CN103911449B - 基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测RNA PAS（Poly A Site）的方法，提供了一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，包括含有oligo dT的磁珠制备，即将5'端生物素修饰的oligo dT引物与带链霉亲和素的磁珠混合结合；用所述磁珠与总RNA混合，筛选含有Poly A的RNA；逆转录，双链cDNA第二链合成，双链cDNA断裂；移除Poly A结构；末端修饰后连接测序接头；文库回收。该方法减少了RNA水平操作，在DNA水平移除Poly A序列，消除Poly结构对测序的影响；选择双链DNA断裂酶处理，在不影响文库质量的基础上在DNA水平断裂；简化实验流程，降低实验难度和造价，使其应用范围更广。

Description

基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法

技术领域

本发明涉及一种检测RNA PAS(Poly A Site)的方法，尤其涉及一种基于3T-seq(TT-mRNA Terminal Sequencing)技术在全基因组范围内分析APA(AlternativePolyadenylation)的方法。

背景技术

在人类基因组中，有一半以上的基因存在多个聚腺苷酸化位点(PAS，Poly ASite)。在前体mRNA成熟过程中，通过改变前体mRNA的切割位点和聚腺苷酸化位点(PAS)而从一个编码区产生带有不同长度的3’非编码区(3’UTR)的成熟mRNA，这种情况称为选择性聚腺苷酸化(APA，Alternative Polyadenylation)。APA在调控细胞增殖、分化、转运和发育以及疾病发生如肿瘤发生发展等生理和病理过程都发挥了至关重要的作用。

在全基因组范围内研究APA变化的现有技术有多种，但原理都相近。其中两种最具有代表性方法为SAPAS(Sequencing APA Sites)和3P-Seq(Poly(A)PositionProfiling by sequencing)。文献记载的SAPAS方法(Fu Y,Sun Y,Li Y,Li J,Rao X,Chen C,Xu A.Differential genome-wide profiling of tandem 3'UTRs among humanbreast cancer and normal cells by high-throughput sequencing.Genome Res.2011,21(5):741-747.)，其实验原理如下：将RNA直接加热断裂后，用含有oligo dT的引物逆转录出第一链cDNA，链置换的方法合成双链cDNA。然后用突变的oligo dT(TTTTCTTTTTTCTTTTTT)与测序接头连接作为PCR引物扩增，扩增出的产物中则不含有poly A结构，以此避免poly A结构对测序质量的影响。文献中记载的3P-Seq方法(Jan CH,Friedman RC,Ruby JG,Bartel DP.Formation,regulation andevolution of Caenorhabditis elegans 3'UTRs.Nature,2011,469(7328):97-101.)，其实验原理图如下：用oligo dT将含有poly A序列的RNA筛选出后，3'端加上一个带Biotin修饰的RNA接头，然后经过RNase T1断裂RNA后用含有链霉亲和素的磁珠筛选含有poly A的片段，再用只含有dTTP的逆转录体系将poly A结构逆转录成杂合双链，利用RNase H的特性水解poly A结构，将含有APA位点的片段从磁珠上释放下来，两端加上RNA接头后合成双链cDNA，进行PCR扩增后即为可用于测序的文库。

现有技术中SAPAS法不能彻底消除polyA未切除对测序的影响，3P-Seq法中RNA水平操作繁杂，经过多步的RNA连接和酶切，对RNA的损伤和损失也较大，不适用于少量样品文库的构建。且此方法难度较大、成本较高。另外，操作过程中断裂方式存在局限性，即3P-Seq法中RNase T1酶切断裂和SAPAS法中RNA直接加热断裂的方法不能做到既能不损伤RNA同时又能随机断裂。

