CN103898207A - 自杂交多重靶核酸探针及其使用方法 - Google Patents

自杂交多重靶核酸探针及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了靶核酸序列的探针，以及使用所述探针检测感兴趣靶核酸序列存在与否的方法。本发明的探针包括两个或两个以上的探测区域。所述探针还包括多重自身互补序列，所述自身互补序列在一个或多个所述靶序列不存在时互相杂交在一起，所述探针还可以选择性的包括一个或多个感兴趣的臂序列、间隔序列或标记物。

Description

自杂交多重靶核酸探针及其使用方法
本申请是申请日为2004年7月30日的第200480028546.2号发明名称为“自杂交多重靶核酸探针及其使用方法”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及检测和鉴定具有感兴趣序列的核酸的探针。更具体地，本发明涉及具有多重探测区域和自身互补或自退火序列的核酸探针。
背景技术
特定核酸的检测是诊断学和分子生物学研究的重要工具。目前核酸鉴定在以下方面起着重要作用：鉴定感染性生物体如细菌和病毒；检测正常基因的表达和鉴定突变基因如癌基因；组织移植前的组织相容性分型；法医组织样品或血样配型以及考察来自不同种基因间的同源性。
决定核酸特征的“金标准（gold standard）”是感兴趣核酸的序列。虽然有几种直接测序核酸的不同方法，但是所述方法中多数仍然很麻烦，要得到核酸序列需要花费长期的时间。考虑到时间和费用，已经开发出通常应用多种核酸探针和策略的、可选的直接测序方法。然而这些方法常常不尽如人意，因为它们不能分辨亲缘关系接近的序列或因等位基因的不同组合而产生的不确定性（ambiguities）。
组织分型、亲自鉴定和疾病关联（disease association）的主要焦点集中在人类白细胞抗原（HLA）基因上。所述HLA等位基因是人类基因组中最多样的抗原系统，差不多编码数百等位基因，所述等位基因分成几个独立的亚组或亚家族。但是DNA分型的标准技术常被证明不足以分辨许多上述重要等位基因。能揭示上述基因多样性的技术如序列分析不仅很少，而且昂贵耗时。
HLA分型中的显著障碍是不确定组合，所述不确定组合源于基因重组造成的多态性起源性质。不能分辨杂合子中的顺/反序列簇的不确定性是使用如序列特异性寡核苷酸探针或测序碱基分型等技术中的主要限制。解决上述问题的方案之一是通过克隆技术分离每个具体的等位基因。但是当处理大量样品时上述方案不切实际。其他途径，如增加特异性扩增的数量，也存在缺点，因为它们仍然常常不能处理组内不确定性（intra-group ambiguities）。
因此仍然需要能检测和鉴定特异核酸，特别是亲缘关系接近的序列的方法和探针。
发明内容
本发明的一个实施方式提供了一种核酸探针，包括：
（a）对第一靶序列特异的第一探针区域；和
（b）对第二靶序列特异的第二探针区域，其中：
（i）第一探针区域和第二探针区域不连续，第一靶序列和第二靶序列不连续，或者第一探针区域和第二探针区域与第一靶序列和第二靶序列都不连续；和
（ii）所述核酸探针包括自身互补序列（self-complementarysequences）。
对核酸探针而言，第一靶序列和第二靶序列可以是在相同靶核酸或者不同靶核酸上。在上述及其它的实施方式中，所述探针能将同时包括第一靶序列和第二靶序列二者的靶核酸从不同时包括第一靶序列和第二靶序列二者的核酸区别出来。在某些实施方式中具有两个或四个自身互补序列。在另外一些实施例中，第一探针区域和第二探针区域都不包括至少部分自身互补序列。同样地，自身互补序列都不能位于第一探针区域和第二探针区域之间。
本发明的一些探针，其第一探针区域和第二探针区域的至少一个区域包括至少一个自身互补序列的部分。上述实施方式中的一些只在第一探针区域和第二探针区域的一个区域包括一个自身互补序列。一些探针第一探针区域至少包括自身互补序列之一的部分，并且第二区域至少包括另一自身互补序列的部分。在一些探针中，第一探针区域的自身互补序列与第二探针区域的自身互补序列至少部分互补。在另外的探针中，第一探针区域的自身互补序列与第二探针区域不互补；而第二探针区域的自身互补序列与第一探针区域不互补。
本发明的探针还可以任选地包括间隔区部分，该间隔区部分将第一探针区域和第二探针区域分开。所述间隔区部分可以部分或者全部由一个或多个核酸构成。核酸探针还可以任选地包括一个或多个臂序列（arm sequence），所述臂序列构成部分一个或多个自身互补序列，其中一个或多个臂序列不包括所述探针区域。在所述探针中，一个或多个臂序列的一个或多个自身互补序列，与至少部分位于探针区域之一中的自身互补序列互补。在一些探针中，所述一个或多个臂序列中的第一个臂序列的第一自身互补序列与所述一个或多个臂序列中的第二个臂序列的第二自身互补序列互补。一些探针中，一个或多个臂序列的一个或多个自身互补序列中的至少一个自身互补序列与间隔区部分的至少一部分互补。
所述探针还可以包括一个或多个可测标记物，所述可测标记物可以相同也可以不同。所述标记物可结合于核酸探针的末端，或者可共价结合于核酸探针中的核苷酸。在一些探针中，可测标记物共价结合于核酸探针的间隔区部分。所述可测标记物可以包括接头基团如氨基接头，所述接头基团共价结合于核酸探针。所述标记物的实例包括荧光分子、发光分子、固体表面、支持物、珠、放射性部分等等。
在本发明的探针中，第一探针区域和第二探针区域可以具有不同或相同序列。对于某些探针，第一靶序列和第二靶序列是基序，而所述靶核酸是等位基因，因此第一靶序列和第二靶序列是在同一等位基因上的基序。一些所述探针不包括荧光猝灭部分（quencher moiety）。
本发明提供的探针还可以是阵列形式，定位在固体支持物上的确定的、分离的位置上。阵列的每一确定的、分离的区域典型地具有大量相同探针。在一些阵列中，大量核酸探针的一种或多种附着在固体支持物上，或者被容纳在固体支持物的孔中。另外一些阵列中，在固体支持物上不同的、确定的、分离的位置上的所述核酸探针具有一个或多个不同探针区域、一个或多个相同探针区域或所有相同的探针区域。一些阵列被提供在玻璃或塑料支持物或多孔板上。
本发明的探针可以用于任何可采用核酸探针的方法中。上述方法之一涉及检测在一种或多种靶核酸上的一种或多种靶序列，该方法包括：
（a）将一种或多种核酸探针与推测含有一种或多种靶核酸的样品接触；和
（b）检测第一探针区域和第二探针区域的一种或多种是否结合了它们各自的靶序列。
该方法还可以包括：
（c）在（a）步骤前扩增推测含有一种或多种靶核酸的样品中的核酸；和/或
（d）从推测具有靶核酸的实验对象中得到核酸样品。
本发明还提供了包括所述探针的试剂盒。
具体地，本发明提供以下实施方式。
第1项：一种核酸探针，包括：
（a）对第一靶序列特异的第一探针区域；和
