组：将钙尔奇碳酸钙D3片用研钵研成细微粉末，然后用无菌蒸馏水配制成混悬液（1ml混悬液含有0.36mg钙尔奇碳酸钙D3），各实验组分别按照5ml/kg的浓度对大鼠进行灌胃，1天的剂量分为两次灌胃，即上午1次，下午1次；分别连续给药3天，第4天1次给各实验组大鼠灌服全天的剂量，末次给药后1小时进行采血，采血之前对各实验组大鼠进行禁食不禁水12小时。用解剖剪打开各实验组大鼠腹部，采集腹主动脉血4ml，分别收集于无菌离心管中，以2500r/min在室温下进行离心25min，分离血清，然后在56℃下灭活补体30min，用0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，置于-20℃冰箱中进行保存备用。

首先配制含药血清的培养液，把1ml含药血清作为一个单位，分别按照1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031标定浓度进行实验（实际浓度应该再除10），即10ml培养基体系中分别含有1ml、0.5ml、0.25ml、0.125ml、0.063ml、0.031ml含药血清，计算IC50（半数细胞抑制量）为5.4ml/l。即在每100ml培养基中分别加入相应的含药血清0.54ml。

2.2主要试剂配制

处理胎牛血清：将冻存的胎牛血清在室温下解冻，设定恒温水浴箱温度为56℃。然后将胎牛血清置于恒温水浴箱中，在56℃条件下进行灭活1h。随后将灭活后的胎牛血清用0.22μm微孔滤膜进行滤过除菌。最后把进行灭活以及除菌的胎牛血清进行分装、标记，置于4℃的冰箱中保存备用。

含10%胎牛血清、双抗的DMEM培养液的配制：首先我们在无菌工作台上取已经灭活、除菌后的胎牛血清5ml、DMEM培养液45ml，然后将二者混合均匀，即可得含10%胎牛血清的DMEM培养液。将青霉素、链霉素各500μg与混合液混匀，即可得含10%胎牛血清、双抗的DMEM培养液。分别进行标记，分装，保存在4℃冰箱中，一周内使用。

PBS缓冲液的配制：用电子天平分别称取KCl0.2g，KH₂PO₄0.2g，NaCl8.0g，NaH₂PO₄·12H₂O₂2.083g置于1L大烧杯中，然后加入双蒸水溶解上述药品，定容到1000ml；随后配制lmol/mL的NaOH溶液少许，用pH计调节缓冲盐的pH至7.4，将PBS缓冲液分别分装在4瓶500mL的盐水瓶中，分别置于高压灭菌锅内进行高压灭菌，无菌保存备用。

MTT溶液（5mg/ml）的配制：首先用电子分析天平准确称量100.00mgMTT，然后加入20mlPBS缓冲液进行溶解，搅拌30min，使混匀全溶。加入NaOH溶液少许用pH计调整PH值7.4左右，然后用0.22μm微孔滤器进行滤过除菌，对MTT溶液进行分装标记。最后将MTT溶液置于棕色瓶中，4℃冰箱中保存备用。

2.3分离大鼠骨髓间充质干细胞：首先用断髓法处死3月龄SD大鼠一只，将其投入75%乙醇中进行消毒5min，置于超净工作台上无菌条件下取出大鼠左侧股骨，然后将股骨放置于75%的酒精中浸泡约15min，用18号针头在骺板处刺入骨髓腔，用L-DMEM培养液将骨髓冲出至无菌培养皿中，反复冲洗至骨髓腔变白，将收集的全部骨髓用注射器反复抽吸，打散组织使之成为细胞悬液，收集细胞悬液以1500r/min的速度室温下离心5min,用吸管吸弃含有脂肪细胞和脂肪组织的上清液，重复此步骤两次使脂肪细胞和脂肪组织尽可能的去除，将获得的细胞沉淀重悬于5ml的培养液中。

