CN103933580B - 靶向小胶质细胞的tlr4复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向小胶质细胞的TLR4复合物及其制备方法和在制药领域中的应用,属于生物医药领域。该复合物由Q9肽(QQQKKKKKK)和T9肽(LTQQVVMKF)的融合肽与TLR4 RNAi通过静电作用结合而成,该复合物可利用Q9肽的导向作用,特异靶向小胶质细胞表面特异性CX3CR1受体,在T9肽与CX3CR1受体作用的同时,TLR4 RNAi高效转染入小胶质细胞,抑制小胶质细胞的活化,进而抑制由小胶质细胞介导的脑出血后的炎症反应,可用于制备治疗由小胶质细胞介导的抗炎药物,在脑出血的治疗领域有着良好的开发应用前景。

Description

靶向小胶质细胞的TLR4复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种多肽-基因复合物,具体涉及一种靶向小胶质细胞的TLR4复合物及其制备方法和在制药领域中的应用。
背景技术
脑出血是一种常见的神经系统危重症,因其高发病率,高致残率,高死亡率而受到广泛关注。随着人民生活水平的提高及老龄化的到来,脑出血发病率也呈上升趋势。大量研究表明,脑出血后存在明显的炎症反应,炎症反应参与了脑出血后继发性脑水肿和脑损害等病理过程。ICH 后血肿周围小胶质细胞等炎性细胞激活,释放TNF-α、IL-1 等致炎因子,加之血脑屏障破坏,外周血单核巨噬细胞等炎症细胞向血肿周边区聚集,由此诱发炎症级联放大反应,最终导致继发性脑损伤和神经功能缺损加剧。
Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一类介导天然免疫的古老受体,通过识别外源性配体(PAMPs,如细菌、真菌、病毒等)和内源性配体(DMAPs,机体损伤相关分子),并通过下游的接头信号分子MyD88或TRIF活化,导致NF-κB的激活,产生大量的炎症因子,在天然免疫中具有重要作用。大量研究发现脑出血后由血肿成分血红蛋白(Hb)及代谢产物血红素(Heme)通过作用于小胶质细胞TLR4受体,继之通过下游信号分子MyD88或TRIF活化,导致NF-κB的激活,产生大量诸如IL-1、TNF-α、IL-6的炎症因子,产生炎症损伤,最终导致ICH继发性神经功能缺损加重。因此,如果能发现通过TLR4靶向抑制小胶质细胞的药物,将会为脑出血的炎症损伤带来新的治疗策略。
CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)在中枢神经系统中主要在小胶质细胞上表达,其特异性配体CX3CL1属于CX3C家族的δ类趋化因子,主要由神经元分泌。CX3CL1通过CX3CR1受体可促进小胶质细胞的趋化、增殖、存活,细胞内钙水平的升高以及细胞因子和金属蛋白酶的分泌,这些反应能被抗CX3CR1抗体阻止。因此,如果能够有效干扰CX3CR1受体的表达,则理论上可以抑制小胶质细胞的活化,进而抑制由小胶质细胞介导的神经系统疾病的发生或恶化。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是大多数真核生物体内一种调控基因表达的方式,主要通过小干扰RNA(Small interfering RNA, siRNA)特异性地沉默靶基因的表达,具有高效性、特异性等优点,已被广泛应用于基因功能、细胞信号转导通路、药物靶点筛选、基因治疗等研究领域。因此,可以利用RNAi技术干扰CX3CR1受体的表达。但RNAi技术也面临一个关键问题,就是如何将siRNA有效地传递进入靶细胞。由于siRNA容易被核酸酶降解且真核细胞不易摄取外源性的裸露核酸,直接用siRNA转染细胞效率低下,因此,必须选择适当的载体包裹siRNA,以免siRNA降解并且能够辅助siRNA转染细胞。