（b）对第二靶序列特异的第二探针区域，
其中：
（i）第一探针区域和第二探针区域不连续，第一靶序列和第二靶序列不连续，或者第一探针区域和第二探针区域及第一靶序列和第二靶序列都不连续；和
（ii）所述核酸探针包括自身互补序列。
第2项：如第1项所述的核酸探针，其中，所述第一靶序列和第二靶序列在同一靶核酸上。
第3项：如第2项所述的核酸探针，其中，所述核酸探针能将同时包括第一靶序列和第二靶序列二者的靶核酸从不同时包括第一靶序列和第二靶序列二者的核酸区别出来。
第4项：如第1项所述的核酸探针，其中，所述第一靶序列和第二靶序列在不同靶核酸上。
第5项：如第1项所述的核酸探针，其中，存在两个或四个自身互补序列。
第6项：如第1项所述的核酸探针，其中，所述第一探针区域和第二探针区域都不包括至少部分的自身互补序列。
第7项：如第1项所述的核酸探针，其中，所述自身互补序列无一位于第一探针区域和第二探针区域之间。
第8项：如第1项所述的核酸探针，其中，第一探针区域和第二探针区域至少其中之一包括至少部分的所述自身互补序列之一。
第9项：如第1项所述的核酸探针，其中，第一探针区域和第二探针区域中只有其中之一包括所述自身互补序列之一。
第10项：如第1项所述的核酸探针，其中，所述第一探针区域至少包括所述自身互补序列之一的部分，并且所述第二探针区域至少包括另一所述自身互补序列的部分。
第11项：如第10项所述的核酸探针，其中，所述第一探针区域的自身互补序列与所述第二探针区域的自身互补序列互补。
第12项：如第10项所述的核酸探针，其中，所述第一探针区域的自身互补序列与所述第二探针区域不互补并且所述第二探针区域的自身互补序列与所述第一探针区域不互补。
第13项：第1项所述的核酸探针，还包括：
（c）将第一探针区域和第二探针区域分开的间隔区部分。
第14项：如第13项所述的核酸探针，其中，所述间隔区部分包括核酸。
第15项：如第1项所述的核酸探针，还包括：
（d）一个或多个包括一个或多个自身互补序列的臂序列，其中，所述一个或多个臂序列不包括所述探针区域。
第16项：如第15项所述的核酸探针，其中，所述一个或多个臂序列的一个或多个自身互补序列与至少部分位于所述探针区域之一内部的自身互补序列互补。
第17项：如第15项所述的核酸探针，其中，所述一个或多个臂序列中的第一个臂序列的第一自身互补序列与所述一个或多个臂序列中的第二个臂序列的第二自身互补序列互补。
第18项：如第15项所述的核酸探针，其中，所述一个或多个臂序列的一个或多个自身互补序列中的至少一个自身互补序列与至少部分间隔区部分互补。
第19项：如第1项所述的核酸探针，还包括：
（e）一个或多个可测标记物，其中，一个或多个可测标记物可以相同或不同。
第20项：如第19项所述的核酸探针，其中，所述可测标记物共价结合于所述核酸探针的末端。
第21项：如第19项所述的核酸探针，其中，所述可测标记物共价结合于所述核酸探针中的核苷酸。
第22项：如第19项所述的核酸探针，其中，所述可测标记物共价结合于所述核酸探针中的间隔区部分。
第23项：如第19项所述的核酸探针，其中，所述可测标记物包括接头基团，其中，所述接头基团共价结合于所述核酸探针。
第24项：如第23项所述的核酸探针，其中，所述接头基团包括氨基接头。
第25项：如第19项所述的核酸探针，其中，所述可测标记物为荧光分子。
第26项：如第19项所述的核酸探针，其中，所述可测标记物为珠。
第27项：如第26项所述的核酸探针，其中，所述珠为乳胶或聚苯乙烯珠。
第28项：如第1项所述的核酸探针，其中，所述核酸探针附着在固体支持物上。
第29项：如第1项所述的核酸探针，其中，所述第一探针区域和第二探针区域具有不同的序列。
第30项：如第1项所述的核酸探针，其中，所述第一探针区域和第二探针区域具有相同的序列。
第31项：如第1项所述的核酸探针，其中，所述第一靶序列和第二靶序列为基序并且所述靶核酸为等位基因，而且其中所述第一靶序列和第二靶序列为同一等位基因的基序。
第32项：如第25项所述的核酸探针，其中，所述核酸探针不包括荧光猝灭剂部分。
第33项：一种核酸探针阵列，包括定位在固体支持物的确定的、分离的位置上的大量的第1项所述的核酸探针中的一或多种。
第34项：如第33项所述的核酸探针阵列，其中，所述大量核酸探针的一或多种被附着在固体支持物上。
第35项：如第34项所述的核酸探针阵列，其中，所述大量核酸探针的一或多种位于固体支持物的孔中。
第36项：如第33项所述的核酸探针阵列，其中，位于所述固体支持物上的不同的、确定的、分离的位置上的所述核酸探针具有一个或多个不同的探针区域。
第37项：如第33项所述的核酸探针阵列，其中，位于所述固体支持物上的不同的、确定的、分离的位置上的所述核酸探针具有一个或多个相同探针区域。
第38项：如第37项所述的核酸探针阵列，其中，所述大量核酸探针的一或多种具有相同的探针区域。
第39项：如第33项所述的核酸探针阵列，其中，所述固体支持物为玻璃或塑料。
第40项：如第33项所述的核酸探针阵列，其中，所述固体支持物为多孔板。
第41项：一种检测一个或多个靶核酸上一个或多个靶序列的方法，包括：
（a）将一或多种第1项所述的核酸探针与推测含有一或多种靶核酸的样品接触；和
（b）检测一种或多种所述第一探针区域和第二探针区域是否结合它们各自的靶序列。
第42项：如第41项所述的方法，还包括：
（c）在（a）步骤前扩增推测含有一或多种靶核酸的样品中的核酸。
第43项：如第42项所述的方法，还包括：
（d）在（c）步骤前从推测具有靶核酸的实验对象中得到核酸样品。
第44项：一种检测一个或多个靶核酸上的一个或多个靶序列的试剂盒，包括一或多种第1项所述的核酸探针以及使用该一或多种核酸探针检测一个或多个靶核酸上一个或多个靶序列的说明书。
第45项：如第44项所述的试剂盒，还包括用于检测一种或多种靶序列的一种或多种试剂。
本发明的其他目的、特征和优点将通过下列详细描述而十分清楚。
附图说明
图1图示的是本发明的探针的构型；
图2图示的是本发明的另一种探针的构型；
图3图示的是本发明的探针的构型，其中由自退火结构形成两个环（loops）；
图4图示的是本发明的探针的构型，其中该探针序列包括自退火序列；
图5图示的是本发明的探针的构型，其中该探针序列不包括自退火序列。
具体实施方式
