CN111635935A - 一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法及其应用 - Google Patents

一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法及其应用 Download PDF

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CN111635935A CN202010524026.1A CN202010524026A CN111635935A CN 111635935 A CN111635935 A CN 111635935A CN 202010524026 A CN202010524026 A CN 202010524026A CN 111635935 A CN111635935 A CN 111635935A
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rna
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cost
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李林
朱万超
梁焰
陈思佳
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Huazhong Agricultural University
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法及其应用。本申请基于Ribosome profiling技术通过超高速离心与梯度密度有效分离核糖体‑RNA复合物；之后从复合物中提取RNA，反转录，获得300‑600bp的文库，测序。本发明结合3’端测序技术，有针对性的对每条RNA的3’端进行测序，从而降低测序的数据量，达到降低成本的目的；同时，本技术通过对与核糖体结合的RNA进行高通量测序，使得检测基因数接近20000，提高了通量。

Description

一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法及其应用。
背景技术
蛋白质是构成细胞的基本有机物质，承担着机体的各项生命活动。对蛋白质表达丰度的评估或测定，有助于进一步阐明机体各项生理活动的机制，进而解析一些表型变化或疾病发生的原因。根据中心法则，蛋白质的产生需要经过DNA的转录及RNA的翻译。转录水平，RNA-seq是目前应用最为广泛的一种间接评估蛋白表达水平的技术，成本低且通量较高，但是由于从转录到蛋白经过多个生理过程，导致两者之间相关性较低。蛋白质谱作为最直接检测蛋白丰度的一种手段，能够精确定量蛋白质表达丰度。但是由于本身技术的限制，检测通量较低，不能涵盖更多的基因，且单个样本成本较高。2009年Ingolia等人基于翻译水平开发了Ribo-seq技术，经过对核糖体包被的RNA片段进行测序，能够有效测定哪些RNA进行了翻译，翻译的丰度是多少，从而更近一步评估蛋白丰度。该技术不仅相对于RNA-seq提升了蛋白评估的精确性，而且相较于蛋白质谱通量较高。但是该技术较为复杂且成本较高，目前市场价在4000-8000元/样本，不宜用于大批量样本的测定。Polysome profiling技术通过超高速离心与梯度密度有效分离核糖体-RNA复合物，RNA提取后针对性的对翻译的RNA进行测序，从而达到评估蛋白丰度的目的。但是由于单个样本的成本也较高，目前尚未得到广泛应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，包括以下步骤：利用Ribosome profiling技术，通过超高速梯度密度离心，分离核糖体-RNA复合物；分离纯化RNA；构建测序文库、结合3’端测序技术对纯化后的每条RNA的3’端进行测序。
进一步地，所述构建测序文库、结合3’端测序技术对纯化后的每条RNA的3’端进行测序步骤包括利用带Oligo dT的磁珠提纯mRNA，然后基于SMART反转录原理进行RNA反转录；之后，获取cDNA双链；Tn5酶切，富集RNA 3’端；以回收的3’端产物为模板，扩增纯化获得300-600bp的文库；测序，间接量化蛋白表达水平。
进一步地，所述基于SMART反转录原理进行RNA反转录步骤中涉及的引物序列包括：
Ad1 cgacgtaccagattacgctcc/rG//rG//rG/；
Ad2-1 ccgcacgctaactagtgtcgCTGATCGTNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-2 ccgcacgctaactagtgtcgACTCTCGANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-3 ccgcacgctaactagtgtcgTGAGCTAGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-4 ccgcacgctaactagtgtcgGAGACGATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-5 ccgcacgctaactagtgtcgCTTGTCGANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-6 ccgcacgctaactagtgtcgTTCCAAGGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-7 ccgcacgctaactagtgtcgCGCATGATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-8 ccgcacgctaactagtgtcgACGGAACANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-9 ccgcacgctaactagtgtcgCGGCTAATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-10 ccgcacgctaactagtgtcgATCGATCGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-11 ccgcacgctaactagtgtcgGCAAGATCNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-12 ccgcacgctaactagtgtcgGCTATCCTNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN。
