CN103919729B - 一种壳聚糖和聚乙二醇联合修饰的蟛蜞菊内酯纳米脂质体及制备方法 - Google Patents

Abstract

一种壳聚糖和聚乙二醇联合修饰的蟛蜞菊内酯纳米脂质体，其包括长循环脂质体和包裹于其中的药物活性成分，该长循环脂质体为脂质体表面被壳聚糖和聚乙二醇联合修饰的脂质体，该活性成分为蟛蜞菊内酯，将蟛蜞菊内酯包封于脂质体双层膜之间。该纳米脂质体的制备方法主要是：将蟛蜞菊内酯、大豆卵磷脂和胆固醇溶解于无水乙醇中，恒温磁力搅拌得到均一的油相，再将聚乙二醇-2000和壳聚糖加入到水化介质磷酸缓冲液中恒温磁力搅拌得到水相；将上述油相逐滴滴入水相中，得脂质悬液；去除无水乙醇，采用细胞超声粉碎机冰浴下将其间隔性超声。本发明可在常温常压及温和的条件下完成，工艺简单，反应易于控制，得到的脂质体具理想的形貌，提高其生物利用率。

Description

一种壳聚糖和聚乙二醇联合修饰的蟛蜞菊内酯纳米脂质体及制备方法

技术领域

本发明涉及一种药物的脂质体及制备方法。

背景技术

蟛蜞菊内酯（wedelolactone，WL），分子式C16H10O7，分子量314.25，属于呋喃香豆素类，在植物中分布较局限，大都从金盏蟛蜞菊和墨旱莲中提取分离而得，它可以抗大鼠的四氯化碳、氨基半乳糖和毒伞素诱导肝毒，并能刺激肝细胞再生。在MorsWB和合作伙伴MeloPA的研究中发现，蟛蜞菊内酯具备抗蛇毒的作用。此外，它的免疫调节，消炎，选择性的酶抑制等作用为人类的新药研发提供了更多的选择。

研究发现，蟛蜞菊内酯对拓扑异构酶IIα的抑制作用，能够阻碍DNA的合成，从而实现对肿瘤生长的抑制并诱导肿瘤细胞凋亡。近期，中科院上海药物研究所俞强课题组在美国《生物化学杂志》（J.Biol.Chem.）上发表的最新科研成果表明，蟛蜞菊内酯具有显著增强干扰素-γ（IFN-γ）信号，并且提高其抗肿瘤活性的作用。报道称，干扰素-γ作为一种具有多种生物学功能的细胞因子，不仅在控制人类微生物感染方面起着重要作用，还具有良好的抗肿瘤活性。蟛蜞菊内酯在不影响干扰素-γ和其受体的结合的情况下，通过延长STAT1（信号转导与转录激活因子）的酪氨酸磷酸化以增强干扰素-γ信号。基于以上列举的科研成果，我们认为蟛蜞菊内酯将成为一种优异的抗肿瘤候选化合物。蟛蜞菊内酯无明显细胞毒作用，因此具有较好的开发前景。

然而，蟛蜞菊内酯在水中极低的溶解度，不利于人体对该药物的吸收，生物利用率低，致使其用药量大，用药次数频繁，限制了其药理作用的充分发挥。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能增加蟛蜞菊内酯在水中溶解度的壳聚糖和聚乙二醇联合修饰的蟛蜞菊内酯纳米脂质体及制备方法。本发明的方法主要是以大豆卵磷脂和胆固醇为膜材，采用改进的乙醇注入法结合超声法制备蟛蜞菊内酯纳米脂质体，该载药脂质体包括长循环脂质体和包裹于其中的药物活性成分，所述长循环脂质体为脂质体表面被壳聚糖和聚乙二醇联合修饰的脂质体，所述活性成分为蟛蜞菊内酯，将蟛蜞菊内酯包封于脂质体双层膜之间。

本发明的制备方法具体如下：

1、原料：蟛蜞菊内酯（WL），大豆卵磷脂（SPC），胆固醇(Chol)，壳聚糖（CS），聚乙二醇-2000（PEG-2000）。

2、制备方法：

（1）将蟛蜞菊内酯、大豆卵磷脂和胆固醇以1:50～80:2～10的质量比，最好以1:65:6的质量比，溶解于无水乙醇中，并且1mg蟛蜞菊内酯溶解于2～5ml无水乙醇中，在38～48℃恒温磁力搅拌得到均一的油相，即脂质乙醇溶液；