本发明涉及核酸探针，所述核酸探针可以用于多种方法，但是特别用于检测特定靶核苷酸序列的存在。本发明提供的核酸探针包括两个或两个以上探针区域，如对第一靶序列具有特异性的第一探针区域和对第二靶序列具有特异性的第二探针区域，以及自身互补区域。所述探测区域的构型不受特定限制。通常，第一探针区域会在第二探针区域上游，例如核酸中第二探针区域的5’端；那么，第二探针区域在第一探针区域的下游，例如第一探针区域的3’端。所述探针区域可以与它们各自的靶序列相互独立的杂交。第一探针区域和第二探针区域可以连续，条件是探针区域的靶序列不连续，或者它们可以被间隔区分开。在一些实施方式中，所述探针区域和对它们具有特异性的靶区域不连续。探针区域还可以对单一核酸上的靶序列具有特异性，或者探针区域能靶向不同靶核酸上的序列。正如这里用到的，靶核酸是包括一个或多个靶序列的核酸。因此，每一核酸探针可以具有一个或多个靶核酸。当两个或两个以上靶序列在同一核酸上，所述探针区域和靶序列之间的杂交会协同性增加。只要探针区域对各自的靶序列具有特异性，探针区域的长度没有特别的限定。实际上，当靶序列存在时，探针区域应该结合靶序列；而当靶序列不存在时，所述探针的自退火序列应该退火结合在一起。在一些情况中，探测区域的长度相同，而在另外的情况中，探测区域的长度不同。作为常用的方针，探针区域的长度可以为7到30个核苷酸或更长，如9-21或12-16个核苷酸。不过，本领域技术人员可以认识到，不同核苷酸长度的探针区域也包括在本发明内。
探针区域可以被设计结合任何适合构型中的靶序列。通常此过程包括有义-反义构型（sense-antisense configuration）核酸的杂交，即核酸链的5’末端与互补核酸的3’末端配对。本发明的探针还考虑到非典型结合构型，在这些构型中，所述序列的3’或5’“末端”位于探针的内部即探针的中心部分（centersection），而不是接近探针的末端。每一探针序列可以与其靶序列从5’到3’或从3’到5’互补。所述排列在US5914230中得到了描述，通过附图进行了具体的描述，该专利的全部内容并入作为参考。本发明的探针具有探测区域，所述探测区域为相同或不同的序列。在所述探测区域相同的情况下，所述核酸探针可以用于探测重复序列，如串联重复序列。在一些实施方式中，核酸探针可包括第三、第四、第五、第六等等探测区域，所有上述区域都具有相同的序列，以便使重复序列得以检测和/或量化。所述探针还可以包括上述数量的具有不同序列的探测区域。
本领域技术人员能够认识到，所述探测区域的鉴定取决于待测靶核酸序列。因此，所述探针序列可以具有有义或反义构型。当探针区域与不同靶分子中的靶序列互补时，每一探针区域可以与有义或反义靶序列互补，与其他探针区域的方向无关。此外，探针区域的方向可以是5’-3’串联5’-3’,或者5’-3’串联3’5’。特异性探针的靶核酸并没有特别的限定。当靶核酸在同一核酸上时，所述靶核酸可以连续，或者可以由一个或多个（如2-5个）直至300个或更多的核苷酸互相间隔开。同样道理，靶核酸的来源也没有特别的限定，例如可以从感兴趣的个体上得到、可以合成或从保藏处（depository）获得。在一些实施例中，靶序列为具体的基序（motif）。所述基序可以在同一等位基因上，这样第一靶序列和第二靶序列为同一等为基因上的基序。
虽然探针区域通常由核酸序列组成，但是所述核酸序列可以为任何适合的部分或分子，所述部分或分子特异于任何给定核苷酸序列或特征，如非配对碱基、错配碱基对或可选核酸结构。因此可以预见到本发明的探针可以包括探测区域，该区域由蛋白、肽、抗体或其他功能片段组成，并结合特异序列或特征。
自身互补序列是包括在单个分子或核酸内（“自我”方面）的序列，所述序列之间互补，因此它们能在合适的杂交条件下相互结合。所述杂交条件如：自身互补序列的解链温度以下和/或靶序列不存在。本发明探针的自身互补序列区域允许探针的不同部分在一定条件下互相退火，所述条件如在自身互补序列解链温度以下的温度，或者在靶序列不存在的条件下。通常所述探针包括偶数的自身互补序列，如两个、四个或者更多，因为它们互相配对；但是所述探针也可以包括奇数互补序列，其中一个自身互补序列与另外两个自身互补序列互补。所述探针内自身互补序列的数目和位置没有特别的限定。例如，一个或多个自身互补序列可以部分或全部包含于探针区域中、部分或全部包含于分隔探针区域的间隔区（spacer）中、部分或全部包含于所述探针的远端臂区域、或（如果需要）以上各种实施方式的组合。在一些实施方式中，探针区域不含自身互补序列部分。在另外的实施方式中，至多所述探针区域之一至少部分含有自身互补序列之一。一些探针中，第一探针区域和第二探针区域只有其中之一含有自身互补序列之一。在这一实施方式中，其他自身互补序列探针区域位于任一探针区域之外。同样，自身互补序列可以不在分隔探针区域的间隔区中的任一或全部中。在一些实施方式中，自身互补序列的长度为3、4、5、6、7、8或9个核苷酸。
自身互补序列之间的配对排列（pairing arrangement）没有限制。因此，探针、间隔区或臂区域中的一个自身互补序列，可以和探针、间隔区或臂区域中的另一自身互补区域互补，并且可能与之退火。这类互补构型的实例包括：探针-探针、探针-间隔区、探针-臂、间隔区-间隔区、臂-臂、它们的组合和它们反向构型的组合。自身互补序列还可以跨越并部分包括在探针的两个不同部分中。所述自身互补序列也可整体包括在探针的单一部分中。当自身互补序列整体包括在探针的一个部分（如探针区域、间隔区或臂）中时，则所述自身互补序列可以组成该探针部分的全部或仅一部分。
本领域技术人员能够明了，本发明探针的所述自身互补序列配对不应过强，以致于靶序列存在时探针区域不能与靶序列结合。避免上述并发情况的方法之一是设计自身互补序列，使该序列的解链温度和/或退火亲和力低于探针区域-靶序列的解链温度和/或退火亲和力。本领域技术人员能够认识到，上述参数可以按照需要更改，例如通过改变互补序列的长度和/或自身互补序列的G/C含量。在一些实施方式中，自身互补序列的长度、序列和GC含量均得到设计，使得这样自身互补序列的解链温度高于探针用于结合靶序列的温度7-10℃。这样的设计有助于确保自身互补探针在靶序类不存在时仍能退火。由于所述自身互补区域通过分子内杂交事件互补，因此它们的解链温度通常不能通过GC百分比法则准确预测。取而代之的是，DNA折叠程序（DNAfolding program）（如互联网上提供的Zuker折叠程序，网址：http：//bioinfo.math.rpi.edu/～mfold/dna/forml.cgi）可用于估算形成退火的自身互补序列的自由能，从中可以预测解链温度。
如果所述探针区域对单一核酸上的多于一个靶序列具有特异性，那么该探针区域能够将既包括第一靶序列又包括第二靶序列的靶核酸从不同时包括第一靶序列和第二靶序列的核酸中区别出来。本领域技术人员可以明白，不包括所有两个靶序列的核酸可以包括一个靶序列或不包括靶序列。所述核酸探针构型有助于区分杂合子中的顺/反不确定性。