进一步地，所述基于SMART反转录原理进行RNA反转录步骤中涉及的反应体系包括：2.75ul RNA，0.5ul Ad2引物(50uM)，0.5ul dNTP(10mM)；置于65℃变性5分钟，然后放回冰上超过1分钟；之后，向其中加入RNase inhibitor(40U/ul)0.25ul，SuperScript IVfirst-strand buffer(5X)2ul，DTT(100mM)0.5ul，Betaine(5M)2ul，氯化镁(1M)0.06ul，Ad1引物(50uM)1ul，SuperScript IV reverse transcriptase(200U/ul)0.5ul；所述Ad2引物为所述的Ad2-1至Ad2-12引物中的一条。
进一步地，所述基于SMART反转录原理进行RNA反转录步骤中至少涉及12个样品或12的倍数的样品；RNA反转录完成后，将反转后的体系，每12份混合一份，获取cDNA双链。
进一步地，获取cDNA双链的步骤包括：以15ul混合后的混合液为反应模板，KAPAmix(DNA聚合酶)25ul，Ad1k与Ad2-bio为前、后引物各1ul，补水至50ul；反应条件是：95℃变性3min，98℃20s，67℃15s，72℃6min，以上三个温度阶段共循环18次，然后72℃延伸5min；所述Ad1k与Ad2-bio序列为：
Ad2-bio ccgcacgctaactagtgtcg；
Ad1k cgacgtaccagattacgctcc。
进一步地，所述以回收的3’端产物为模板，扩增纯化获得300-600bp的文库步骤中涉及的引物包括
gAd3-P5-1:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGT；
Long-Ad2-P7-1:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCCGCACGCTAACTAGTGTCG。
如上述的一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法在对蛋白质表达丰度的评估和/或测定中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
1、精确性。本技术基于Ribosome profiling技术，通过超高速梯度密度离心，将核糖体-RNA复合物分离出来。与核糖体结合的RNA即正在进行翻译活动的RNA，针对该部分RNA的测序，相较于普通转录组测序(mRNA-seq)，能够明显提高与蛋白定量结果的相关性，从而更加精确的评估蛋白丰度。
2、更高通量。蛋白质谱虽然定量结果较为准确，但单个样本能够检测到的蛋白数量有限。本技术通过对与核糖体结合的RNA进行高通量测序，使得检测基因数接近20000，提高了通量。
3、低成本。本技术首先通过Ribosome profiling技术分离出与核糖体结合的RNA，然后结合3’端测序技术，有针对性的对每条RNA的3’端进行测序，从而降低测序的数据量，达到降低成本的目的。本技术在获得单个样品数据平均1.8G的情况下，单价成本约为236.2人民币；而Ribo-seq技术本身要求数据量较高，单个样品数据量要求为15G的情况下，单价为6000人民币左右。
附图说明
图1是Ribosome profiling的分离流程图；
图2是实施例中的数据结果；
图3是测序文库的构建流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法及其应用，具体如下实施例所示。
实施例
1、Ribosome profiling的分离：分离流程图见图1所示。
(1)材料准备：将玉米自交系播种于光照培养室，设置生物学重复，每个重复种植至少6株，两重复间隔2天种植。播种后14天，分别回收每个重复内单株幼苗的地上部分，6株混合磨成碎末。从一个生物学重复内取出两份，作为接下来操作的技术重复。另备9份样品，以凑足12份满足后面建库条件。
(2)以DEPC水为基础溶剂，配制裂解液(100mM KCl，20mM HEPES-KOH[pH 7.5]，10mM Mg(OAc)2)，10X Ribosome Gradient Buffer(100mM HEPES-KOH,700mM NH4OAc，50mMMg(OAc)2)，50ml 10％Sucrose(5ml 10X Ribosome Gradient Buffer，8.33ml 60％蔗糖，36.67mlDEPC水)，50ml 50％Sucrose(5ml 10X Ribosome Gradient Buffer，41.67ml 60％蔗糖，3.33mlDEPC水)。
(3)密度梯度制备：取SW40Ti PE管，根据量具画线。用注射器伸至管底，依次等量将10％Sucrose、50％Sucrose蔗糖注入，每次注入至液面达到画线处即停止。盖上胶皮长帽，置于架子上，并将架子转移至密度制备仪磁力吸盘上，设置转速10rpm，倾角83.5°，时间2分25秒。
(4)裂解：每1ml裂解液内加入1ul放线菌酮，1ul RNA酶抑制剂。每个样品取600mg组织样品于1.5ml离心管内，加入700ul裂解液，振荡均匀后置于冰上，按照体积比1:20(DOC:裂解液)加入DOC以通透细胞壁(仅用于植物)。冰上摇晃10分钟，4℃离心10分钟，取上清，加至密度梯度液面上面。
(5)离心和分离：将PE管置于吊篮内，于超高速离心机38000rpm离心3小时。离心结束后，于分离仪分离出目的层份，回收含Ribosome profiling的管子。