US28是人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)编码的四个七次跨膜趋化因子受体之一,具有广谱趋化因子结合活性,在结构上与人源CX3CR1受体的同源性最高。研究发现,来源于US28受体N末端的诱惑配体多肽T9可以阻断人源CX3CR1受体结合生理性趋化因子形成的趋化作用,但其本身不引起趋化运动,不影响胞内信号转导和细胞自然活性;其能够引起细胞表面受体CX3CR1内化,但内化的受体部分能够再循环到细胞表面,对人源CX3CR1受体的生理功能没有明显影响。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供一种TLR4复合物,该复合物可以特异靶向小胶质细胞,抑制小胶质细胞的活化,进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的发生或恶化。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
靶向小胶质细胞的TLR4复合物,由Q9肽和T9肽的融合肽与TLR4通过静电作用结合而成,所述Q9肽的氨基酸序列为QQQKKKKKK,所述T9肽的氨基酸序列为LTQQVVMKF。
进一步,所述Q9肽和T9肽的融合肽由Q9肽的羧基端和T9肽的氨基端直接连接而成。
本发明的另一个目的在于提供所述靶向小胶质细胞的TLR4复合物的制备方法,是在涡旋条件下,向含有TLR4 RNAi和氯化钠的水溶液中滴加Q9肽和T9肽的融合肽溶液,滴毕,继续涡旋30~60分钟,再静置30~60分钟,即得靶向小胶质细胞的TLR4复合物。
进一步,所述TLR4 RNAi与Q9肽和T9肽的融合肽的质量比为1:1。
进一步,所述靶向小胶质细胞的TLR4复合物的制备方法是在涡旋条件下,向含有浓度为200μg/mL的TLR4 RNAi和浓度为1mg/mL的氯化钠的水溶液中,滴加等体积浓度为200μg/mL的Q9肽和T9肽的融合肽溶液,滴加完毕后,继续涡旋30分钟,再静置30分钟,即得靶向小胶质细胞的TLR4复合物。
本发明还提供了所述靶向小胶质细胞的TLR4复合物在制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的药物中的应用。
进一步,所述靶向小胶质细胞的TLR4复合物在制备治疗脑出血的药物中的应用。
本发明的有益效果在于:Q9肽为带正电荷的短肽,可通过电性中和作用与带负电荷的TLR4 RNAi聚合形成致密颗粒,提高细胞对TLR4 RNAi的摄取率,增强转染效率。CX3CR1受体在中枢神经系统中主要在小胶质细胞上表达,来源于US28受体N末端的诱惑配体多肽T9可以阻断人源CX3CR1受体结合生理性趋化因子形成的趋化作用,但其本身不引起趋化运动,不影响胞内信号转导和细胞自然活性。本发明所述TLR4复合物可通过T9肽的导向作用,特异靶向小胶质细胞表面特异性CX3CR1受体,在T9肽与CX3CR1受体作用的同时,TLR4 RNAi高效转染入小胶质细胞,抑制小胶质细胞的活化,进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经系统炎症的发生或恶化,可用于制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经系统炎症的药物,在脑出血治疗领域有着良好的开发应用前景。
附图说明
图1为透射电镜鉴定TLR4复合物。
图2为TLR4复合物转染的小胶质细胞活化后细胞因子的分泌水平。
图 3为TLR4复合物转染的小胶质细胞的迁移能力。
图 4为TLR4复合物转染的脑出血小鼠脑组织含水量。
图 5为TLR4复合物转染的脑出血小鼠的神经功能学评分。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如分子克隆实验指南(第三版,J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译,科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
一、靶向小胶质细胞的TLR4复合物的制备
1、Q9肽和T9肽的融合肽Q9-T9的制备