所述核酸探针可以包括一个或多个间隔区部分（spacer moieties），所述间隔区部分位于任何探针区域和/或臂序列之间，不过间隔区的存在不是必需的。间隔区的存在造成所述探针区域的不连续。本领域技术人员能够理解，间隔区部分不应具有与位于第一靶序列和第二靶序列之间的靶核酸的区域互补的序列。优选地，间隔区不与靶核酸或样品中的其他核酸发生反应或相互干扰。所述间隔区可以为任何合适的原子或原子链，因此其化学性质没有特别的限定。在一些实施方式中，所述间隔区由核苷酸组成，如同聚核苷酸序列（homopolynucleotide sequence）。在一些实施方式中，所述间隔区区域可以为其他柔性（flexible）化学结构，如取代或非取代的碳原子数目适当的烷基或芳基基团、核糖或1’，2’-双脱氧核糖链。所述间隔区还可以为含碳或杂原子的支链或直链，例如含碳、氧、硫和/或氮的链。所述间隔区还可以包括肽或者为肽链。所述肽可以是天然发生的，也可以是根据需要非天然发生的如D-氨基酸。当间隔区是核苷酸序列时，该间隔区的长度可以为1至20个核苷酸，或者更多。在一些实施方式中，当间隔区位于探测区域和臂之间时，所述间隔区的长度可以为约10-20个核苷酸，如12-18个核苷酸或14-16个核苷酸。在其他的实施例中，所述间隔区在探测区域间，长度为3-9个核苷酸，如5个核苷酸。间隔区区域还可以位于臂序列和探针序列之间，以有助于防止它们各自之间的结合事件发生干扰。
本发明的探针包括一个或多个臂序列，不过它们也不是必需的。当臂序列存在时，所述臂序列由一个或多个自身互补序列组成，但并不是探针序列的部分。所述臂序列通常位于探针末端，例如它们不位于探针区域之间。一些实施方式中，本发明的核酸探针只包括一个单一的臂序列，该臂序列通常与间隔区序列的一部分和/或探针区域之一互补，所述探针区域之一可以为相对于臂序列较接近的或远端的探针序列。在其他的实施方式中，所述探针包括两个臂序列，所述两个臂序列互相之间至少部分互补，或与间隔区序列的一部分和/或探针区域之一互补。在其他实施方式中，部分或全部的一个或多个位于所述核酸探针臂部分之中的自身互补序列可以与部分或全部的间隔区部分互补。如此，一个或多个臂区域的全部可以与间隔区部分的部分互补，但这不是必需的。相似地，一个或多个臂区域的部分可以与间隔区部分的全部互补，但是这也不是必需的。在一些实施方式中，一个臂的全部可以与间隔区部分的全部互补。所述探针的臂序列长度仅限于在该探针中含有的臂序列必需仍然具有功能。通常探针的臂序列长度可以是四、五、六或七个核苷酸。富含GC的五碱基对的臂会在55至60℃解链，富含GC的六碱基对的臂会在60至65℃解链，富含GC的七碱基对的臂会在65至70℃解链。
这里臂序列是指类似于用于分子信标技术（molecular beacontechnology）中的臂或茎序列。见如：www.molecular-beacons.org；Bonne等人，Proc Natl Acad Sci USA96，pp.6171-6176，1999；Marras等人，Genet Anal14，pp.151-156，1999；Marras等人，Nucleic Acids Res30，p.E122，2002；Mullah等人，Nucleosides&Nucleotide18，pp.1311-1312，1999；Ortiz等人，Mol Cell Probes12，pp.219-226，1998；Tyagi等人，Nat Biotechnol18，pp.1191-1196，2000；Tyagi等人，Nat Biotechnol16，pp.49-53，1998；Tsourkas等人，Nucleic Acids Res31（4），p.1319，2003；Tsourkas等人，Nucleic AcidsRes30（19），p.4280，2002；Broude等人，Nucleic Acids Res29（19），p.e92，2001；以及Tyagi等人，Nat Biotechnol14，pp.303-308，1996。分子信标还在US5925517、US6037130、US6103476和US6150097中有描述。本发明的探针能够用于这些专利和出版物所描述的方法和化验中。
本发明一个实施方式中的探针包括分子信标，探针的远侧末端附着有一个或多个荧光团和一个或多个猝灭剂部分（quencher moieties）。但是本发明的一些探针不包括分子信标，因为它们不包括共价结合于探针的荧光和/或猝灭剂部分。由于本发明的一些探针不含猝灭剂和/或荧光团，因此它们不同于分子信标，不需要在靶序列不存在时，形成发卡结构（hairpin structure）。本发明的一些探针与分子信标的其他不同之处包括：
1、本发明的探针能够分辨均质的和非均质的系统；
2、本发明的探针可以与固相连接，所述固相如珠；
3、本发明探针的环可以包括探测序列，并且能够与茎臂（stem arm）结合或不结合；
4、任一臂序列可以结合探测序列；
5、臂序列可以与任何位点杂交，并且不限于结合其他末端，如不要求猝灭剂-荧光团相互作用；
6、本发明的探针的环可以包括一个或两个或两个以上靶序列；和/或
7、本发明的探针在自杂交时可以具有多个环。
本发明的探针还可以带有一个或多个可测标记物。例如可测标记物可以共价结合在核酸探针上，例如结合在探针的末端。所述可测标记物可以附加地或可选地共价结合于核酸探针上的任一核苷酸上，所述核苷酸包括臂序列、探针区域或间隔区区域上的核苷酸。本领域技术人员能够认识到，可测标记物部分在核酸探针上的位置没有特别的限定，不过所述标记物不会干扰所述探针区域与它们的靶序列结合，或者所述干扰能够被控制到最小值。在一些实施方式中，可测标记物包括接头基团，如氨基接头，所述接头基团共价结合于核酸探针。所述标记物不必共价结合在探针上，但是应该与探针相关联，这样所述标记物才能有助于显示靶结合存在与否。
当具有可测部分时，本发明的可测部分没有特别的限定。可测标记物的适合的实例包括荧光分子、珠、聚合物珠和荧光聚合物珠。聚合物珠可以由包括乳胶或聚苯乙烯在内的任何合适的聚合物构成。在一实施方式中，所述可测部分为荧光标记的珠（如微球），该珠具有特定荧光谱，因此能够用在
Figure BDA0000397540550000141
化验中。通常大量同样的探针可以附着于单个珠上。本发明还提供了具有附着有不同系列珠的不同探针区域组合的大量探针，所述不同系列的珠如荧光标记的珠。在提供多个探针和系列的珠的情况中，每一个珠或每一系列的珠可以具有独特的荧光标记物，所述标记物连有特定的探针，因此没有两种探针连接在相同的探测分子上。通常不同的珠或珠系列设有不同的荧光色比（color ratios），每一不同的荧光色比特异于大量寡聚核苷酸探针之一的一种。本发明还涉及制备或提供上述探针/珠（珠系列）的组合。
本发明核酸探针还可以附着在固体颗粒或支持物上。当核酸探针附着在固体支持物上，它既可以直接共价结合在固体支持物上，也可以通过接头，还可以通过媒介实体附着在固体支持物上。例如一核酸附着在固体支持物上，然后该附着的核酸与核酸探针的部分结合。