2.4纯化骨髓间充质干细胞：用无菌吸管将冲洗后所得的细胞悬液混合均匀，取出2ml细胞悬液加入到5ml1.073g/ml的Percoll梯度分离液中，放置于低温高速离心机中以800r/min的速度在4℃下离心30min。吸取中间单核细胞层，重悬于L-DMEM细胞培养液中，进行有核细胞计数（把计数板平放在显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴1-2滴细胞悬液，使之充满计数板与该片间空隙中。计算细胞数，计数四角大方格内细胞体完整的细胞，压线细胞只计数左线和上线者。细胞数/毫升原悬液=4大格总数/4×10⁴×稀释倍数。）计数完成后，将细胞以3×10⁴/cm²接种于培养瓶中，然后以10%胎牛血清的L-DMEM细胞培养液在37℃5%CO2的细胞培养箱中进行培养48h或者每隔2-3天进行换液一次，每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态变化，当在显微镜下观察细胞长满单层厚，用0.05%的胰蛋白酶液进行消化3min，在显微镜下观察，当细胞皱缩变圆胞质分离时加入适量L-DMEM细胞培养液终止消化，放置于低温高速离心机中以800r/min的转速在4℃下离心4min。弃掉上清，加入适量L-DMEM细胞培养液重悬细胞后按照细胞数1:3或1:4的比例进行传代。

2.5培养骨髓间充质干细胞

2.5.1培养骨髓间充质干细胞：把装有骨髓间充质干细胞的培养瓶放置于超净工作台上，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，加入适量含10%胎牛血清、双抗的L-DMEM培养液，用吸管吹打使骨髓间充质干细胞悬浮；将细胞进行离心2次，然后加入含10%胎牛血清、双抗的L-DMEM培养液适当稀释后，分别分装入培养瓶中，放置于37℃，5%CO2培养箱中进行培养，第二天更换一次培养液后继续培养。

2.5.2细胞换液用吸管小心吸出培养瓶中的旧培养液，加入新鲜的含10%胎牛血清、双抗的L-DMEM培养液，在倒置显微镜下观察细胞呈短梭型，单个存在，光亮性好，贴壁状，呈汇合生长，说明骨髓间充质干细胞生长状况良好。

2.5.3细胞传代：待骨髓间充质细胞生长达80%-90%融合时进行细胞传代，按照1:3-1:5的比例进行传代，首先用吸管吸掉培养瓶中旧的培养液，向培养瓶中加入2-3ml0.25%胰蛋白酶进行消化，使胰蛋白酶铺满所有细胞表面；2-3min后将培养瓶放于倒置显微镜下观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后立即加入培养液中和胰蛋白酶终止消化，随后用吸管吸去培养瓶内液体，加入含10%胎牛血清、双抗的L-DMEM培养液，随后用吸管吸取瓶内培养液反复吹打瓶壁细胞，使之形成细胞悬液，然后将细胞悬液吸到离心管中进行离心，弃掉上清，再加入DMEM培养液，用吸管吹打细胞使之成为细胞悬液，分别接种在新的培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

2.5.4加入含药血清：继续培养骨髓间充质干细胞，对细胞进行换液、传代，定期在倒置显微镜下观察细胞的生长形态，连续培养传代至第三代时，将骨髓充质干细胞分为4组，分别为益气补肾活血方组、补肾活血方组、空白对照组和钙尔奇组。每组细胞分别加入相应浓度含药血清的DMEM细胞培养液，继续进行培养。

2.6四唑盐法检测细胞增殖情况

2.6.1将各实验组细胞接种在96孔细胞培养板上培养：首先用吸管吸取在对数生长期的骨髓充质干细胞，用含10%胎牛血清、双抗的含药血清L-DMEM细胞培养液调整细胞浓度至2×10⁵/ml，然后用微量加样器将各实验组细胞按照每孔200μl的量分别接种于96孔细胞培养板中，每组30个复孔，以备下面不同时间段检测细胞存活率使用，分别标记，将各实验组96孔细胞培养板分别置于37℃,5%CO2培养箱中继续培养。

2.6.2MTT法检测细胞：继续培养骨髓间充质干细胞，我们在每个时间段把每组细胞分别各设6个复孔，分别在培养第24,48,72,96,120小时后在每孔中加入MTT溶液（5mg/ml)20μl，然后继续培养4h，以1000r/min转速离心3min，吸弃96孔细胞培养板内培养上清液，终止培养。然后每孔加入150μlDMSO，将其置于摇床上37℃温度下振荡10min，使结晶物充分融解。然后在酶标仪490nm处测定各孔的光吸收值(OD)，检测各实验组的骨髓间充质干细胞存活率，研究各实验组骨髓充质干细胞增殖情况。

