CN102732629A - 利用高通量测序同时测定基因表达量和多聚腺苷酸加尾的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因组学技术领域，具体涉及一种利用高通量测序同时测定真核生物基因组中基因的表达量和多聚腺苷酸加尾的方法。本方法在逆转录时引入可被切除的特殊碱基，从而去除多余的腺苷酸，达到直接测定PolyA位点的目的。本方法无需信使RNA的纯化，直接进行逆转录，因此更简单；由于采用双端测序，因此更精确；本方法既能精确测定PolyA位点，又能可靠确定基因表达量，因此更省钱。该文库经高通量测序后获得基因表达及PolyA加尾的基础数据，再经过生物信息学分析获得基因的表达量和PolyA加尾的详细信息，为人类重要疾病的早期诊断和预后预测提供分析依据。

Description

利用高通量测序同时测定基因表达量和多聚腺苷酸加尾的方法

技术领域

本发明属于基因组学技术领域，具体涉及一种利用高通量测序（或下一代测序）技术同时测定真核生物基因组中基因的表达量和多聚腺苷酸加尾的方法。

背景技术

中心法则是现代分子生物学最重要也是最基本的规律。遗传信息通过转录从DNA到RNA，再通过翻译从RNA到蛋白质。而转录是遗传信息流的第一步，对于转录的调控也是基因表达最重要的调控手段之一。近年来高通量测序技术（或下一代测序），特别是RNA测序（RNA-seq）技术的飞速发展，给真核生物转录组的研究带来了的革命性的影响。由于RNA测序技术通量更高、更准确、更灵敏，同时价格还在不断下降，因此已经日渐成为基础生物学研究和生物医学研究的常规技术。

与微阵列 (Microarray) 技术不同，RNA测序不依赖于已有的基因注释，因此除了检测已知基因，还能够发现许多新的转录体。近些年，许多研究已经利用RNA-seq发现了新的选择性剪接异构体（Alternative splicing isoform）、基因间的长链非编码RNA（long intergenic non-coding RNA, lincRNA）以及短链非编码RNA。为了进一步验证天然反义转录体（Natural Antisense Transcripts）在许多物种中的广泛性，研究人员进一步开发了链特异性的RNA测序技术（Strand-specific RNA-seq）。由于在测序文库的构建过程中保留了RNA的链信息，因此这种改进的RNA测序技术不仅能够发现新的反义转录体，同时也能够区分内含子中的信号是来源于内含子保留还是反义转录体。可以说，目前对于转录组的研究正经历着一场革命，许多以前所没有发现的转录体由于下一代测序技术愈来愈高的通量而被不断发现。这些新转录体的生物学功能也被越来越多的研究证实。

由于选择性启动子、选择性剪接和选择性PolyA加尾是引起众多转录异构体的原因，因此研究者们开发了许多RNA测序的变种用于专门研究转录的起始位点（从而确定选择性启动子）、3’末端形成（从而确定选择性PolyA加尾）。众所周知，不同的PolyA加尾位点可以导致同一转录体不同的3’UTR（3’ Untranslated Region，3端非翻译区）长度。由于3’UTR含有众多的RNA顺式调控元件，比如亚细胞定位元件、RNA稳定性元件、微RNA（microRNA, miRNA）结合元件及PolyA加尾信号等，因此3’UTR的长度对于基因的转录后调控具有重要的作用。研究发现，3’UTR的某些点突变可导致严重的疾病。不少基因中3’UTR上的DNA删除与癌症的产生密切相关。Adrian Wiestner等人发现在细胞周期蛋白D1(CCND1)上的点突变和DNA删除可以导致具有较短3’UTR的信使RNA的表达，并与套细胞淋巴瘤的高增殖性和低存活率密切相关。因此，全基因组polyA位点的精确定位对于深入理解疾病产生的机制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够简单、精确、经济的同时检测基因表达量和多聚腺苷酸加尾位点的方法。

