CN103918955A - 一种降低发酵食品中生物胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种降低发酵食品中生物胺的方法，该方法是在发酵食品发酵后期加入适量黑曲霉单胺氧化酶，该酶由经诱导的黑曲霉菌丝破碎产生，单胺氧化酶专一分解生物胺为相应的醛和氨，从而达到降低生物胺的目的。

Description

一种降低发酵食品中生物胺的方法
技术领域
本发明涉及食品加工领域，具体涉及一种降低发酵食品中生物胺的方法。 
背景技术
     生物胺是一类具有生物活性含氮的低分子量有机化合物的总称，可以看作是氨分子中1～3个氢原子被烷基或芳基取代后而生成的物质，是脂肪族、酯环族或杂环族的低分子量有机碱，常存在于动植物体内及食品中。微量生物胺是生物体（包括人体）内的正常活性成分，在生物细胞中具有重要的生理功能；但当人体摄入过量的生物胺（尤其是同时摄入多种生物胺）时，会引起诸如头痛、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应，严重的还会危及生命。虽然水果、蔬菜、肉类、牛奶和鱼等非发酵食品本身含有低浓度的生物胺，但食品中生物胺主要还是由氨基酸经脱羧作用形成。食品中常见的生物胺主要包括腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺和组胺等。多数细菌可产生氨基酸脱羧酶，是发酵食品中生物胺形成的主要原因。微生物降解氨基酸有脱氨和脱羧两种，当培养基偏酸时，主要进行脱羧作用，而发酵食品在后发酵阶段由于细菌的产酸，pH往往降到5.0左右，为生物胺的形成提供了环境。 
生物胺对食品的影响是极其复杂的，不同的影响可能造成不同生物胺积累，同时也可能与原料中的游离氨基酸种类有关。目前控制发酵食品中生物胺产生方法有限，主要是进行产胺脱羧酶的微生物进行控制，但发酵食品一般都是在非密闭环境，杂菌控制十分困难，无法保证生产菌种的绝对单一性。 
单胺氧化酶（monoamine oxidase）为催化单胺氧化脱氨反应的酶，也称为含黄素胺氧化酶的，它将生物胺催化氧化成对应的醛、氨和过氧化氢，达到降低生物胺含量的目的。单胺氧化酶多见于脊椎动物的各种器官，特别是分泌腺、脑、肝脏，在无脊椎动物、豆类的芽等植物中也存在。近年来发现某些微生物经诱导培养胞内会累积单胺氧化酶，但因为提取方法较为复杂，而且纯品价格高昂，因此需要选用一种更经济、快捷、方便的方法获得单胺氧化酶。黑曲霉（Aspergillus niger）是公认的食品领域的传统发酵菌株，用于酱类、食醋、白酒的发酵。黑曲霉可代谢产生单胺氧化酶，但该酶为诱导酶，必须给予合适的环境和培养方式才可以诱导其产生单胺氧化酶。如果能诱导黑曲霉菌种大量产生胺氧化酶，并将所产生的单胺氧化酶进行粗提后加入食品的发酵液中，这将大幅度降低发酵食品中的生物胺，同时降低生产成本并提高食品安全性。 
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明创造性地采用微生物方法来降低生物胺，即诱导黑曲霉产生单胺氧化酶，用单胺氧化酶降解生物胺的方法来降低生物胺，从而提供一种降低发酵食品中生物胺的方法。 
为了实现上述的目的，本发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终获得了如下技术方案： 
一种降低发酵食品中生物胺的方法，该方法包括以下步骤：
（1）在无菌条件下，取黑曲霉孢子活化，然后接种在以硝酸盐为唯一氮源的改良查氏培养基中，温度28~30℃，转速150~200r/min，培养24-72h；
（2）培养完成后，将菌种再接种在以4~10个碳原子的伯胺作为唯一氮源的改良查氏培养基中，同时加入0.2-0.5μmol/L的CuSO4·5H2O，温度28~30℃，转速150~200r/min，进行诱导培养12-48h；
（3）培养完成后，过滤，清洗菌丝，进行冷冻超声破碎，将得到的菌丝破碎液过滤离心，上清液经过透析获得酶液菌丝中含有少量诱导剂胺类物质，通过简单的透析，去除胺类物质，最终保证酶液中无胺残留；
（4）在发酵食品的发酵后期，添加步骤（3）所制备的酶液，并添加铜盐，其中酶液添加量为10000-50000U/kg，铜盐的添加量小于15mg/kg，酶反应时间为1~5天。
优选地，如上所述的降低发酵食品中生物胺的方法，其中步骤（1）中所述的硝酸盐选自硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙和硝酸铵的一种或两种以上。 
优选地，如上所述的降低发酵食品中生物胺的方法，其中步骤（1）中透析步骤所用的透析液为pH 7.5且0.1 mol/L磷酸盐缓冲液。 
优选地，如上所述的降低发酵食品中生物胺的方法，其中步骤（1）中所述的4~10个碳原子的伯胺为正丁胺。 
优选地，如上所述的降低发酵食品中生物胺的方法，其中所述的铜盐为硫酸铜或/和葡萄糖酸铜。单胺氧化酶为铜离子依赖的氧化还原酶，二价铜离子是酶的辅基，可稳定酶的构像并使投入的菌丝中的胺氧化酶能稳定快速的分解代谢产物。 
本发明的酶活测定是利用单胺氧化酶氧化生物胺生成过氧化氢，过氧化氢酶与愈创木酚的双反应，生物胺被胺氧化酶降解为相应的醛和过氧化氢及氨气，在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，此产物在470 nm 处有最大光吸收值。酶活定义为每分钟在470nm处吸光度每变化0.01个单位定义为一个单胺氧化酶酶活单位。 
通过实验发现，活化后的黑曲霉在硝酸盐为唯一氮源的合成培养基中培养，虽然没有在天然培养基中生长旺盛，但培养基成分清晰，使黑曲霉适应有机氮源的生长环境。4~10个碳原子的伯胺具有良好的单胺氧化酶诱导性能，本发明选取分子量最小的正丁胺作为最终诱导胺试剂。与现有技术相比，本发明涉及的发酵食品中生物胺的降低方法具有如下明显的有益效果：采用先诱导后提取酶实行方案，诱导黑曲霉中单胺氧化酶的基因的表达，产生大量单胺氧化酶，并破碎菌丝提取出来，最后应用于发酵食品中，使胺氧化酶发挥降解生物胺的作用，将其转换为对应的醛类和氨，降低生物胺的含量，使发酵食品的安全性得到进一步提高。 
  