公式为：细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%

2.7麦胚凝集沉淀法检测骨特异性碱性磷酸酶（BALP）：收集经含药血清处理后的各实验组细胞，以800r/min的速度离心15min，收集细胞沉淀，用麦胚凝集沉淀法检测各实验组BALP的活性，用来观察骨髓间充质干细胞分化情况。

3实验结果

3.1骨髓间充质干细胞增殖的结果：我们运用四唑盐法（MTT法）检测了各实验组骨髓间充质干细胞的存活率来研究各实验组细胞的增殖情况。结果见表4-1至4-5。

表4-1益气补肾活血方组骨髓充质干细胞的存活率

表4-2补肾活血方组骨髓充质干细胞的存活率

表4-3空白对照组骨髓充质干细胞的存活率

表4-4钙尔奇组骨髓充质干细胞的存活率

表4-5各实验组骨髓间充质干细胞的存活率

注：与空白对照组比较，※P﹤0.05；与益气补肾活血方组比较，＃P﹤0.05

我们采用四唑盐（MTT法）检测大鼠骨髓间充质干细胞的存活率，发现当培养至24h时，益气补肾活血方组、补肾活血方组、空白对照组和钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率分别为0.6836、0.5983、0.9514、0.7615。和空白对照组相比较，益气补肾活血方组、补肾活血方组和钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率有显著性降低（P﹤0.05）。和益气补肾活血方组相比较，补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率有显著性降低（P﹤0.05）。空白对照组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率和钙尔奇组大鼠相比无显著性差异。益气补肾活血方组和钙尔奇组大鼠益气补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率和钙尔奇组相比有显著性降低（P﹤0.05）。

当培养大鼠骨髓间充质干细胞至48h时，益气补肾活血方组、补肾活血方组、空白对照组和钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率分别为0.7072、0.5962、0.9473、0.8550。和空白对照组相比，益气补肾活血方组、补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率有显著性降低（P﹤0.05），钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞无显著性差异。和益气补肾活血方组相比较，补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率有显著性降低（P﹤0.05），钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率有显著性增加（P﹤0.05），补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率和钙尔奇组相比较有显著性降低（P﹤0.05）。

当培养大鼠骨髓间充质干细胞至72h时，益气补肾活血方组、补肾活血方组、空白对照组和钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率分别为0.7185、0.6007、0.9374、0.8146。和空白对照组相比，益气补肾活血方组和补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率有显著性降低（P﹤0.05），钙尔奇组稍有下降，但无显著性差异。和益气补肾活血方组相比较，钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率有显著性增加（P﹤0.05），补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率稍有降低，但无显著性差异。补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率和钙尔奇组相比有显著性降低（P﹤0.05）。

当培养大鼠骨髓间充质干细胞至96h时，益气补肾活血方组、补肾活血方组、空白对照组和钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率分别为0.6768、0.5905、0.9348、0.7958。和空白对照组相比较，益气补肾活血方组和补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率有显著性降低（P﹤0.05），钙尔奇组稍有降低，但无显著性差异。和益气补肾活血方组相比较，钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率有显著性增加（P﹤0.05），补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率稍有降低，但无显著性差异。补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率和钙尔奇组相比有显著性降低（P﹤0.05）。

当培养大鼠骨髓间充质干细胞至120h时，益气补肾活血方组、补肾活血方组、空白对照组和钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率分别为0.6997、0.5944、0.9370、0.7637。和空白对照组相比较，益气补肾活血方组和补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率有显著性降低（P﹤0.05）。和益气补肾活血方组相比较，补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率稍有降低，但无显著性差异，钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率稍有增加，但亦无显著性差异。补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞的存活率和钙尔奇组相比有显著性降低（P﹤0.05）。