（2）将与蟛蜞菊内酯质量比均为1：1～10，最好为1:2，的聚乙二醇-2000和壳聚糖加入到38～48℃的水化介质磷酸缓冲液（0.1M，pH6.5）中，其中壳聚糖用0.1～0.5%的乙酸溶液溶解，PH值控制在4左右，于38～48℃水化温度，最好38℃，恒温磁力搅拌得到水相；

（3）将步骤（1）获得的脂质乙醇溶液逐滴滴入步骤（2）获得的水相中，得脂质体悬液；

（4）将上述脂质体悬液中的无水乙醇去除，旋蒸去除或是搅拌足够的时间去除，（5）采用细胞超声粉碎机冰浴下将其间隔性超声，超声功率500～600w，超声时间2～5s，间隔时间2～5s，总时间9～15min，得到小单层蟛蜞菊内酯脂质体；

（6）将得到的小单层蟛蜞菊内酯脂质体置于4℃保存。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、本发明的纳米脂质体具理想的形貌，包封率可达90%以上，粒径分布在50-150nm，不仅具有一般纳米药物所具有的多种优点，如比小尺寸效应，比表面积大，吸收效率高，稳定性好等优点，更重要的是一方面极大地提高药物的溶解度和稳定性，改善蟛蜞菊内酯的给药方式，提高其生物利用率，降低用药量，提高治疗效果；另一方面可发挥其缓释作用。

2、本发明在常温、常压及温和条件下完成，制备方法操作简单，反应易控制，重复性高，产率高。

附图说明

图1是本发明例1所得蟛蜞菊内酯纳米脂质体透射电子显微镜TEM图。

图2是本发明例2所得蟛蜞菊内酯纳米脂质体透射电子显微镜TEM图。

图3是本发明例3所得蟛蜞菊内酯纳米脂质体透射电子显微镜TEM图。

图4是本发明蟛蜞菊内酯最大吸收峰位置测定图。

图5是本发明测定前绘制的蟛蜞菊内酯标准曲线图。

图6是本发明壳聚糖和聚乙二醇联合修饰的蟛蜞菊内酯纳米脂质体与蟛蜞菊内酯对肿瘤细胞的杀伤效果对比图。

具体实施方式

例1

取1毫克蟛蜞菊内酯（购自上海展舒化学科技有限公司）、50毫克大豆卵磷脂(购自沈阳天峰生物制药有限公司)和10毫克胆固醇(购自天津市大茂化学仪器供应站)溶解于2毫升的无水乙醇中，43℃恒温温度磁力搅拌得到均一的油相，即脂质乙醇溶液。取10毫克聚乙二醇-2000（购自天津科密欧化学试剂有限公司产品）和10毫克壳聚糖，该壳聚糖用0.1%的乙酸溶液溶解，PH值控制在4，将上述聚乙二醇-2000和壳聚糖乙酸溶液加入到48℃的水化介质磷酸缓冲液（0.1M，pH6.5）中，48℃恒温磁力搅拌得到水相。将上面获得的脂质乙醇溶液逐滴滴入获得的水相中，得脂质体悬液。将上述脂质体悬液中的无水乙醇旋蒸去除，采用细胞超声粉碎机冰浴下将其间隔性超声，超声功率500W，超声5s，间隔5s，共9min，得到小单层蟛蜞菊内酯纳米脂质体，将得到的小单层蟛蜞菊内酯纳米脂质体置于4℃保存。

例2

取1毫克蟛蜞菊内酯（购自上海展舒化学科技有限公司）、65毫克大豆卵磷脂(购自沈阳天峰生物制药有限公司)和6毫克胆固醇(购自天津市大茂化学仪器供应站)溶解于2毫升的无水乙醇中，38℃恒温温度磁力搅拌得到均一的油相，即脂质乙醇溶液。取2毫克聚乙二醇-2000（购自天津科密欧化学试剂有限公司产品）和2毫克壳聚糖，该壳聚糖用0.1%的乙酸溶液溶解，PH值控制在4，将上述聚乙二醇-2000和壳聚糖乙酸溶液加入到38℃的水化介质磷酸缓冲液（0.1M，pH6.5）中，38℃恒温磁力搅拌得到水相。将上面获得的脂质乙醇溶液逐滴滴入获得的水相中，得脂质体悬液。将上述脂质体悬液中的无水乙醇旋蒸去除，采用细胞超声粉碎机冰浴下将其间隔性超声，超声功率600W，超声5s，间隔5s，共10min，得到小单层蟛蜞菊内酯纳米脂质体，将得到的小单层蟛蜞菊内酯纳米脂质体置于4℃保存。