本发明还提供了位于固体支持物上确定的、分离的位置上本发明探针的阵列。一些实施方式中，所述探针附着在支持物的确定位置上。所述探针还可以包括在支持物的孔中。阵列的每一确定的、分离的位置上的区域通常具有大量相同探针。这里所用到的词“孔”只是为形容方便，并无限定之意。例如孔可以包括任何用于将核酸探针保持在固体支持物的确定的、分离的位置上的结构。非限定的孔的实例包括：凹陷、凹槽、有壁的环绕物等。在一些阵列中，不同定位的所述探针可以具有相同的探测区域，或者由相同的分子组成。上述实施方式用于检测多种来源的核酸是否包括相同的靶序列。所述阵列还可以在阵列的不同位置包括具有一个或不同探针区域的探针。所述实施方式用于从一种来源的核酸中检测多种靶序列。还可以提供所述阵列构型的组合，一些在确定位置中的探针包括相同的探针区域；而其他位置包括的探针具有对不同靶标特异的探针区域。任何合适的支持物都可以用于本发明的阵列，如玻璃或塑料；任何材料都可以进行处理或不进行处理，以有助于结合探针或者防止探针粘附。在一些实施方式中，支持物是多孔板；该多孔板允许所述探针不结合到支持物上，并且在溶液中游离。上述探针可以用于靶核酸序列的自动或高通量检测。可用于本发明的合适的阵列构型和适用的支持物在US6544790中进行了讨论。
在此，区域指核酸探针具有特定性质的部分。所述核酸探针可以由核苷酸或核酸序列组成，或者包含核苷酸或核酸序列。提及的不同序列指核苷酸或核酸序列。虽然本发明的探针通常在核苷酸序列中应用5种标准的核苷酸（A、T、G、C和U），不过，用于本发明的核苷酸或核酸的特征没有特别的限定。非标准的核苷酸和核苷酸类似物如肽核酸和锁核酸（locked nucleicacids）可以用于本发明。一些核酸类似物是本领域技术人员公知的（如见inRawls，C&E New Jun2，1997第35页；in Brown，Molecular Biology LabFax，BIOS Scientific Publishers Limited；Information Press Ltd，Oxford，UK，1991）。此外，序列里的碱基可通过磷酸二酯键以外的连键相连，所述连键如肽核酸，条件是所述键不干扰杂交。所述核酸类似物包括任意已知DNA和RNA的碱基类似物，例如但是不仅限于4-乙酰胞嘧啶（acetylcytosine）、8-羟基-N6-甲基腺苷（8-hydroxy-N6-methyladenosine）、吖丙啶基胞嘧啶（aziridinylcytosine）、假异胞嘧啶（pseudoisocytosine）、5-羧基羟基甲基尿嘧啶（5-（carboxyhydroxylmethl）uracil）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil）、5-溴尿嘧啶（5-bromouracil）、5-羧基甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶（5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil）、5-羧基甲基氨甲基尿嘧啶（5-carboxymethylaminomethyluracil）、二氢尿嘧啶（dihydrouracil）、次黄嘌呤（hypoxanthine）、肌苷（inosine）、N6-异戊烯腺嘌呤（N6-isopentenyladenine）、1-甲基腺嘌呤（1-methyladenine）、1-甲基假尿嘧啶（1-methylpseudouracil）、1-甲基鸟嘌呤（1-methylguanine）、1-甲基肌苷（1-methylinosine）、2,2-二甲基鸟嘌呤（2,2-dimethylguanine）、2-甲基腺嘌呤（2-methyladenine）、3-甲基胞嘧啶（2-methylcytosine）、5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine）、N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine）、7-甲基鸟嘌呤（7-methylguanine）、5-甲基氨甲基尿嘧啶（5-methylaminomethyluracil）、5-甲氧基-氨甲基-2-硫尿嘧啶（5-methoxy-aminomethyl-2-thiouracil）、beta-D-mannosylqueosine、5’-甲氧羰基甲基尿嘧啶（5’-methoxycarbonylmethyluracil）、5-甲氧基尿嘧啶（5-methoxyuracil）、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤（2-methylthio-N6-isopentenyladenine）、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯（uracil-5-oxyacetic acid methylester）、尿嘧啶-5-羟基乙酸（uracil-5-oxyaceticacid）、oxybutoxosine、2-硫胞嘧啶（2-thiocytosine）、5-甲基-2硫尿嘧啶（5-methyl-2-thiouracil）、2-硫尿嘧啶（2-thiouracil）、4-硫尿嘧啶（4-thiouracil）、5-甲基尿嘧啶（5-methyluracil）、N-尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯（N-uracil-5-oxyacetic acid methylester）、尿嘧啶-5-羟基乙酸（uracil-5-oxyacetic acid）、2-硫胞嘧啶（2-thiocytosine）、乳清酸（orotic acid）、2,6-二氨基嘌呤（2,6-diaminopurine）和AEGISTM碱基异胞嘧啶（isoC）和异鸟嘌呤（isoG）。AEGIS碱基可以特别用在本发明探针的自身互补序列中，所述自身互补序列不包括在探针区域内，因为自身互补序列不可能干扰探针与靶序列之间的结合。如此，所述探针可以包括DNA、RNA、以及它们的类似物或所述组分的混合物（嵌合体）。