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。生物胺随着发酵食品中微生物种群变化而变化。本发明实例选取几种发酵食品生产过程中生物胺总量较多的批次进行降生物胺试验，并非表明这些批次生物胺含量代表行业生物胺水平，污染产氨基酸脱羧酶细菌数量少的发酵食品生产车间，产品生物胺总量普遍低于50mg/kg。 
实施例1 
一种酱油发酵中生物胺的降低方法，其步骤如下：
（1）在无菌条件下，取适量黑曲霉孢子，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行活化，将活化得到的黑曲霉菌种接种在以硝酸钠为唯一氮源的改良查氏培养基中，培养基成分为0.2%NaNO3，3%蔗糖，0.1%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.1%酵母抽提物，蒸馏水1000mL。温度28~30℃，转速150r/min，培养48h；
（2）培养完成后，将菌种再接种在以正丁胺为唯一氮源的改良查氏培养基中，培养基成分为0.2%正丁胺，3%蔗糖，1.5%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.1%酵母抽提物，蒸馏水1000mL。再加入0.2μmol/L CuSO4·5H2O进行诱导，转速150r/min，培养24h。
（3）培养完成后，过滤，清洗菌丝，进行冷冻超声破碎。将得到的菌丝破碎液，5000 r/min 离心10min，收集上清液。装入截留量为10kD 的透析袋中，透析液为pH 7.5、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，4℃透析10h，期间换2次透析液。透析结束后将粗酶液冷冻保藏。 
（4）将冷冻保藏的酶液投入酱油制备中，即发酵阶段后期第30天加入酶液（以不添加酶液作为对照），加入量为每公斤酱醪40000U，并添加葡萄糖酸铜4mg/kg，间歇通气搅拌，酶反应时间为5天。酱油发酵结束，通过GC-MS检测，生物胺含量见表1，酪胺、组胺、尸胺等大幅减少，成品中生物胺减少74.0%。 
表1 酱醪中生物胺含量（单位：mg/kg） 
实施例2
一种降低腐乳发酵中生物胺的方法，其步骤如下：
（1）在无菌条件下，取适量黑曲霉孢子，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行活化，将上述得到的黑曲霉菌种接种在以硝酸铵为唯一氮源的改良查氏培养基中，培养基成分为0.2%硝酸铵，3%蔗糖，0.1%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.1%酵母抽提物，蒸馏水1000mL，蒸馏水。温度28~30℃，转速180r/min，培养24h；
（2）培养完成后，将菌种再接种在以正丁胺为唯一氮源的改良查氏培养基中，培养基成分为0.2%正丁胺，3%蔗糖，1.5%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.1%酵母抽提物，蒸馏水1000mL。再加入0.5μmol/L CuSO4·5H2O进行诱导培养，转速180r/min ，12h。
（3）培养完成后，过滤，清洗菌丝，进行冷冻超声破碎。将得到的菌丝破碎液，5000 r/min 离心10min，收集上清液。 装入截留量为10kD 的透析袋中，透析液为pH 7.5、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，4℃透析10h，期间换2次透析液。透析结束后将粗酶液冷冻保藏。 
（4）将冷冻保藏的酶液投入到后发酵第25天腐乳中，加入量为20000U/kg（以不添加酶液作为对照），酶反应时间为2天，并添加葡萄糖酸铜3mg/kg。通过GC-MS检测，生物胺含量见表2，成品中生物胺减少77.3%。 
表2  腐乳发酵中生物胺含量（单位：mg/kg） 
实施例3
一种降低食品中生物胺的方法，其步骤如下：
（1）在无菌条件下，取适量黑曲霉孢子，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行活化，将上述得到的黑曲霉菌种接种在以硝酸钠为唯一氮源的改良查氏培养基中，培养基成分为0.2%NaNO3，3%蔗糖，0.1%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.1%酵母抽提物，蒸馏水1000mL。温度28~30℃，转速200r/min，培养48h。
（2）培养完成后，将菌种再接种在以正丁胺为唯一氮源的改良查氏培养基中，培养基成分为0.2%正丁胺，3%蔗糖，1.5%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.1%酵母抽提物，蒸馏水1000mL。再加入0.3μmol/L CuSO4·5H2O进行诱导培养，转速200r/min，培养48h。 
（3）培养完成后，过滤，清洗菌丝，进行冷冻超声破碎。将得到的菌丝破碎液，5000 r/min 离心10min，收集上清液。 装入截留量为10kD 的透析袋中，透析液为pH 7.5、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，4℃透析10h，期间换2次透析液。透析结束后将粗酶液冷冻保藏。 
（4）将冷冻保藏的酶液投入到豆豉生产中。主要添加于发酵后期第30天，加入量为30000U/kg（以不添加酶液作为对照），酶解时间为4天，并添加适量硫酸铜3mg/kg，通过GC-MS检测，生物胺含量见表3，成品中生物胺减少77.7%。 
表3 豆豉发酵中生物胺含量（单位：mg/kg） 