发明内容

有鉴于现有技术不能彻底消除Poly结构对测序的影响、因操作繁杂引起的RNA损伤和损失、断裂方式的局限的缺陷，本发明旨在提供一种基于mRNA 3’末端测序(TT-mRNA Terminal Sequencing，3T-seq)全基因组范围分析APA的方法，以尽可能减少RNA水平操作，在DNA水平移除Poly A序列，消除Poly结构对测序的影响；尽可能简化实验流程，降低步骤繁琐引起的损失，同时降低实验难度和造价，使其应用范围更广；选择合适的断裂方法，尽量做到在不影响文库质量的基础上在DNA水平断裂。

本发明采用以下技术方案解决上述问题：

提供一种基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法，包括：(1)含有oligo dT的磁珠制备；(2)用所述磁珠与总RNA混合，筛选含有Poly A的RNA；(3)逆转录，双链cDNA第二链合成，双链cDNA断裂；(4)在DNA水平移除Poly A结构；(5)末端修饰后连接测序接头；(6)文库回收及扩增。

进一步地，oligo dT引物5'端含有Gsu I酶切位点，用以后续移除Poly A结构。Gsu I酶可以移除识别位点下游14-16个碱基，使文库分子留下AA的粘性末端。

进一步地，oligo dT引物的5'端含有Gsu I的酶切位点的保护序列。优选地，保护序列的碱基数为9个。

进一步地，oligo dT引物的5'端用生物素修饰，用以与带链霉亲和素的磁珠连接。

进一步地，oligo dT引物序列为5'-GAGCTAGTTCTGGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'。其中，V代表A、C或G，N代表A、T、C或G。oligo dT引物的3'端一共含有18个T，经过Gsu I酶切和末端修饰后，文库分子余下2个T作为标记用于测序结果的筛选。采用3T-Seq技术构建胃癌细胞系的APA文库，经过Illumina测序，共得到30million reads的数据，采用2个T筛选数据发现92.8％的reads被筛出并成功比对到RNA 3'端。因此认为2个T在后期数据筛选有效测序结果完全足够。增加T的个数来可以提高筛选效率，根据目前Illumina测序的水平估算，若不超过5个T则不会对测序质量产生很大的影响。因此本方法适用于2-5个T作为筛选标签的应用。

进一步地，所述逆转录使用未甲基化的dATP、dGTP、dTTP和甲基化的dCTP，以封闭基因序列中的Gsu I酶切位点。

进一步地，在所述双链cDNA第二链的合成中，使用未甲基化的dCTP、dATP、dGTP和dUTP，通过RNase H、E.coli DNA聚合酶、E.coli DNA连接酶的作用进行合成。dUTP代替dTTP合成第二链cDNA，目的是在后续进行文库PCR时加入USER酶裂解掉第二条链，使测序文库具有链特异性。

进一步地，双链cDNA的断裂使用双链DNA断裂酶处理、DNase I处理或超声断裂。优选地，采用双链DNA断裂酶处理。优选地，双链cDNA的断裂后，片段大小在200-400bp，经洗涤后留在所述磁珠上的片段为目的片段。

进一步地，所述移除Poly A结构为：利用Gsu I酶进行酶切，释放连接在所述磁珠上的目的片段。

进一步地，本发明的方法适用于起始总RNA量为10ug-100ug。

3T-Seq(TT-mRNA Terminal Sequencing)技术是用于在全基因组范围内研究APA变化的技术。该技术的原理图1所示，首先需要构建一种特殊的含有oligo dT的磁珠，用这种磁珠筛选含有poly A的RNA，然后在磁珠上逆转录合成第一链cDNA，逆转录体系中用甲基化的dCTP替代正常的dCTP，随后使用dCTP、dATP、dGTP、dUTP合成双链cDNA。经过断裂后磁珠上留下的即为含有APA位点的片段，再经过Gsu I酶切除去poly A结构，将目的片段从磁珠上释放下来，两端经过修饰后添加Illumina测序接头，经过片段大小筛选后PCR扩增，即得到可用于Illumina二代测序的文库。

