JPH08228772A

JPH08228772A - モノアミン酸化酵素の抽出方法

Info

Publication number: JPH08228772A
Application number: JP7040461A
Authority: JP
Inventors: Fumio Ukaji; 文緒宇梶; Masato Okada; 昌人岡田
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1995-02-28
Filing date: 1995-02-28
Publication date: 1996-09-10
Anticipated expiration: 2019-11-24
Also published as: JP3593172B2

Abstract

(57)【要約】【構成】モノアミン酸化酵素生産菌またはその凍結保
存菌体を水性媒体に懸濁し、次いで、超音波処理、また
は物理的摩擦により破砕してモノアミン酸化酵素を水性
媒体中に抽出する方法において、破砕時に硫酸銅、硝酸
銅等の二価の銅イオン、または、ビス（アセチルアセト
ナト）銅等の二価の銅錯体を水性媒体中に4μM以上存在
させることを特徴とするモノアミン酸化酵素の抽出方法
である。【効果】本発明の効果は、二価の銅イオンまたは銅錯
体に特有のものであり、その他の金属イオンや一価の銅
イオンには効果が認められない。また従来からの酵素抽
出時の酵素の安定化方法である蛋白質分解酵素阻害剤に
も効果は認められない。本発明によってモノアミン酸化
酵素生産菌、特にモノアミン酸化酵素生産菌の凍結保存
菌体からモノアミン酸化酵素を安定に効率よく抽出する
ことが初めて可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はモノアミン酸化酵素生産
菌からモノアミン酸化酵素を抽出する方法に関するもの
であり、本発明により、酵素生産菌、特に酵素生産菌の
凍結保存菌体から効率よく酵素を抽出することができ
る。

【０００２】

【従来の技術】微生物の産生するモノアミン酸化酵素
は、ベンジルアミン類の高感度定量法、エキソペプチダ
ーゼの高感度活性測定法、塩素イオンの定量法、酢酸イ
オンの定量法等に使用できる有用な酵素である。本酵素
は菌体内酵素であるので、単離する場合には第一段階で
必ず微生物菌体を破砕し、酵素を含むタンパク質を抽出
しなければならない。菌体の破砕は、通常適当な水性媒
体に菌体を懸濁し、機械的摩擦、超音波処理などにより
実施する。

【０００３】従来、微生物の産生するモノアミン酸化酵
素を酵素生産菌から抽出する場合、水性媒体としては緩
衝液、塩化ナトリウム溶液等を使用し、該媒体中で酵素
生産菌を破砕して抽出していた［アグリカルチュアル・
バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Che
m.）、29巻、649頁（1965年）、アグリカルチュアル・
バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Che
m.）、54巻、851頁（1990年）］。しかし、上記方法で
は酵素が失活するため酵素抽出液中に抽出される酵素の
比活性が低いという欠点を有していた。また、菌体を保
存する場合は通常凍結保存をするが、この凍結保存菌体
を同じく上記方法で破砕して酵素を抽出すると比活性の
低下が特に顕著に認められた。

【０００４】一般に酵素抽出の際の酵素の安定化につい
ては、グリセロールや糖などの安定化剤、基質類似物
質、蛋白質分解酵素阻害剤等の水性媒体への添加が有効
であると言われている。しかしながら、グリセロール、
糖の添加は菌体懸濁液の粘性を増加させ破砕時の温度上
昇が激しくなり失活し易くなり、また基質類似物質の添
加も、酵素と安定な複合体を形成し酵素からの分離が困
難となる恐れがあり何れも好ましい方法ではない。蛋白
質分解酵素阻害剤の添加は、一般的にごく少量で効果が
認められる有効な方法であるが、モノアミン酸化酵素の
場合は効果が認められなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】モノアミン酸化酵素の
失活を極力抑え、効率の良いモノアミン酸化酵素の酵素
生産菌、特に酵素生産菌凍結保存菌体からの抽出方法を
目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく鋭意研究した結果、モノアミン酸化酵素生
産菌を二価の銅イオンまたは二価の銅錯体の存在下で破
砕することで、モノアミン酸化酵素の失活を抑え効率よ
くモノアミン酸化酵素を抽出できることを発見し、本発
明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明は、モノアミン酸化酵素生産
菌を水性媒体に懸濁し次いで破砕してモノアミン酸化酵
素を水性媒体中に抽出する方法において、破砕時に二価
の銅イオンまたは二価の銅錯体を水性媒体中に4μM以上
存在させることを特徴とするモノアミン酸化酵素の抽出
方法である。

【０００８】本発明におけるモノアミン酸化酵素とは、
次式に示すアミン化合物を基質とした酸化的脱アミノ化
によるアルデヒド化合物、アンモニア、過酸化水素の生
成反応を触媒する酵素を指す。