通用核苷酸也可用在本发明探针的探针区域或序列、自退火区域或序列、间隔区区域或序列和/或臂区域或序列中，不过它们更优选不用在间隔区区域以防止间隔区区域中存在自身互补序列。这里用到的通用的核苷酸、碱基、核苷酸以及其他指一种分子，该分子能以相对无分别的或无偏好的方式，结合两个或两个以上（即3个、4个或全部5个）天然发生的碱基。在一些实施方式中，所述通用碱基如2’脱氧肌苷（肌苷）可以以上述方式结合全部天然发生的碱基。例如通用碱基能以相同的亲和力结合所有天然发生的碱基，所述通用碱基如3-硝基吡咯2’脱氧核苷（3-nitropyrrole2’-deoxynucleoside）（3-硝基吡咯）以及US5438131和US5681947中公开的通用碱基。通常当所述碱基为仅对天然碱基的亚组“通用”时，所述亚组通常为嘌呤（腺嘌呤或鸟嘌呤）或嘧啶（胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶）。能被认为对嘌呤通用的核苷酸实例为公知的“K”碱基（N6-甲氧基-2,6二氨基嘌呤），正如Bergstrom等人在Nucleic Acids Res.25：1935（1997）所讨论的；能被认为对嘧啶通用的核苷酸实例为公知的“P”碱基（6H,8H-3,4-二氢嘧啶[4,5-c][1,2]嗪-7-酮），正如Bergstrom等人（见上）和US6313286所讨论的。其他合适的通用核苷酸包括5-硝基吲哚（5-硝基吲哚-2’-脱氧核苷）、4-硝基吲哚（4-硝基吲哚-2’-脱氧核苷）、6-硝基吲哚（6-硝基吲哚-2’-脱氧核苷）或2’-脱氧水粉蕈素（2’-deoxynebularine）。通用核苷酸和天然碱基之间双链稳定性的部分顺序已被发现如下：5-硝基吲哚>4-硝基吲哚>6-硝基吲哚>3-硝基吲哚。所述通用碱基的组合也可根据需要应用。
附图中展示了本发明探针的几个非限定性的构型，其中臂代表自身互补区域外任一探针或间隔区区域，P1代表第一探针区域，P2代表第二探针区域，L代表任选的标记物，如珠，T1代表第一探针区域的靶序列以及T2代表第二探针区域的靶序列。图1-3图示了核酸探针的非杂交、自杂交和与靶序列杂交的状态。参考图1，所述探针构型包括通过间隔区分开的两个探测区域，图示为四个胸腺嘧啶核苷酸、一个附着于P2远侧末端的臂序列（所述臂序列与P1部分杂交）和通过接头基团附着在P1终末端的标记物。从该附图可以看出，当所述探针在不含靶序列的溶液中时，所述探针自杂交形成茎环（stem-loop）二级结构。当存在含有靶序列的核酸时，所述探针打开，并且P1和P2分别结合T1和T2。图2图示了一探针，该探针含有P1和P2，二者通过五个胸腺嘧啶核苷酸间隔区分开，在所述探针两末端上有两个臂序列，所述臂序列互为自身互补序列，标记物基团通过接头基团附着在间隔区中间的T上。类似于图1，当所述探针在不含靶序列的溶液中时，所述探针自杂交形成茎环二级结构。当含有把序列的核酸存在时，所述探针打开，并且P1和P2分别结合T1和T2。图3图示了另外一种构型，该构型包括如图2所示的相同元件，如通过五个胸腺嘧啶核苷酸间隔区分开的P1和P2，在所述探针两末端上有两个臂序列，所述臂序列互为自身互补序列，标记物基团通过接头基团附着在间隔区中间的T上。然而在上述探针构型中，臂基团与P1和P2内的序列互补，因此具有四个自身互补序列。在靶序列不存在的情况下，所述探针形成两个茎环结构，并在茎部分通过间隔区相连。在图3描述的实施方式中，两个茎区域可能可以互相独立的打开。在上述实施方式中，所述标记物可以从间隔区区域中移除，并且两个荧光团可以相同或者不同，一个、两个或两个以上猝灭剂部分可以附着在探针上，因此当所述探针自杂交时，它们可以非常接近得聚在一起。因此，上述单一探针可以起到两个分子信标的作用，并且显示靶序列的单独或同时结合。通常当所述探针作为双重分子信标时，荧光团是不同的，以便每一荧光团特异独立地鉴别出一个已知探针区域和其靶序列的杂交。预期一个猝灭剂部分可以同时猝灭两个荧光团，可以降低所述分子的复杂性。
图4和图5描述的探针构型没有标记物标记，并且探测不同核酸分子上的靶序列。在图4中，P1和P2包括自身互补序列，而在图5中，所述探针包括两个互相互补的臂序列。虽然上述两种探针构型都在靶序列不存在的情况下呈现了茎环二级结构，但是在图4中，所述探针区域位于茎部分，而图5中所述探针区域在环部分。正如图5所示，在探针区域和臂区域之间还可以存在间隔区。其他的探针构型和序列在实施例中展示。在附图中展示的一些探针也展示了跨越两个不同探针区域和序列的自身互补序列。
本发明还提供了应用这里所述的探针，检验一个或多个靶核酸上一个或多个靶序列的存在的方法。通常所述方法包括将一个或多个核酸探针与推测含有一种或多种靶核酸的样品接触，并且检测任一所述探针区域是否结合它们各自的靶序列。如上所述，所述探针可以在溶液中、可以在阵列中或结合在固体颗粒或支持物上。另外的方法还可以包括从推测具有靶核酸的实验对象中得到核酸样品；和/或在与所述探针接触之前，扩增推测含有一种或多种靶核酸的样品中的核酸。如果需要本发明的方法可以将这里描述的探针与任何其他已知或惯用的核酸探针一起使用。在本发明的一些方法中，所述探针可以用作核酸延伸反应的引物，例如单碱基延伸（single-base extension）或扩增反应。虽然核酸的核酸扩增常用于提供大量的样品，但是扩增不是必需的，本发明的探针能够直接与基因组核酸杂交。
在具体的方法中，本发明的探针用于区分核酸序列的不同之处，所述不同之处只在少数位置存在，如1、2、3、4或5个位置。在上述和其它方法中，本发明的探针还可以有助于分辨顺/反不确定性，特别是当所述方法用于分辨人白细胞抗原（HLA）分型或靶序列是HLA序列的情况下。
不限制本发明的范围，设计本发明的探针以便它们在适合的溶液中在没有靶核酸序列存在的情况下，本发明探针的自身互补序列会退火或互相杂交，以使探针呈现“闭合构型（closed configuration）”。上述闭合构型的实例包括由自杂交序列形成的茎和由杂交的茎之间的非杂交序列形成的环的多种组合。在一些实施方式中，所述环的长度可以为5-25个核苷酸，例如5、10、15、20或25个核苷酸。当存在靶核酸序列时，所述探针区域和靶序列之间的杂交与自杂交序列竞争。这种竞争反应被认为有助于探针特异性，并且特别有助于核酸中单碱基差异的辨别。设计所述探针以有利于探针区域和靶序列的杂交，因此当所述探针区域和靶序列一起存在时，所述探针经历构象变化（conformational transition）呈“开放”状态，在该状态下，一个或多个探针区域结合一个或多个靶序列。在一些实施方式中，所述探针可以设计成当只有一段靶序列存在时“开放”。在另外的实施方式中，所述探针可以被设计成只有当多于一个或所有靶序列和探针共同存在时“开放”。在一些实施方式中，所述向上述开放状态的转变导致荧光信号的产生，如在荧光团和猝灭剂不互相非常接近的位置。经验验证，已经发现，当所述自杂交探针的二级结构至少部分地保护了所述探针区域时，本发明的探针最为高效。
本发明的一些探针中，一个或多个探测区域可以至少部分包括在环内，因此所述探针区域被隐藏或避免与非靶序列进行非特异杂交。在其它的实施方式中，至少一个或多个探针区域的部分不位于茎或环中，因此上述探针区域更易结合靶序列。一旦所述探针区域结合其靶序列，则可以观察到其它探针区域的集中增强效应，即其他探针区域更易结合它们各自的靶序列。对于定位于定义明确的或保守的、通常较长的核酸序列附近的相对较短的靶序列或难于检测的序列，上述实施方式特别适用。