本发明提供的同时检测基因表达量和多聚腺苷酸加尾位点的方法，采用高通量测序技术。本方法的关键之处是在逆转录时引入可被切除的特殊碱基，从而去除多余的腺苷酸，达到直接测定PolyA(PA)位点的目的。同已有方法相比，本方法更为简单、精确和省钱。由于本方法无需polyA+ RNA的纯化，直接进行逆转录，因此更简单；由于采用双端测序策略从而能进一步增加可用的序列，因此更精确；由于这一方法既能精确测定PA位点，又能可靠确定基因表达量，因此更省钱。同时本方法具有的链特异性巧妙设计还有一个额外好处，就是能够测定反义转录体的PA位点。

本发明方法主要为一种高通量测序文库的构建新方法(简称：PA-seq)。起始材料为总RNA，终产物为扩增后的双链DNA测序文库。该文库经高通量测序（比如Illumina的GAIIx测序平台或HiSeq2000/HiSeq2500测序平台）后获得基因表达及多聚腺苷酸(PolyA)加尾的基础数据，再经过生物信息学分析获得真核生物基因组中基因的表达量和多聚腺苷酸加尾的详细信息，从而可用于人类重要疾病（如癌症、心血管相关疾病、糖尿病、神经退行性疾病、出生缺陷疾病等）的早期诊断、治疗中对药物的反应和预后预测。

利用高通量测序同时测定真核生物基因组中基因的表达量和多聚腺苷酸加尾的方法，具体步骤如下：直接片段化总RNA，在逆转录时引入可被切除的特殊碱基dUTP，用磁珠纯化双链DNA，用USER酶识别dUTP并释放磁珠上的双链DN；该双链DNA经末端补平后加上一个3端腺苷酸突出；连接反应经纯化和片段大小选择后用相应的PCR引物扩增，获得可用于高通量测序的文库；构建的文库可以单端测序，也可以双端测序；该文库经高通量测序（比如Illumina的GAIIx测序平台或HiSeq2000/HiSeq2500测序平台）后获得基因表达及多聚腺苷酸(PolyA)加尾的基础数据，再经过生物信息学分析获得真核生物基因组中基因的表达量和多聚腺苷酸加尾的详细信息。

高通量测序文库构建的具体操作过程如下：总RNA经TRIzol试剂或其它常规方法提取后，用DNaseI酶处理以便除去混有的基因组DNA污染。纯化后的总RNA在镁离子作用下高温片段化，之后用于逆转录。逆转录采用经过生物素和脱氧尿嘧啶(dUTP)修饰的寡聚胸腺嘧啶(oligo(dT))，并用DNA polymerase I和RNase H进行双链DNA的合成。产生的双链DNA在磁珠(Streptavidin MyOne magnetic beads)的结合纯化后用一种特殊的酶(USER，尿苷酸特异的糖苷酶和内切酶)消化，从而释放出切除后的双链DNA。该双链DNA经末端补平后加上一个3端腺苷酸突出，用于连接Illumina接头或SOLiD接头或454接头。连接反应经纯化和片段大小选择后用相应的PCR引物扩增，从而获得可用于高通量测序的特殊文库。该文库可以单端测序，也可以双端测序。文库构建的细节见具体实施方式部分。

所述总RNA来源所涉及的物种包括：人、猩猩、猕猴、大鼠、小鼠、果蝇、斑马鱼、线虫、拟南芥、水稻、棉花、油菜、酵母及疟原虫。

文库适用的平台包括Illumina GAIIx平台、Illumina HiSeq2000、Illumina HiSeq2500、Illumina MySeq平台、454测序平台、ABI SOLiD4、ABI 5500系列测序平台及ABI Ion Torrent的高通量测序。