Ribosome profiling分离结果见图2中的A图所示，结果显示，能较好地将40S、60S、80S及Ribosome分开，成功收集Ribosome。
2、RNA提取
利用Trizol法或RNA提取试剂盒对12份Ribosome profiling进行RNA提取，然后利用Oligo dT磁珠对每个样品500ng RNA分别富集mRNA。
RNA提取结果见图2中的B图所示，结果显示，25S、18S及5S三条带明显，说明RNA完整性较高。
3、文库构建
(1)基于SMART反转录原理，依次进行以下操作。冰上配制体系，每份样品都根据体系：2.75ul RNA，0.5ul Ad2引物(50uM)，0.5ul dNTP(10mM)，分别混合获得12份体系。置于65℃变性5分钟，然后放回冰上超过1分钟。随后将RNase inhibitor(40U/ul)3ul，SuperScript IV first-strand buffer(5X)24ul，DTT(100mM)6ul，Betaine(5M)24ul，氯化镁(1M)0.72ul，Ad1引物(50uM)12ul，SuperScript IV reverse transcriptase(200U/ul)6ul依次混合均匀。然后平均分成12份，分别加至先前置于冰上的12份体系内，混匀。置于PCR仪，设置以下条件进行反应：50℃15min，55℃2min，50℃2min(后两个阶段循环10次)然后80℃10min。(注：本技术由于只设计了Ad2-1到Ad2-12 12种引物，它们相应的含12种特异性的barcode,即分子条形码。所以一般建议一次做12个样品。如果要增加样品数，可相应增加barcode种类)。各样品Ad2引物信息如下：
Ad1 cgacgtaccagattacgctcc/rG//rG//rG/
Ad2-1 ccgcacgctaactagtgtcgCTGATCGTNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
Ad2-2 ccgcacgctaactagtgtcgACTCTCGANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
Ad2-3 ccgcacgctaactagtgtcgTGAGCTAGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
Ad2-4 ccgcacgctaactagtgtcgGAGACGATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
Ad2-5 ccgcacgctaactagtgtcgCTTGTCGANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
Ad2-6 ccgcacgctaactagtgtcgTTCCAAGGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
Ad2-7 ccgcacgctaactagtgtcgCGCATGATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
Ad2-8 ccgcacgctaactagtgtcgACGGAACANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
Ad2-9 ccgcacgctaactagtgtcgCGGCTAATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
Ad2-10 ccgcacgctaactagtgtcgATCGATCGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
Ad2-11 ccgcacgctaactagtgtcgGCAAGATCNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
Ad2-12 ccgcacgctaactagtgtcgGCTATCCTNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
(2)cDNA双链获得：将反转获得的12份单链cDNA等量混合，取15ul混合液为反应模板，以Ad1k与Ad2-bio为前后引物，进行扩增。反应体系为：KAPA mix(DNA聚合酶)25ul，模板15ul，前后引物各1ul，补水至50ul；反应条件是：95℃变性3min，98℃20s，67℃15s，72℃6min，以上三个温度阶段共循环18次，然后72℃延伸5min。
Ad1k cgacgtaccagattacgctcc
Ad2-bio ccgcacgctaactagtgtcg
(3)Tn5酶切，富集RNA 3’端：将PCR产物纯化后，取50ng DNA，按照RegeneTMDNASample prep kit反应体系55℃酶切8-10min，本实施例中为9min。然后利用链霉素亲和磁珠特异性吸附回收PCR产物的3’端。
(4)文库扩增及纯化，测序文库构建的流程图见图3所示。以回收的3’端产物为模板，gAd3-P5-1，Long-Ad2-P7-1分别为前后引物，进行扩增。体系为：模板22ul，引物各1ul，KAPA mix(DNA聚合酶)25ul，补水至50ul；条件为：98℃变性3min，98℃10s，64℃30s，72℃1min，以上三个阶段循环10-12次，本实施例中为12次，最后72℃再延伸3min。PCR产物由KAPA DNA纯化磁珠，按照0.6X～0.8X比例进行纯化和片段分选，最后获得300-600bp的文库。
gAd3-P5-1:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGT
Long-Ad2-P7-1:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCCGCACGCTAACTAGTGTCG
以上两引物序列内包含测序index。
文库构建片段分选结果见图2中的C图所示，结果显示，文库DNA片段长度在300-600bp之间，适于测序。