融合肽Q9-T9由Q9肽的羧基端与T9肽的氨基端直接连接而成,氨基酸序列为QQQKKKKKK LTQQVVMKF。融合肽Q9-T9的合成在AB-431A型多肽合成仪上进行,采用标准Fmoc方案。以0.25mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂为起始树脂,按照融合肽Q9-T9的氨基酸序列,使肽链自羧基端向氨基端逐个延伸,肽链合成完毕后,将含有肽链的树脂转移至切割液(由酒石酸乙二胺0.25mL、三氟乙酸9.5mL和去离子水0.25mL组成)中,室温下搅拌反应使肽链从树脂上裂解下来,然后用G6玻砂漏斗过滤,收集滤液,室温下低压蒸干,残余物用去离子水溶解后,用AeKTA explorer 100型中压液相色谱仪进行纯化,色谱柱为C18柱,流动相A为质量分数为0.1%的三氟乙酸水溶液,流动相B为质量分数为0.1%的三氟乙酸乙腈溶液,二元线性梯度洗脱,流动相B的体积分数在0~15分钟内由10%上升至50%,流速为1mL/min,收集融合肽Q9-T9的洗脱液,冷冻干燥,即得融合肽Q9-T9,用去离子水溶解制成浓度为3mg/mL的溶液,用孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤除菌,-70℃冻存备用。
取融合肽Q9-T9的洗脱液,用Delta 600型反相高压液相色谱仪进行纯度鉴定,色谱柱为Symmetry C18柱,流动相A为质量分数为0.1%的三氟乙酸水溶液,流动相B为质量分数为0.1%的三氟乙酸乙腈溶液,二元线性梯度洗脱,流动相B的体积分数在0~15分钟内由10%上升至60%,流速为1mL/min。结果经峰面积归一化法计算,融合肽Q9-T9的纯度为98%。另取融合肽Q9-T9的洗脱液,用API 2000 LC/MS/MS型质谱仪进行分子量鉴定,结果显示,融合肽Q9-T9的分子量实测值与理论值相符。
2、TLR4复合物的制备
TLR4RNAi的核苷酸序列为:5’-ACGUGCACUUGUGGGUCCA-3’。于室温、涡旋条件下,向100μL含有浓度为500μg/mL的TLR4和浓度为1mg/mL的NaCl的水溶液中,滴加100μL浓度为500μg/mL的融合肽Q9-T9溶液,滴加速度为5μL/min,滴加完毕后,于室温下继续涡旋30分钟,再静置30分钟,即得TLR4复合物。
将新鲜制备的TLR4复合物滴于200目铜网上,吸附3分钟,用吸水纸吸干,晾干30秒,以质量分数为1%的醋酸铀水溶液负染30秒,用吸水纸吸干,晾干30秒,80kV透射电镜观察。结果如图1所示,所得TLR4复合物呈大小均一的近圆形颗粒,绝大多数颗粒长径小于25nm。
同时,按照上述相同方法,以阴性对照OVA RNAi(5’-ACUUGUGGACGUGCGUCCA-3’)替代TLR4RNAi,制得阴性对照复合物。
二、靶向小胶质细胞的TLR4复合物的活性测试
1、TLR4复合物转染小胶质细胞
将小胶质细胞BV-2于6孔板内单层培养至覆盖面积约30%,换入无血清DMEM培养基2mL,并加入TLR4复合物100μL,培养4小时,再换入完全DMEM培养基2mL,培养48小时,收集细胞,用PBS洗涤并重悬,获得TLR4复合物转染的小胶质细胞。
同时,按照上述相同方法,采用阴性对照复合物,获得阴性对照复合物转染的小胶质细胞。
另外,分别将TLR4复合物和阴性对照复合物转染少突胶质细胞HO,作为无关细胞对照。
2、ELISA检测TLR4复合物转染的小胶质细胞活化后细胞因子的分泌水平
设置空白组(正常小胶质细胞BV-2)、对照组(阴性对照复合物转染的小胶质细胞)和实验组(TLR4复合物转染的小胶质细胞)。取各组细胞,以4×105/孔种植于24孔板中,向细胞培养液中加入红细胞裂解产物至终浓度为10μg/mL,刺激24小时,之后弃去含红细胞裂解产物的细胞培养液并洗涤细胞2次,再加入DMEM培养基1mL,继续培养24小时,吸取细胞培养液,用ELISA试剂盒测定白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。结果如图2所示,TLR4复合物可以明显降低红细胞裂解产物活化的小胶质细胞分泌细胞因子IL-1β和TNF-α的水平。
3、用划痕实验检测TLR4复合物转染的小胶质细胞的迁移能力
设置空白组(正常小胶质细胞BV-2)、对照组(阴性对照复合物转染的小胶质细胞)和实验组(TLR4复合物转染的小胶质细胞)。先用marker笔在6孔板背后,用直尺比着,均匀得划横线,大约每隔0.5-1cm一道,横穿过孔。每孔至少穿过5条线。在空中加入约5X105个细胞,向细胞培养液中加入红细胞裂解产物至终浓度为10μg/mL,刺激24小时,之后弃去含红细胞裂解产物的细胞培养液并洗涤细胞2次,再加入DMEM培养基1mL,具体数量因细胞不同而不同,掌握为过夜能铺满。第二天用枪头比着直尺,尽量垂至于背后的横线划痕,枪头要垂直,不能倾斜。放入37度5%co2培养箱,培养。按24小时取样观察0.4mm2内的细胞个数。结果如图3所示,TLR4复合物可以明显降低红细胞裂解产物活化的小胶质细胞的迁移能力。