例3

取1毫克蟛蜞菊内酯（购自上海展舒化学科技有限公司）、80毫克大豆卵磷脂(购自沈阳天峰生物制药有限公司)和2毫克胆固醇(购自天津市大茂化学仪器供应站)溶解于5毫升的无水乙醇中，48℃恒温温度磁力搅拌得到均一的油相，即脂质乙醇溶液。取10毫克聚乙二醇-2000（购自天津科密欧化学试剂有限公司产品）和10毫克壳聚糖，该壳聚糖用0.5%的乙酸溶液溶解，PH值控制在4，将上述聚乙二醇-2000和壳聚糖乙酸溶液加入到43℃的水化介质磷酸缓冲液（0.1M，pH6.5）中，43℃恒温磁力搅拌得到水相。将上面获得的脂质乙醇溶液逐滴滴入获得的水相中，得脂质体悬液。将上述脂质体悬液中的无水乙醇旋蒸去除，采用细胞超声粉碎机冰浴下将其间隔性超声，超声功率500W，超声3s，间隔3s，共15min，得到小单层蟛蜞菊内酯纳米脂质体，将得到的小单层蟛蜞菊内酯纳米脂质体置于4℃保存。

为证明制备产物为蟛蜞菊内酯纳米脂质体，对其进行透射电子显微镜（TEM表征，采用高效液相色谱仪测定蟛蜞菊内酯的包封率，操作如下：

室温下取上面获得的蟛蜞菊内酯纳米脂质体分散液用适量去离子水稀释，取1-2滴纳米脂质体分散液置于300目的铜网上，用2%的磷钨酸溶液染色，室温晾干，于透射电子显微镜（TEM）下观察纳米脂质体的形态，如图1、图2和图3所示。由电镜照片可知,表面修饰的蟛蜞菊内酯长循环纳米脂质体微球分散性好，粒度分布窄，轮廓清晰，形态规整。

壳聚糖和聚乙二醇联合修饰的蟛蜞菊内酯纳米脂质体包封率的测定：测定包封率之前首先需采用紫外可视光谱仪测定蟛蜞菊内酯最大吸收峰位置，测定结果如图4所示,然后采用葡聚糖凝胶法将脂质体悬液中游离的蟛蜞菊内酯、壳聚糖、聚乙二醇分离出来，上样量为1mL，洗脱速度为1.0mL/min，最大吸收峰设定为350nm，当蛋白纯化系统显示出峰时进行收集，然后精密地吸取该液体1mL置于5mL容量瓶，用色谱纯甲醇溶解并定容，高效液相色谱法（HPLC）测定其峰面积，计算包封率。高效液相色谱条件为：色谱柱，AngilentZORBA×300SB-C18(250×4.6mm,5μm)；流动相为甲醇:0.5%的醋酸溶液(55:45,V/V)；流速选为1.0mL/min；柱温为30℃；采用紫外检测器，检测波长350nm；进样量为20μL。绘制蟛蜞菊内酯的标准曲线，如图5所示，测定各样品包封率，最终结果为：例1样品包封率为58.4%，例2样品包封率为92.2%，例3样品包封率为69.8%。

采用例2所得蟛蜞菊内酯纳米脂质体进行药效学试验，观察其对肿瘤细胞的杀伤效果，图6即为细胞实验所得结果，结果表明蟛蜞菊内酯脂质体对肿瘤细胞的抑制率可达80%，明显优于单纯采用蟛蜞菊内酯的抑制效果。

Claims (1)

1.一种壳聚糖和聚乙二醇联合修饰的蟛蜞菊内酯纳米脂质体，其特征在于：它是采用下述方法获得的产物：

(1)将蟛蜞菊内酯、大豆卵磷脂和胆固醇以1:65:6的质量比溶解于无水乙醇中，并且1mg蟛蜞菊内酯溶解于2ml无水乙醇中，在38℃恒温磁力搅拌得到均一的油相，即脂质乙醇溶液；

(2)将与蟛蜞菊内酯质量比均为1：2的聚乙二醇-2000和壳聚糖加入到38℃的水化介质磷酸缓冲液0.1M，pH6.5中，其中壳聚糖用0.1％的乙酸溶液溶解，pH值控制在4，于38℃恒温磁力搅拌得到水相；

(3)将步骤(1)获得的脂质乙醇溶液逐滴滴入步骤(2)获得的水相中，得脂质悬液；

(4)将上述脂质悬液中的无水乙醇去除；

(5)采用细胞超声粉碎机冰浴下将其间隔性超声，超声功率600w，超声时间5s，间隔时间5s，总时间10min，得到小单层蟛蜞菊内酯脂质体；

(6)将得到小单层脂质体置于4℃保存。