本发明的一些方法包括，将样品与如上所述附着有特异性标记荧光珠的一种或多种核酸探针接触。检测探针-靶杂交的报告分子也加入到反应中。所述报告分子可测出检测中结合的量级。所述报告分子可以通过粘附微球上所结合的探针-靶分子，显示反应的程度。在一些实施方式中，所述报告分子通过如荧光波长的颜色信号起作用，因此反应有两种颜色来源。一种色码用于珠或微球，用来鉴别粘附的探针；以及报告分子的颜色测量探针-靶的结合。所述报告分子可以在靶序列上，粘附于靶序列或可以粘附探针-靶杂交体。在一些实施方式中，所述报告分子可以是标记的抗体。
简而言之，在一些实施方式中，结合于探针的所述标记了颜色的微球、报告分子和样品混合。然后将上述混合物注入到仪器中，该仪器通常通过微射流技术，将上述微球排列成单列（single file），其中以光源如激光照射每一个微球的内部和表面的颜色。检测所述不同微球的颜色信号，所述信号可以翻译成鉴别信号，提供每个反应实时量化的数据。据此方面，可以多达100个或更多不同的探针同时对一个样品进行检测。可以与本发明探针一起使用的微球、仪器和技术的实例在下列文献中得到描述：US6524793、US6514295、US6449562、US6411904、US6366354、US6268222、US6139800、US6057107、US6046807、US5981180和US5736330；并且在Luminex公司有所提供（Austin，Texas）。在可选实施方式中，推测具有一个或多个靶序列的核酸可以粘附于发光珠，并且所述探针能在溶液中游离。当通过扩增得到推测具有一个或多个靶序列的核酸时，上述实施方式很容易完成。
通过本发明靶向的核酸没有特别的限定，可以通过或天然或合成的任意来源得到。在一些实施方式中，所述靶序列为多态性核酸序列，包括多态性等位基因。如上所述，靶核酸序列可以为DNA、RNA、及它们的类似物和它们的组合或嵌合体。因此所有可能的探针-靶构型都在本发明考虑之中，包括DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-DNA、RNA-RNA、嵌合体-DNA、嵌合体-RNA、DNA-嵌合体、RNA-嵌合体、嵌合体-嵌合体等。在一些实施方式中，靶核酸可从个体中获得，并且优选感兴趣个体基因组的等位基因。因此，本发明的方法可以用于提供个体的组织类型或基因型，其中个体是纯合或杂合的感兴趣等位基因。本发明的方法还可以用于同时检测来自不同个体的等位基因，如预定组织捐献者/接受者或亲子鉴定。在一些实施方式中，靶序列可以为两个或两个以上等位基因的库（pool），并在一些实例中可以为10、20、50、100、200个等位基因或者更多。因此优选的方法集中在HLA等位基因的鉴定上。HLA基因座的等位基因分为I类–HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G，或II类–HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB2-9、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DOA和HLA-DOB。已经鉴定出来落入一些上述基因座中的等位基因超过一百。所述等位基因亲缘关系很近，在序列中只有一个或一些的位点不同。所述HLA基因在Schreuder等人Tissue Antigens，58：109（2001）中及其中公开的文献中论述过，所有上述文献并入作为参考。有关HLA等位基因的其它信息以及具体的序列信息在www.ebi.ac.uk/imgt/hla和www.anthonynolan.org.uk/research.html上有提供。
其它优选靶序列包库那些编码杀伤细胞免疫球蛋白样受体（Killer-cellImmunoglobulin-like Receptors，KIR）和T细胞受体（T-cell receptors，TCR）。KIRs已经显示出等位基因和单倍型水平的高度多态性。KIR是免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF）成员，原称杀伤细胞抑制受体（Killer-cell Inhibitory Receptors）。它们由两个或三个免疫球蛋白结构域（Ig-domains）、跨膜区域和细胞质尾（cytoplasmic tail）组成，所述细胞质尾依次短（激活）或长（抑制）。编码KIR基因的所述白细胞受体复合体（Leukocyte Receptor Complex，LRC）表现出类似于主要组织相容性复合物（Major histocompatibility complex，MHC）的多态性、多基因和复杂。KIR和基因在下列文献中讨论：Marsh等人，Tissue Antigens62（1），pp.79-86，2003年七月；Gagne等人，Hum Immunol63（4），pp.271-280，2002年四月；Uhrberg等人，Immunogenetics54（4），pp.221-229，2002年七月；Bradshaw等人，Tissue Antigens61（2），pp.118-135，2003年二月；Koguri等人，MediatorsInflamm12（2），pp.213-221，2003年四月；Cook等人，Eur J Immunogenet30（3），pp.213-221，2003年六月；Yawata等人，Crit Rev Immunol22（5-6），pp.463-482，2002；
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mhc/MHC.cgi?cmd=aligndisplay&user_id=0&probe_id=0&source_id=0&locus_id=36&kit_id=0&banner=1和http://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/。
下面图示基序（motifs）的组合，一般以A和B表示不同的等位基因中的基序。
Figure BDA0000397540550000221
本发明的一些实施方式中，所述探针识别组合1（AB），但是不能识别其它组合。在整个说明书和附图中，A和B也可指T1和T2。组合2（--）通常和/或理论上不成问题，因为所述探针不与之结合。然而，组合3（A）和组合4（B）可以部分地结合针对AB的探针。
在其他的实施方式中，所述探针能够区分具有不同等位基因组合的样品，其中基序AB与其他无AB的等位基因共存。所述可能的等位基因组合表示如下。同时展示了可能的等位基因组合使用本发明的探针的预期结果。
Figure BDA0000397540550000222