3.2骨髓间充质干细胞分化情况

骨髓间充质干细胞骨源性碱性磷酸酶（BALP）的活性检测：我们采用麦胚凝集法检测各实验组大鼠骨髓间充质干细胞BALP的活性，结果见表4-6。

表4-6中药益气补肾活血方对大鼠骨髓间充质干细胞BALP的影响

注：与空白对照组比较，※P﹤0.05；与益气补肾活血方组比较，＃P﹤0.05

实验结果发现，当我们培养大鼠骨髓间充质干细胞至1周时，益气补肾活血方、补肾活血方、空白对照组和钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞骨源性磷酸酶（BALP）的活性分别为7.75、5.68、1.53、8.78U/L。和空白对照组相比较，益气补肾活血方组、补肾活血方组和钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞BALP的活性有显著性增加（P﹤0.05）。和益气补肾活血方组相比较，补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞BALP的活性有显著性降低（P﹤0.05），钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞BALP的活性有显著性增加（P﹤0.05）。补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞BALP的活性和钙尔奇组相比较有显著性降低（P﹤0.05）。

当我们培养大鼠骨髓间充质干细胞至2周时，益气补肾活血方、补肾活血方、空白对照组和钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞BALP的活性分别为12.34、8.67、1.91、14.31U/L。和空白对照组相比较，益气补肾活血方组、补肾活血方组和钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞BALP的活性有显著性增加（P﹤0.05）。和益气补肾活血方组相比较，补肾活血方组大鼠活性有显著性降低（P﹤0.05），钙尔奇组的活性有显著性增加（P﹤0.05）。补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞骨源性磷酸酶的活性和钙尔奇组相比有显著性降低（P﹤0.05）。

当我们培养大鼠骨髓间充质干细胞至3周时，益气补肾活血方、补肾活血方、空白对照组和钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞骨源性磷酸酶（BALP）的活性分别为13.78、10.73、2.57、12.57U/L。和空白对照组相比较，益气补肾活血方组、补肾活血方组和钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞骨源性磷酸酶的活性有显著性增加（P﹤0.05）。和益气补肾活血方组相比较，补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞BALP的活性有显著性降低（P﹤0.05），钙尔奇组无显著性差异。补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞BALP的活性和钙尔奇组相比较有显著性降低（P﹤0.05）。

当我们培养大鼠骨髓间充质干细胞至4周时，益气补肾活血方、补肾活血方、空白对照组和钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞BALP的活性分别为11.65、9.68、3.67、10.68U/L。和空白对照组相比较，益气补肾活血方组、补肾活血方组和钙尔奇组大鼠骨髓间充质干细胞BALP的活性有显著性增加（P﹤0.05）。和益气补肾活血方组相比较，补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞BALP的活性有显著性降低（P﹤0.05），钙尔奇组无显著性差异。补肾活血方组大鼠骨髓间充质干细胞BALP的活性和钙尔奇组相比亦无显著性差异。

结论：实验结果显示，益气补肾活血方可明显促进骨髓间充质干细胞增殖，有效增加BALP的活性，通过显微镜下观察可发现交过骨髓间充质干细胞转化为了成骨细胞，一定程度上说明了益气补肾活血方可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化，影响骨代谢，增加骨形成，有助于治疗废用性骨质疏松。为中医药治疗废用性骨质疏松的发展提供了有力的理论依据。

Claims (4)

1.一种预防和治疗废用性骨质疏松的药物，其特征在于，所述药物由以下重量份数的原料药制成：

熟地22－25份，续断14－17份，桑寄生12－16份，当归11－13份，桃仁8－10份，红花10－13份，牛膝28－33份，骨碎补10－13份，甘草5－7份，黄芪50－70份，太子参10－20份。

2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，各原料药的重量份数为：

黄芪55－65份，太子参13－16份，熟地22－25份，续断14－17份，桑寄生12－16份，当归11－13份，桃仁8－10份，红花10－13份，牛膝28－33份，骨碎补10－13份，甘草5－7份。

3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，各原料药的重量份数为：

黄芪60份，太子参15份，熟地24份，续断15份，桑寄生15份，当归12份，桃仁9份，红花12份，牛膝30份，骨碎补12份，甘草6份。

4.权利要求1－3任一项所述的药物的制备方法，其特征在于，步骤是：称取配方量的原料药加药材体积5倍水，浸泡2h，第一次煎煮45min，倒出水煎液，加适量水，再次煎煮40min，合并两次水煎液，浓缩成一定浓度，剂量为480mg生药/ml，即得。