【０００９】アミン化合物＋酸素＋Ｈ₂Ｏ → アルデヒ
ド化合物＋アンモニア＋過酸化水素モノアミン酸化酵素
生産菌としては、上記の性質を有する酵素を生産する微
生物であれば特に限定されず本発明の酵素の抽出方法を
適応できる。具体的に例示すると、アグリカルチュアル
・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Che
m.）、29巻、649頁（1965年）記載のアスペルギルス・
ニガー（Aspergillus niger）、特開昭５８−９６９８
公報に記載のタラロマイセス・フラバス・バリエタス・
フラバス・Ｍ４１７５菌（Talaromyces flavus var. fl
avus M4175）、ペトロミセス・アリアセウス・Ｍ４６４
８菌（Petromyces alliaceus M4648）、ネオサルトルヤ
・フイツエリー・Ｍ４６９０菌（Neosartorya fischeri
M4690）、ユーロチウム・チエバリエリ・Ｍ４８０５菌
（Eurotium chevelieri M4805）、ユーベニシリウム・
パルバム・Ｍ５０５１菌（Eupenicillium parvum M505
1）等が挙げられるが、アスペルギルス・ニガー（Asper
gillus niger）に対して本発明は効果的である。特にア
スペルギルス・ニガーの凍結保存菌体に対し、本発明は
最も効果的である。

【００１０】本発明に用いる水性媒体とは、モノアミン
酸化酵素生産菌を懸濁し、そして菌体破砕により酵素を
抽出するために使用されるもので、モノアミン酸化酵素
が安定に存在し得るものであれば特に限定されない。例
えば、水、塩化ナトリウム水溶液、緩衝液等を好適に用
いることができる。また、菌体破砕後に得られる酵素抽
出液の粘性を低下させ、菌体破砕時の温度を低下させる
目的で、モノアミン酸化酵素が失活しない濃度範囲、一
般的には10〜50%容量の範囲で、水溶性有機溶媒を添加
することもできる。該水溶性有機溶媒としてメチルアル
コール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール等
のアルコール類、アセトン等のケトン類、アセトニトリ
ル、ジオキサン等が使用されるが、モノアミン酸化酵素
の安定性という点で、上記の低級アルコール類が好適に
使用される。

【００１１】一般に、緩衝能のない水性媒体中でモノア
ミン酸化酵素生産菌を破砕すると破砕前後で水性媒体の
pHが大幅に変動する。多くの場合pHは菌体破砕により低
下するので、破砕後のpHがモノアミン酸化酵素が安定に
存在し得るpHとなるように水性媒体のpHを設定すること
が好ましい。従って、水性媒体として緩衝液を使用する
とモノアミン酸化酵素の抽出操作を非常に狭いpH範囲内
で行うことが可能となり、操作性、簡便性の点から好ま
しい。緩衝液のpHは、菌体を破砕した後に得られる酵素
抽出液のpHがモノアミン酸化酵素が安定に存在し得るpH
になる限り特に限定されないが、一般的には、pH5〜10
の範囲、特にpH7〜9の範囲が好適である。緩衝液の種類
は抽出されるモノアミン酸化酵素の活性を失わせること
のないものであれば特に限定されず使用できる。例え
ば、リン酸緩衝液、グッド緩衝液等が好適に使用でき
る。緩衝液の濃度は、1〜500mMの濃度で使用されるが、
特に2〜100mMの濃度で好適に使用される。

【００１２】本発明における菌体の破砕法は、特に限定
されず公知の一般的な細胞を破砕する手段が採用でき
る。例えば、超音波処理、機械的摩擦等が挙げられる。
少量の菌体を破砕する場合には超音波処理が適してお
り、大量に破砕する場合には機械的摩擦が適している。
超音波処理としては、超音波発生装置を用いて、9〜20k
Hzの振動をモノアミン酸化酵素生産菌に与えることによ
り菌体を破砕する方法がある。機械的摩擦としてはダイ
ノミル細胞破砕装置を用いてガラスビーズとの摩擦によ
り菌体を破砕する方法がある。