4.干湿重法测量TLR4复合物转染的脑出血小鼠脑组织含水量
将各组小鼠于大脑的基底节注射30μL 的全血。1小时候,在血肿周围再次注射5μLTLR4复合物及对照。术后24h快速处死小鼠。取出小鼠大脑,沿正中线对半切开。取出受损处大脑半球,迅速称重,记录。将大脑半球放入100℃烘烤24h至恒重,称重,记录。计算含水量,公式为:大脑组织含水量百分比=(湿重-干重)/湿重×100%。结果如图4所示,TLR4复合物可以明显降低脑出血后的脑水肿。
5、TLR4复合物转染的脑出血小鼠的神经功能学评分
将各组小鼠于大脑的基底节注射30μL 的全血。1小时候,在血肿周围再次注射5μLTLR4复合物及对照。3天后,根据Garcia法对小鼠的神经功能进行评分。具体指标为:1.自主运动 2.四肢活动对称性 3.前肢的对称性 4.爬笼壁 5.推躯干反应 6.触须对刺激反应。在上述指标中,无活动或反应:0分;少许活动:1分;反应较差:2分;正常活动:3分。分别由2人同时对各组进行测定。如图5所示,TLR4复合物可以明提高脑出血后的神经功能。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
<110> 中国人民解放军南京军区福州总医院四七六医院
<120> 靶向小胶质细胞的TLR4复合物及其制备方法和应用
<160> 3
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合肽Q9-T9
<400> 1
Gln Gln Gln Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Thr Gln Gln Val Val Met
1 5 10 15
Lys Phe
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> TLR4RNAi
<400> 2
acgugcacuu gugggucca 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阴性对照
<400> 3
acuuguggac gugcgucca 19

Claims (6)

1.靶向小胶质细胞的TLR4复合物,其特征在于,由Q9肽和T9肽的融合肽与TLR4 RNAi通过静电作用结合而成,所述Q9肽的氨基酸序列为QQQKKKKKK, 所述T9肽的氨基酸序列为LTQQVVMKF;所述 Q9 肽和T9 肽的融合肽由 Q9 肽的羧基端和T9肽的氨基端直接连接而成。
2.权利要求1所述的靶向小胶质细胞的TLR4复合物的制备方法,其特征在于,在涡旋条件下,向含有TLR4 RNAi和氯化钠的水溶液中滴加Q9肽和T9肽的融合肽溶液,滴毕,继续涡旋30~60 分钟,再静置30~60分钟,即得靶向小胶质细胞的 TLR4 复合物。
3.根据权利要求2所述的靶向小胶质细胞的TLR4复合物的制备方法,其特征在于,所述TLR4 RNAi 与 Q9 肽和 T9肽的融合肽的质量比为 1:1。
4.根据权利要求3所述的靶向小胶质细胞的TLR4复合物的制备方法,其特征在于,在涡旋条件下,向含有浓度为100μg/mL的TLR4 RNAi和浓度为1mg/mL的氯化钠的水溶液中,滴加等体积浓度为 200μg/mL 的 Q9 肽和 T9 肽的融合肽溶液,滴加完毕后,继续涡旋 30 分钟,再静置 30 分钟,即得靶向小胶质细胞的 TLR4 复合物。
5.权利要求1所述的靶向小胶质细胞的TLR4复合物在制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的靶向小胶质细胞的TLR4复合物的应用, 其特征在于 : 所述靶向小胶质细胞的 TLR4 复合物在制备治疗脑出血的药物中的应用。
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