附图说明

图1是PA-seq方法示意图。其中磁珠为Invitrogen公司的Dynabeads MyOne C1。

图2是利用PA-seq方法测定人胰腺中的基因多聚腺苷酸位点在基因组浏览器上的信号。图中举例列出了2号染色体上约20kb的一段区域，由4个基因组成。左侧的数字表示短序列数，可以反应表达量。基因注释采用RefSeq系统，最粗的实线表示基因的外显子，基因两侧的较粗实线表示5端和3端的非翻译区。最细的实线表示内含子，上面的箭头表示基因转录的方向。每个基因的名字在左侧显示。

图3是PA-seq方法和微阵列(Affymatrix Microarry, Affy array)方法对同一样品的基因表达相关性图。两个方法的相关系数(R)为0.64，与目前公认的高通量测序和微阵列两个方法之间的相关性(0.6~0.7)一致，表明本专利的PA-seq方法可以用来反映基因的表达量。

图4是不同人组织中基因的选择性PolyA加尾情况。左侧的超氧化物岐化酶基因有两个选择性PolyA加尾位点，从胰腺到睾丸到心脏，平均的3端非翻译区(3’UTR)长度不断缩短。右侧的羟酰辅酶A脱氢酶基因选择性PolyA加尾模式没有变化。

图5是人细胞周期素D1(CCND1)基因在正常免疫T细胞和人B淋巴瘤细胞系中的PolyA加尾情况。人细胞周期素D1基因的突变导致的新增PolyA位点被认为是引起B淋巴瘤（一种白细胞癌症，又称白血病）的一个重要原因。PA-seq技术能很可靠地检测出B细胞中的新增PolyA位点。

图6是利用PA-seq方法测定小鼠中全基因组水平PolyA加尾的有关Sod1基因的结果。由图可知本方法能可靠检测出已知的PolyA加尾位点和基因表达量。同时一个新的PolyA加尾位点也被检测出，并且在不同条件下使用比例不同。

具体实施方式

所有实施例中的有关DNA和RNA基本操作均参考《分子克隆：实验室操作指南》（金冬雁等译，科学出版社，北京（1993））和《精编分子生物学指南》（颜子颖等译，科学出版社，北京（1998））。分子操作中所用的酶和特殊试剂在之后括号中均注明了相应的公司。

实施例1：总RNA的片段化和逆转录

总RNA(包括人、猩猩、猕猴、大鼠、小鼠、果蝇、斑马鱼、线虫、拟南芥、水稻、棉花、油菜、酵母及疟原虫)经TRIzol试剂（Invitrogen）或其它常规方法提取后，用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)及DNaseI酶(Qiagen)处理以便除去混有的基因组DNA污染。纯化后的总RNA用Nanodrop(Thermol)测定浓度后取出10ug(微克)用于文库构建。RNA溶于30ul(微升)片段化缓冲液中（40 mM Tris-HAc (pH 8.2), 100 mM KAc and 30 mM MgAc₂）并于94℃加热3min(分钟)达到片段化目的。RNA片段可用Ambion公司的GlycoBlue帮助乙醇沉淀纯化。纯化后的RNA在50ul体系中进行逆转录，包括10 pmol oligo(dT)引物（序列如下：5’-bio-TTTTTTTTTTTTTTTTdUTTTVN-3’（SEQ ID NO.1 ）,其中bio为双生物素修饰，dU为脱氧尿嘧啶，V为除T外的任何核苷酸，N为任何核苷酸），2ul SuperScript II逆转录酶 (Invitrogen)，100单位的RNA酶抑制剂RNasin (Promega)以及新配制的actinomycin D （来自USB公司，用于抑制逆转录酶所具有的依赖DNA的DNA聚合酶活性）。逆转录体系在42℃孵育2分钟后再加逆转录酶并混匀。之后保持在42℃共1小时，随后加热到75℃共15分钟使逆转录酶失活。反应可在4℃长期保存。我们采用ZYMO Research公司的ZYMO clean & concentrator-5试剂盒进行纯化并洗脱于20ul无核酸酶的纯水中。 