Claims (5)

1.一种降低发酵食品中生物胺的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）在无菌条件下，取黑曲霉孢子活化，然后接种在以硝酸盐为唯一氮源的改良查氏培养基中，温度28~30℃，转速150~200r/min，培养24-72h；
（2）培养完成后，将菌种再接种在以4~10个碳原子的伯胺作为唯一氮源的改良查氏培养基中，同时加入0.2-0.5μmol/L的CuSO4·5H2O，温度28~30℃，转速150~200r/min，进行诱导培养12-48h；
（3）培养完成后，过滤，清洗菌丝，进行冷冻超声破碎，将得到的菌丝破碎液过滤离心，上清液经过透析获得酶液；
（4）在发酵食品的发酵后期，添加步骤（3）所制备的酶液，并添加铜盐，其中酶液添加量为10000-50000U/kg，铜盐的添加量小于15mg/kg，酶反应时间为1~5天。
2.根据权利要求1所述的降低发酵食品中生物胺的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的硝酸盐选自硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙和硝酸铵的一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的降低发酵食品中生物胺的方法，其特征在于：步骤（1）中透析步骤所用的透析液为pH 7.5且0.1 mol/L磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的降低发酵食品中生物胺的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的4~10个碳原子的伯胺为正丁胺。
5.根据权利要求1所述的降低发酵食品中生物胺的方法，其特征在于：所述的铜盐为硫酸铜或/和葡萄糖酸铜。
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