【００１３】本発明に用いる二価の銅イオンは塩の水溶
液の形で供給されるのが一般的である。塩の種類につい
ては水性媒体中で二価の銅イオンを生ずるものであれば
特に限定されず公知の物質が使用できる。例えば、硫酸
銅、硝酸銅、塩化銅、酢酸銅、臭化銅、フッ化銅、ギ酸
銅等があり、特に硫酸銅、硝酸銅、塩化銅等が好適に使
用できる。二価の銅錯体も特に限定されることなく公知
の物質を使用することができる。例えば、ビス（アセチ
ルアセトナト）銅、ビス（ヘキサフルオロアセチルアセ
トナト）銅、ビス（トリフルオロ-2,4-ペンタンジオナ
ト）銅等があり、特にビス（アセチルアセトナト）銅が
好適に使用できる。水性媒体中の二価の銅イオンおよび
二価の銅錯体は4μM未満の場合その効果は認められない
ので、４μＭ以上の濃度で存在することが必須である。
一方、廃液処理の点ではできるだけ低濃度の銅が適して
いるので、4〜50μMの濃度で使用されることが好まし
い。

【００１４】当該二価の銅イオンまたは二価の銅錯体
は、モノアミン酸化酵素生産菌を破砕する際に存在すれ
ば良く、その添加方法は限定されない。予め二価の銅イ
オンまたは銅錯体を含有する水性媒体を調製し該媒体中
にモノアミン酸化酵素生産菌を懸濁しても良いし、水性
媒体にモノアミン酸化酵素生産菌を懸濁した後に添加し
ても良い。

【００１５】本発明の酵素の抽出方法による代表的なモ
ノアミン酸化酵素酵素の抽出は、モノアミン酸化酵素生
産菌を二価の銅イオンまたは二価の銅錯体を含有する水
性媒体に懸濁し、超音波処理または機械的摩擦により菌
体を破砕し、得られた菌体破砕液を遠心分離し、上清を
酵素抽出液として回収することにより実施される。

【００１６】本発明の酵素の抽出方法は、アスペルギル
ス・ニガー菌体を4〜50μMの二価の銅イオンまたは二価
の銅錯体を含有するpH7〜9、10〜100mMの濃度の緩衝液
からなる水性媒体に懸濁し、超音波処理または機械的摩
擦により菌体を破砕することで実施されるのが好まし
い。特に、アスペルギルス・ニガー凍結保存菌体を破砕
し、モノアミン酸化酵素を抽出する場合に最も有効であ
る。

【００１７】

【発明の効果】モノアミン酸化酵素生産菌からモノアミ
ン酸化酵素を抽出する際の本発明における二価の銅イオ
ンまたは二価の銅錯体の効果は、二価の銅特有のもので
あり、その他の金属イオンや一価の銅イオンには効果が
認められない。また従来からの酵素抽出時の酵素の安定
化方法である蛋白質分解酵素阻害剤にも効果は認められ
ない。即ち、本発明によってモノアミン酸化酵素生産
菌、特にモノアミン酸化酵素生産菌凍結保存菌体からモ
ノアミン酸化酵素を安定に効率よく抽出することが初め
て可能となる。

【００１８】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。

【００１９】参考例アミン酸化酵素生産菌の培養 3.0% グルコース、0.3% 硝酸ナトリウム、0.1% リン酸
水素二カリウム、0.05%硫酸マグネシウム、0.05% 塩化
カリウム、0.001% 硫酸第一鉄、0.1% 酵母エキス、0.02
% 消泡剤から成る前培養培地（pH5.0）100mlの入った坂
口フラスコを10本用意し、アスペルギルス・ニガー（As
pergillus niger，ＡＴＣＣ２８３２５）の胞子懸濁液
を接種し、30℃、攪拌回転数110rpmで一晩振とう培養し
た。この坂口フラスコ10本分の培養液を、20Lの前培養
液を仕込んだジャーファーメンターに移し、30℃、攪拌
回転数200rpm、通気25L/minで一晩培養した後、集菌し
た。次いで、160Lの前培養液を仕込んだジャーファーメ
ンターに植菌し、30℃、攪拌回転数200rpm、通気180L/m
inで一晩培養した後、集菌し、3.0% グルコース、0.1%
ブチルアミン、0.1% リン酸水素二カリウム、0.05%硫酸
マグネシウム、0.05%塩化カリウム、0.001% 硫酸第一
鉄、0.02% 消泡剤から成る本培養培地（pH5.0）を160L
仕込んだジャーファーメンターに菌体を植菌し、30℃、
攪拌回転数200rpm、通気180L/minで一晩本培養を行い集
菌した。