实施例2：双链DNA的合成

20ul逆转录纯化产物于50ul反应体系中进行双链DNA的合成。缓冲液体系为500 mM Tris-HCl, pH7.8, 50 mM MgCl2, 10 mM DTT。在冰上放置5分钟后加入25单位的DNA polymerase I (NEB)，1个单位的RNase H (NEB)和15pmol的dNTP (Bioline)。混匀后于15℃保持2.5小时。

实施例3：磁珠纯化双链DNA

每个起始样品需要50ul的Dynabeads MyOne C1 (Invitrogen)磁珠来纯化。磁珠的纯化按照Invitrogen公司提供的标准流程。两轮洗脱后将磁珠悬浮于44 ul 10 mM Tris-HCl (pH7.4)溶液中，加入1ul APex热不稳定性碱性磷酸酶 (Epicentre)和5ul 10x Apex缓冲液(Epicentre)。混匀后在37℃孵育10分钟，然后移至70℃加热灭活5分钟。磁珠接着用300ul 1x结合与洗脱缓冲液洗两次，300ul 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)洗一次，最后混匀于48 μl TE1缓冲液中(10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH8.0)。

实施例4：USER酶消化

在48ul含有磁珠的TE1缓冲液中加入2ul USER酶(NEB)并在600转/分钟的37℃混匀仪中保持1小时，双链DNA将中磁珠上释放出来。离心管在磁架上放置2分钟分离上清和磁珠。取出上清并用ZYMO Research公司的clean & concentrator-5试剂盒纯化双链DNA。DNA洗脱于20ul纯水中。

实施例5：双链DNA的补平和3端加腺苷酸

我们用3个单位的T4 DNA聚合酶(NEB)和300uM的dNTP (Bioline)在1倍的NEB常规缓冲液2中反应。该反应体系在15℃保持15分钟，然后用ZYMO Research公司的clean & concentrator-5试剂盒纯化并洗脱至20ul纯水中。纯化并补平的DNA用Klenow (exo-) DNA聚合酶(Epicentre)和200μM dATP加上3端腺苷酸突出。该反应体系在37℃保持30分钟，然后用ZYMO Research公司的clean & concentrator-5试剂盒纯化并洗脱至7ul纯水中。

实施例6：接头的连接反应

在实施例5中得到的7ul DNA中加入1ul 10倍T4 DNA连接酶缓冲液、3pmol的Illumina公司接头（或者SOLiD平台接头）和1ul高浓度T4 DNA连接酶(NEB; 2000 units/μl)。混匀后在室温放置30分钟，随后用ZYMO Research公司的clean & concentrator-5试剂盒纯化并洗脱至20ul纯水中。将20ul连接并纯化后的产物跑2%的琼脂糖凝胶电泳，切出250-450bp片段并用ZYMO Research公司的DNA Recovery试剂盒纯化并洗脱至20ul纯水中。

实施例7：低循环PCR扩增

用于我们用碱性磷酸酶去除了信使RNA相同的链上的磷酸基团，因此只有另一条链能够被连接。在50ul的PCR体系中含有以下成分：20ul的冲实施例6中获得的DNA模版、1倍浓度的Finnnzymes公司的HF缓冲液、1 nmol dNTP、25 pmol的正向引物(5’- AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3’ （SEQ ID NO.2）)和25 pmol的反向引物(5’- CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCT CGG CAT TCC TGC TGA ACC GCT CTT CCG ATC T-3’ （SEQ ID NO.3）)以及0.5 μl的Phusion高忠诚度DNA聚合酶(Finnzymes)。热循环的参数如下：98 °C for 30s; 16 cycles of 98 °C for 10s, 67 °C for 30s and 72 °C for 30s; 72 °C for 10 min; hold at 10°C。取出20ulPCR产物跑2%琼脂糖凝胶电泳，切出300-500bp产物并用ZYMO Research公司的DNA Recovery试剂盒纯化并洗脱至20ul纯水中。用Qubit荧光仪(Invitrogen)测定文库的浓度。加入终浓度为0.1%的Tween-20用于测序前的样品保存。用Illumina公司的GAIIx或HiSeq2000/2500或MySeq进行双端的测序，每端测定50个碱基。454测序文库、ABI SOLiD 4文库、ABI 5500文库及ABI Ion Torrent文库采用对应的测序仪测序。文库的构建除接头不同需用对应的PCR引物外，其余均完全一样。