本发明的有益效果为：

1.构建了特殊的含有oligo dT的磁珠，该磁珠既能筛选含有poly A结构的RNA，同时含有酶切位点可以移除文库中的poly A结构。而普通的商业oligo dT磁珠只能用于筛选含有poly A的RNA。本发明的磁珠具有以下特点：(1)oligo dT引物的5'端添加生物素修饰，用于连接带有链霉亲和素的磁珠。(2)oligo dT序列的5'端加上一个Gsu I的酶切识别位点以及9个碱基的保护序列，用于poly A结构的移除。(3)磁珠上结合的oligo dT经Gsu I酶酶切后，其3'端保留2-5个T，能用于后期数据处理时数据的筛选。

2.断裂方式的选择：为了减少对RNA的损伤，本发明选择在DNA阶段断裂，DNA水平断裂与现有断裂方式相比减少了对RNA的损伤，提高了产率。双链cDNA合成后，使用NEB公司的双链cDNA断裂酶将双链cDNA断裂成200-400bp的片段，经过磁珠筛选后，挂在磁珠上的片段即为靠近RNA 3'端且含有Poly A位点的片段。

3.移除Poly A结构的策略：为了方便操作和降低实验难度，本发明选择在DNA水平移除Poly A结构，提高测序质量，使APA的鉴定更加准确。在逆转录时，我们在oligo dT的5'端引入了Gsu I的酶切识别位点，Gsu I是一种第三型限制性内切酶，在识别位点的下游16个碱基的位置切割形成两个碱基的粘性末端，而且具有甲基化封闭敏感特性。当识别位点(CTGGAG)中的碱基C被甲基化时，该识别位点被封闭，无法被Gsu I识别。由于Poly A结构移除的同时也将文库片段从磁珠上释放下来，为了防止移除Poly结构时文库片段上也含有这个酶切位点而造成APA位点的假阳性，我们在逆转录的时候使用甲基化的dCTP替代正常的dCTP，而在第二链cDNA合成的时候换回正常的dCTP，这样就可以在保证oligo dT中的Gsu I酶切位点完好而其他识别位点被甲基化封闭，避免了假阳性结果的产生。

4.TT标签用于筛选数据精确定位APA位点。我们设计用于反转的引物中含有18个T。Gsu I移除Poly A时切去14个A，2个A的粘性末端在末端修饰时被切除，所以真正留在文库片段上的2个T用以标记文库片段的APA位点。

附图说明

图1本发明的3T-Seq技术的实验原理图。

具体实施方式

具体实施方式中使用的缓冲液成分如下：

配制缓冲液所需的试剂贮存母液(可从商业公司购置，也可购买相关试剂自行配制)：

结合缓冲液1(20ml)：

DEPC处理水              10ml

5M NaCl                 8ml

0.5M EDTA(PH 8.0)       2ml

结合缓冲液2(20ml)：

洗涤缓冲液A(20ml)：

洗涤缓冲液B(20ml)：

洗涤缓冲液C(20ml)：

洗涤缓冲液D(20ml)：

以下洗涤缓冲液的配制母液均来源于相关商业公司产品，需要在相关公司购置母液按照以下配方配制，建议每次实验时新鲜配制使用：

洗涤缓冲液1(400μl)：

DEPC处理水                           280μl

5×First-Strand Buffer(Invitrogen)   80μl

0.1M DTT(Invitrogen)                 40μl

洗涤缓冲液2(200μl)：

无菌水                               178μl

10×Fragmentase Reaction Buffer(NEB) 20μl

100×BSA(NEB)                        2μl

洗涤缓冲液3(300μl)：

无菌水                               267μl

10×Buffer B(Fermentas)              30μl

100×BSA(NEB)                        3μl

洗涤缓冲液4：

无菌水                               176μl

10×Buffer B(Fermentas)              20μl

0.5mM SAM(Fermentas)                 4μl

基于3T-seq全基因组范围分析APA的方法的如下：

1.总RNA的抽提：

利用Trizol法或商业试剂盒从细胞或者组织抽提总RNA，用琼脂糖甲醛变性电泳或者安捷伦2100 Bioanalyzer检测RNA质量，高质量的RNA做起始材料对精确分析APA变化很重要。本具体实施方式要求电泳结果能清晰看出28S rRNA和18S rRNA条带并估算比值为2:1或者2100 Bioanalyzer结果显示RIN值大于9.0。