【００２０】実施例１ 20mM リン酸緩衝液，pH8.2と種々の濃度の硫酸銅（二
価）からなる水性媒体に0.3gのアスペルギルス・ニガー
非凍結菌体または、アスペルギルス・ニガーの凍結保存
菌体を懸濁し、4℃、100W、20kHzの条件で5分間超音波
破砕を行いモノアミン酸化酵素を抽出した。得られた菌
体破砕液を4℃で15,000rpm、10分間遠心分離し、上清を
酵素抽出液とした。活性測定は、100mM リン酸緩衝液，
pH7.0、5mMベンジルアミンからなる酵素活性測定溶液0.
98mlに酵素抽出液0.02mlを加え、30℃で5分間酵素反応
の結果生じるベンズアルデヒド量を250nmの吸光度で測
定することにより実施した。1分間に1μmolのベンズア
ルデヒドを生成する酵素量を１単位とした。酵素抽出液
の蛋白質量を測定し、酵素抽出液の比活性（活性／蛋白
量）を算出した。結果を表１に示す。非凍結菌体、凍結
菌体共に４μM以上の硫酸銅を添加することで酵素が効
率良く抽出され、比活性が上昇した。特に凍結保存菌体
において効果的であった。

【００２１】

【表１】

【００２２】実施例２ 20mM リン酸緩衝液，pH8.2と種々の濃度の硝酸銅（二
価）からなる水性媒体を使用した以外は実施例１と同様
の方法でモノアミン酸化酵素を抽出した。結果を表２に
示す。この場合も、4μM以上の硝酸銅を添加することで
酵素が効率良く抽出され、比活性が上昇した。特に、凍
結菌体において効果的であった。

【００２３】

【表２】

【００２４】実施例３二価の銅錯体であるビス（アセチルアセトナト）銅［Cu
(C₅H₇O₂)₂］についてその効果を調べた。

【００２５】20mM リン酸緩衝液，pH8.2と8μM ビス
（アセチルアセトナト）銅からなる水性媒体を使用した
以外は実施例１と同様の方法で酵素抽出を行った。酵素
抽出液中のアミン酸化酵素活性、蛋白質量、比活性は、
非凍結菌体では0.1681単位、30mg、0.0056単位／mg、凍
結保存菌体では0.1696単位、31mg、0.0055単位／mgであ
った。

【００２６】二価の銅錯体であるビス（アセチルアセト
ナト）銅にも二価の銅イオンと同様の効果が認められ
た。この場合も凍結保存菌体において特に効果的であっ
た。

【００２７】比較例１蛋白質分解酵素阻害剤であるフェニルメタンスルフォニ
ルフルオリド（以下PMSFと略す）の効果を調べた。

【００２８】20mM リン酸緩衝液，pH8.2と0.2mM PMSFか
らなる水性媒体を使用した以外は実施例１と同様の方法
で酵素を抽出した。酵素抽出液中のアミン酸化酵素活
性、蛋白質量、比活性は、非凍結菌体では0.1314単位、
31mg、0.0042単位／mg、凍結保存菌体では0.0951単位、
31mg、0.0031単位／mgであった。

【００２９】蛋白質分解酵素阻害剤には二価の銅のよう
な効果は認められなかった。

【００３０】比較例２ 20mM リン酸緩衝液，pH8.2と銅（二価）以外の種々の金
属塩（8μM）を含む水性媒体を使用した以外は実施例１
と同様の方法により酵素抽出を行った。非凍結菌体の結
果を表３、凍結保存菌体の結果を表４に示す。一価の銅
イオン、銅以外の金属イオンでは比活性の上昇は認めら
れなかった。

【００３１】

【表３】

【００３２】

【表４】

【００３３】実施例４ 20mM リン酸緩衝液，pH8.2からなる水性媒体と20mM リ
ン酸緩衝液，pH8.2または、8μM 硫酸銅（二価）からな
る水性媒体に、2,500gのアスペルギルス・ニガーの凍結
保存菌体を懸濁し、ダイノミル細胞破砕機を用いて、ガ
ラスビーズ径0.5〜0.75mm、回転数3,200rpm、冷却媒温
度-15℃の条件で機械的摩擦により菌体を破砕しモノア
ミン酸化酵素を抽出した。得られた菌体破砕液を4℃、
9,000rpmで遠心分離し、上清を酵素抽出液として回収し
た。実施例１と同様の方法で酵素抽出液の酵素活性を測
定した。酵素抽出液中のアミン酸化酵素活性、蛋白質
量、比活性は、硫酸銅非存在の場合は410単位、403,200
mg、0.0010単位／mg、硫酸銅存在の場合は830単位、41
2,000mg、0.0020単位／mgであった。

【００３４】ダイノミルを用いた機械的摩擦による大量
破砕の場合でも、硫酸銅の添加は有効であった。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】モノアミン酸化酵素生産菌を水性媒体に
懸濁し次いで破砕してモノアミン酸化酵素を水性媒体中
に抽出する方法において、破砕時に二価の銅イオンまた
は二価の銅錯体を水性媒体中に4μM以上存在させること
を特徴とするモノアミン酸化酵素の抽出方法。