实施例8：生物信息学分析

混合样品的原始数据通过构建文库时所用的条形码进行分开。由于左侧短序列(read 1)的前三个碱基在设计时为“TTT”，因此在比对之前需要去除。对于人的样品，我们用序列比对软件bwa(采用默认参数)将其映射到人的最新基因组hg19版本上。大鼠、小鼠以及其它样品分别用对应的最新基因组进行映射。分析所用到的工具包括samtools, bamtools以及bedtools，均为开放源软件。我们将所有具有唯一映射位置的短序列用于下游的多聚腺苷酸加尾位点的分析。由于多聚腺苷酸位点(polyadenylation site, PA位点)成簇，因此我们采用了F-seq这一算法对鉴定出的原始PA位点进行成簇化。我们采用RefSeq作为基因注释系统。

 

<110>  复旦大学

 

<120>  利用高通量测序同时测定基因表达量和多聚腺苷酸加尾的方法

 

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<170>  PatentIn version 3.3

 

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<212>  DNA

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<223>  n is a, c, g, t or u

 

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tttttttttt ttttttdutt tvn                                             23

 

 

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<212>  DNA

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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct       58

 

 

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<212>  DNA

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caagcagaag acggcatacg agatcggtct cggcattcct gctgaaccgc tcttccgatc     60

 

t                                                                     61

 

Claims (4)

1.一种利用高通量测序同时测定真核生物基因组中基因的表达量和多聚腺苷酸加尾的方法，其特征在于具体步骤为：直接片段化总RNA；在逆转录时引入可被切除的特殊碱基dUTP；用磁珠纯化双链DNA，用USER酶识别dUTP并释放磁珠上的双链DNA；该双链DNA经末端补平后加上一个3端腺苷酸突出；连接反应经纯化和片段大小选择后用相应的PCR引物扩增，获得可用于高通量测序的文库；构建的文库可以单端测序，也可以双端测序；该文库经高通量测序，获得基因表达及多聚腺苷酸加尾的基础数据，再经过生物信息学分析获得真核生物基因组中基因的表达量和多聚腺苷酸加尾的详细信息。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于高通量测序文库构建的具体过程如下：总RNA经TRIzol试剂或其它常规方法提取后，用DNaseI酶处理以便除去混有的基因组DNA污染；纯化后的总RNA在镁离子作用下高温片段化，之后用于逆转录；逆转录采用经过生物素和脱氧尿嘧啶修饰的寡聚胸腺嘧啶，并用DNA polymerase I和RNase H进行双链DNA的合成；产生的双链DNA在磁珠的结合纯化后用尿苷酸特异的糖苷酶和内切酶消化，从而释放出切除后的双链DNA；该双链DNA经末端补平后加上一个3端腺苷酸突出，用于连接Illumina接头或SOLiD接头或454接头；连接反应经纯化和片段大小选择后用相应的PCR引物扩增，获得可用于高通量测序的文库。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于总RNA来源于人、猩猩、猕猴、大鼠、小鼠、果蝇、斑马鱼、线虫、拟南芥、水稻、棉花、油菜、酵母或疟原虫。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于构建的文库可用于Illumina GAIIx平台、Illumina HiSeq2000、Illumina HiSeq2500、Illumina MySeq平台、454测序平台、ABI SOLiD4、ABI 5500系列测序平台及ABI Ion Torrent的高通量测序。

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