2.带有oligo dT引物的磁珠的制备：

含有Gsu I酶切识别位点的oligo dT引物直接在商业公司合成，其序列为5'-GAGCTAGTTCTGGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'，5'端需要生物素修饰。将合成好的引物溶于RNA级别的10 mM Tris-HCl(pH＝7)配成100μM的溶液。取50μl的M280链霉亲和素的磁珠(Invitrogen)，用结合缓冲液1洗涤磁珠3次，每次100μl。然后取5μl 100μM的oligo dT引物与95μl结合缓冲液1进行混合，然后与洗涤后的磁珠室温结合过夜，结合过程放置在INTELLI-MIXER混匀仪(ELMI)上，防止磁珠沉淀。将未与磁珠结合的过量oligo dT引物用结合缓冲液2洗去，共洗涤3次，每次100μl，即制成可用于本实验的带有oligo dT引物的磁珠。

3.筛选带有Poly A的RNA：

使用第2步制成的带有oligo dT引物的磁珠，从总RNA中筛选含有Poly A的RNA，本技术适用于10ug-100ug的总RNA做为起始材料。首先将总RNA在65℃加热5分钟后迅速入冰上，用结合缓冲液2将总RNA体积调至1ml，然后与新鲜制成的带有oligo dT引物的磁珠混合，室温结合5-10分钟，用手轻摇，防止磁珠沉淀。然后用洗涤缓冲液A洗涤2次，每次500μl，接着用洗涤缓冲液B 500μl洗涤1次，用以除去未结合的RNA。然后用1×第一链缓冲液(IIIReverse Transcriptase附带5×第一链缓冲液稀释而来)洗涤4次，每次100μl。

4.逆转录：

将正常的dATP、dGTP、dTTP和甲基化的dCTP混合配成2.5mM“dNTP”混合液用于逆转录，使用甲基化的dCTP以封闭基因序列中的GsuI酶切识别位点。逆转录体系参考逆转录酶III Reverse Transcriptase(LifeTechnologies)的说明书，反应直接在磁珠上进行，将反应体系放大至90μl，反应温度选择42℃，防止温度较高致使链霉亲和素和生物素解离。

5.第二链的合成：

用洗涤缓冲液1洗涤磁珠3次，每次100μl，除去甲基化的dCTP，洗涤后用30μl洗涤缓冲液1重悬磁珠。用dATP、dGTP、dCTP、dUTP混合配成10mM“dNTP”备用。在重悬磁珠体系中按次序加入预冷的超纯水184μl、10×第二链缓冲液(Second Strand Synthesis(dNTP-Free)Reaction Buffer，NEB公司)25μl、10mM“dNTP”5μl、E.coli DNA连接酶1μl、E.coli DNA聚合酶4μl，E.coli RNase H 1μl(以上酶均购于NEB)，混匀后置于舒适型恒温混匀器中(Thermomixer comfort，Eppendorf)16℃反应2小时。反应结束后用加热至75℃的洗涤缓冲液C洗涤磁珠2次，每次200μl，以终止反应。然后用洗涤缓冲液D洗涤磁珠3次，每次200μl，以除去洗涤缓冲液C中的SDS等成分，以避免它们对后续反应的影响。

6.双链cDNA的断裂：

用洗涤缓冲液2洗涤磁珠2次，每次100μl，然后用双链DNA断裂酶(NEBdsDNA Fragmentase)将双链cDNA断裂成200-400bp大小的片段，方法参考酶的说明书。用洗涤缓冲液3洗涤3次，每次100μl，留在磁珠上的片段即为我们的目的片段。