(5)测序：对文库进行测序。同时，对相应样品全长translated RNA进行测序，相应样品蛋白质谱测定，以用于比较。
测序数据质量见图2中的D图所示，结果显示，测序质量较好，Quality Control值均在20以上。
图2中的E图为全长测序与3’Ribo-seq结果相关性分析。皮尔逊相关系数0.85，说明对RNA 3’端的测序可以较好的代表全长RNA的表达量。
图2中的F图为转录组测序(RNA-seq)与蛋白质谱的相关性，结果显示，相关性较低。
图2中的G图为3’Ribo-seq与蛋白质谱结果的相关性。通过比较F、G图发现，3’Ribo-seq与蛋白质谱的相关性明显高于转录组与质谱的相关性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法及其应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad1)
<400> 1
cgacgtacca gattacgctc crgrgrg 27
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad2-1)
<400> 2
ccgcacgcta actagtgtcg ctgatcgtnn nnnnnntttt tttttttttt tttttttvn 59
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad2-2)
<400> 3
ccgcacgcta actagtgtcg actctcgann nnnnnntttt tttttttttt tttttttvn 59
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad2-3)
<400> 4
ccgcacgcta actagtgtcg tgagctagnn nnnnnntttt tttttttttt tttttttvn 59
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad2-4)
<400> 5
ccgcacgcta actagtgtcg gagacgatnn nnnnnntttt tttttttttt tttttttvn 59
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad2-5)
<400> 6
ccgcacgcta actagtgtcg cttgtcgann nnnnnntttt tttttttttt tttttttvn 59
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad2-6)
<400> 7
ccgcacgcta actagtgtcg ttccaaggnn nnnnnntttt tttttttttt tttttttvn 59
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad2-7)
<400> 8
ccgcacgcta actagtgtcg cgcatgatnn nnnnnntttt tttttttttt tttttttvn 59
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad2-8)
<400> 9
ccgcacgcta actagtgtcg acggaacann nnnnnntttt tttttttttt tttttttvn 59
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad2-9)
<400> 10
ccgcacgcta actagtgtcg cggctaatnn nnnnnntttt tttttttttt tttttttvn 59
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad2-10)
<400> 11
ccgcacgcta actagtgtcg atcgatcgnn nnnnnntttt tttttttttt tttttttvn 59
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad2-11)
<400> 12
ccgcacgcta actagtgtcg gcaagatcnn nnnnnntttt tttttttttt tttttttvn 59
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad2-12)
<400> 13
ccgcacgcta actagtgtcg gctatcctnn nnnnnntttt tttttttttt tttttttvn 59
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad2-bio)
<400> 14
ccgcacgcta actagtgtcg 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Ad1k)
<400> 15
cgacgtacca gattacgctc c 21
<210> 16
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(gAd3-P5-1)
<400> 16
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctctattcg tcggcagcgt cagatgtgt 59
<210> 17
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Long-Ad2-P7-1)
<400> 17
caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacagccgc acgctaacta gtgtcg 86

Claims (8)

1.一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用Ribosome profiling技术，通过超高速梯度密度离心，分离核糖体-RNA复合物；分离纯化RNA；构建测序文库、结合3’端测序技术对纯化后的每条RNA的3’端进行测序。
2.根据权利要求1所述的一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述构建测序文库、结合3’端测序技术对纯化后的每条RNA的3’端进行测序步骤包括利用带Oligo dT的磁珠提纯mRNA，然后基于SMART反转录原理进行RNA反转录；之后，获取cDNA双链；Tn5酶切，富集RNA 3’端；以回收的3’端产物为模板，扩增纯化获得300-600bp的文库；测序，间接量化蛋白表达水平。
3.根据权利要求2所述的一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述基于SMART反转录原理进行RNA反转录步骤中涉及的引物序列包括：
Ad1 cgacgtaccagattacgctcc/rG//rG//rG/；
Ad2-1 ccgcacgctaactagtgtcgCTGATCGTNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-2 ccgcacgctaactagtgtcgACTCTCGANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-3 ccgcacgctaactagtgtcgTGAGCTAGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-4 ccgcacgctaactagtgtcgGAGACGATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-5 ccgcacgctaactagtgtcgCTTGTCGANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-6 ccgcacgctaactagtgtcgTTCCAAGGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-7 ccgcacgctaactagtgtcgCGCATGATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-8 ccgcacgctaactagtgtcgACGGAACANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-9 ccgcacgctaactagtgtcgCGGCTAATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-10 ccgcacgctaactagtgtcgATCGATCGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-11 ccgcacgctaactagtgtcgGCAAGATCNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-12 ccgcacgctaactagtgtcgGCTATCCTNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN。
4.根据权利要求3所述的一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述基于SMART反转录原理进行RNA反转录步骤中涉及的反应体系包括：2.75ul RNA，0.5ul Ad2引物(50uM)，0.5ul dNTP(10mM)；置于65℃变性5分钟，然后放回冰上超过1分钟；之后，向其中加入RNase inhibitor(40U/ul)0.25ul，SuperScript IV first-strandbuffer(5X)2ul，DTT(100mM)0.5ul，Betaine(5M)2ul，氯化镁(1M)0.06ul，Ad1引物(50uM)1ul，SuperScript IV reverse transcriptase(200U/ul)0.5ul；所述Ad2引物为权利要求3中所述的Ad2-1至Ad2-12引物中的一条。
5.根据权利要求4所述的一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述基于SMART反转录原理进行RNA反转录步骤中至少涉及12个样品或12的倍数的样品；RNA反转录完成后，将反转后的体系，每12份混合一份，获取cDNA双链。
6.根据权利要求5所述的一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于：获取cDNA双链的步骤包括：以15ul混合后的混合液为反应模板，KAPA mix(DNA聚合酶)25ul，Ad1k与Ad2-bio为前、后引物各1ul，补水至50ul；反应条件是：95℃变性3min，98℃20s，67℃15s，72℃6min，以上三个温度阶段共循环18次，然后72℃延伸5min；所述Ad1k与Ad2-bio序列为：
Ad2-bio ccgcacgctaactagtgtcg；
Ad1k cgacgtaccagattacgctcc。
7.根据权利要求6所述的一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述以回收的3’端产物为模板，扩增纯化获得300-600bp的文库步骤中涉及的引物包括gAd3-P5-1:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGT；
Long-Ad2-P7-1:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCCGCACGCTAACTAGTGTCG。
8.如权利要求1-7任一所述的一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法在对蛋白质表达丰度的评估和/或测定中的应用。
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