7.移除Poly A结构：

用洗涤缓冲液4洗涤磁珠2次，每次100μl，然后用Gsu I酶(Fermentas)酶切，切除Poly A序列，同时将目的片段从磁珠上释放。酶切体系参考酶的说明书。使用酚氯仿抽提结合乙醇沉淀的方法纯化酶切释放的文库片段。

8.末端修饰1：

采用末端修饰试剂盒(Fast DNA End Repair Kit，Thermo Scientific)使目的片段两端形成平末端且5'端加上磷酸化基团，用于Illumina测序接头的连接。

9.末端修饰2：

用Taq DNA聚合酶(Fermentas)在末端修饰后的目的片段3'端添加一个碱基A，用于Illumina测序接头的连接。此步与第8步可以合为一步做到，以减少步骤繁杂引起的损失，目前已经有试剂盒(Ultra End Repair/dA-TailingModule)可以完成。

10.连接测序接头：

将末端修饰后的目的片段与Illumina P5/P7接头(可在Illumina网站查询序列信息，自行在商业公司合成)连接，连接酶选用T4 DNA连接酶(Fermentas)，体系参考说明书。

11.文库回收：

用2.5％的琼脂糖凝胶电泳分离过量接头，同时进行文库片段大小筛选，割胶回收200-500bp范围内的文库。采用High-Fidelity DNA聚合酶(NEB)扩增回收的文库，通过8％的聚丙烯酰胺电泳纯化回收后即可用于Illumina 2×100双向测序。聚丙烯酰胺电泳回收纯化时可根据Marker指示再次筛选片段大小(200-500bp)，对文库片段大小的精确控制有利于提高测序质量。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于mRNA 3’末端测序全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，包括：(1)含有oligo dT引物的磁珠的制备；(2)用所述磁珠与总RNA混合，筛选含有Poly A的RNA；(3)逆转录，双链cDNA第二链合成，双链cDNA断裂；(4)在DNA水平移除Poly A结构；(5)末端修饰后连接测序接头；(6)文库回收及扩增。

2.根据权利要求1所述的一种基于mRNA 3’末端测序全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，所述oligo dT引物5'端含有Gsu I酶切位点，用以后续移除Poly A结构。

3.根据权利要求2所述的一种基于mRNA 3’末端测序全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，所述oligo dT引物的5'端含有Gsu I的酶切位点的保护序列。

4.根据权利要求1所述的一种基于mRNA 3’末端测序全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，所述oligo dT引物的5'端用生物素修饰，用以与带链霉亲和素的磁珠连接。

5.根据权利要求1所述的一种基于mRNA 3’末端测序全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，所述oligo dT引物序列为5'-GAGCTAGTTCTGGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'。

6.根据权利要求2所述的一种基于mRNA 3’末端测序全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，所述逆转录使用未甲基化的dATP、dGTP、dTTP和甲基化的dCTP，以封闭基因序列中的Gsu I酶切位点。

7.根据权利要求2所述的一种基于mRNA 3’末端测序全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，在所述双链cDNA第二链合成中，使用未甲基化的dCTP、dATP、dGTP和dUTP，通过RNase H、E.coli DNA聚合酶、E.coli DNA连接酶的作用进行合成。

8.根据权利要求1所述的一种基于mRNA 3’末端测序全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，所述双链cDNA的断裂，使用双链DNA断裂酶处理、DNase I处理或超声断裂。

9.根据权利要求2所述的一种基于mRNA 3’末端测序全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，所述移除Poly A结构为：利用Gsu I酶进行酶切，释放连接在所述磁珠上的目的片段。

10.根据权利要求1所述的一种基于mRNA 3’末端测序全基因组范围分析APA的方法，其特征在于，适用于起始总RNA量为10μg-100μg。