通过使用合适的探针或探针的组合，本发明能完全区分所有上述多种组合。本发明的一些探针中，探针区域限于非线形构型以避免探针区域与部分系列的靶序列非特异性杂交。上述杂交在亚最佳条件（sub-optimal conditions）下会发生（如低温、高盐浓度）。避免非特异性杂交使信号噪音最小化。在特定条件下，例如当一个或两个靶序列存在时，探针的自身互补结合解体，所述探针区域与可利用的靶序列杂交。结果在一些实施方式中，与在同一分子上的靶序列杂交导致较高的解链温度（Tm），因而提供了最高的信号水平。与不同分子上的靶序列杂交导致较低的Tm，因而提供了较低的信号水平。与只有一个靶序列杂交进一步降低Tm以及信号水平。缺乏与靶序列的杂交导致“零”信号水平。因此本发明的一些探针能够区分所有本发明探针与其靶序列的可能的结合组合。
本发明还提供了完成这里所述方法的试剂盒（kits）。在一个实施方式中，所述试剂盒由一个或多个上述探针以及完成这里所述任一方法的使用说明书组成。所述说明书通过可实现的媒介，以任何可理解的方式提供。所述可实现的媒介如印刷在纸上、计算机可读介质或其他形式。本发明的试剂盒还可以包括一种或多种试剂、缓冲液、杂交介质、核酸、引物、核苷酸、标记物、分子量标记、酶、固体支持物、数据库、计算机软件和/或一次性实验室器材（如多孔板），以使本发明的方法更加方便的执行。固体支持物可以包括珠等等；而分子量标记可以包括可缀合的标记，如生物素和链霉抗生物素等。优选的试剂盒组分的实例可以在上述说明书中和下列实施例中找到。
无论是结合在支持物还是在溶液中，所述方法、试剂盒和本发明的组合物都可具体应用于快速、灵敏、可靠并通用的靶序列检测。所述靶序列为具体有机物的靶序列；所述有机物如病原体、细菌、病毒、真菌等，它们可以发现于食品、饮料、水、药物制品、个人护理产品、乳制品、环境样品、临床环境等。结果本发明的方法、试剂盒和组合物可具体应用于生产或储存食品、饮料、水、药物制品、个人护理产品、乳制品、环境样品的原料、设备、产品或加工过程分析。同样地，本发明的方法、试剂盒和组合物还可具体应用于临床样本或设备、用于治疗人或动物的固定设备或产品的分析。例如，所述检验可以用在检测靶序列，该靶序列特异于基于遗传的疾病，或者特异于基于遗传疾病的敏感性。非限定的疾病实例包括β-地中海贫血症、镰刀细胞贫血症、因子V莱顿症（Factor-V Leiden）、囊肿性纤维化以及癌症相关靶，如p53、p10、BRC-1和BRC-2。
另外的实施方式中，所述靶序列可以与染色体DNA相关，其中检测、鉴定或量化靶基因用于法医相关的如产前筛查、亲自鉴定、身份确认或犯罪鉴证。
本发明通过下列非限定性的实施例得到进一步详细说明。
实施例1
在此实施例中，下列探针用于检测HLA-A基因座在多种测试样品中是否存在：
Figure BDA0000397540550000241
本实施例中探针的氨基接头为：
Figure BDA0000397540550000242
本实例应用的探针中，氨基接头位于第一探针区域（探针一）的5’（上游）。第一探针区域与第二探针区域（探针二）通过5’-TTTT-3’接头相连。第二探针区域下游3’端附加共有的茎（臂）与第一探针区域内的5个核苷酸互补。在室温下所述探针自杂交形成环，防止第一探针序列的一半和第二探针序列的全部暴露。
材料和方法。
下列材料和方法用于本发明的实施例中。
探针与珠的链接
探针通过用水溶性碳二亚胺盐酸盐（EDC）共价连接在羧酸酯改性的聚苯乙烯珠上。从原液中取200微升（共2.5×106珠）离心并重悬于25微升浓度为0.1摩尔/升MES缓冲液中（pH4.5），然后加入1.0微升浓度为0.2纳摩尔/微升的[of what]和2.5微升的浓度10克/升的MES缓冲液（pH4.5），所述溶液在Eppendorf Thermomixer上以700转/分钟的转速，于黑暗处室温下涡旋孵育30分钟。再加入等量EDC，与所述溶液再混合30分钟。加入1.0毫升吐温20（Tween20）（0.02%体积比），涡旋溶液，然后以大约10000转每分钟的转速（～10000rpm）离心所述珠，接着加入1.0毫升浓度为0.1%的SDS（十二烷基硫酸钠），再次涡旋所得溶液并以大约10000转每分钟的转速（～10000rpm）离心。离心后，所述珠用珠最初体积一半的1X TE（pH8.0）重悬。
DNA样品
通过常规技术从样品提取DNA，所述样品来自国际组织相容性研究组（International Histocompatibility Workshops，IHW）细胞系组（cell linespanel）、美国加州大学洛杉机分校（UCLA）交换组（interchange panel）和本地可得的样品。
PCR扩增
用10皮摩尔（pmol）的每种基因座（125纳克DNA）、20毫摩尔/升（NH4）2SO4、84毫摩尔/升Tris碱、0.0125%吐温20（Tween20）、0.25毫摩尔/升各种dNTP、2.75毫摩尔/升MgCl2和1单位Taq聚合酶，在总体积25微升中进行PCR扩增。热循环条件为：95℃2分钟；95℃20秒进行35循环，64℃20秒和72℃45秒，并且在72℃下延伸5分钟。
杂交反应
5微升PCR扩增产物混以15微升珠混合物（约2微升TE珠混合液浓度为2000珠/ID/微升混于13微升杂交缓冲液（60毫摩尔/升柠檬酸钠，0.6摩尔/升NaCl）中）。杂交在热循环仪中进行条件如下：97℃10分钟，50℃20分钟，60℃10分钟。当杂交结束后，在热循环仪中60℃时每个样品加入170微升标记物溶液（SAPE）。样品得到稀释，并从热循环仪中移走，于室温下避光孵育5分钟。所得样品离心30秒除去上清液。约50微升样品剩余。加入70微升洗涤缓冲液（22.5毫摩尔/升柠檬酸钠、0.225摩尔/升NaCl），通过移液枪轻混所得样品，然后将它们转移到平板（plate）中，用Luminex系统阅读。
当基序AB存在时，预期探针产生阳性结果（背景上的平均荧光强度(mean fluorescent intensity，MFI)）；而当只包括A-、B-或--基序组合时，预期产生阴性结果。结果会被标记为阳性的点可用实验方法测量。一般当信号噪音比大于2时，认为结果是阳性。但是本领技术人员可以理解所述探针产生的信号噪音比在1至2之间仍在本发明的方法中有用。再者，个别实验阳性结果可以包括大于3的信号噪音比。
上述样品的结果在下表中表示。
HLA-A等位基因1 HLA-A等位基因2 基序组合 MFI
A*0101 A*6801 A-/-- 8
A*2501 A*2601 A-/AB 319
A*3201 A*680102 A-/-B 24
A*0301 A*3201 -B/-- 12
A*O101 A*2501 AB/-- 258
A*2501 A*3201 AB/-B 114
对照(噪音) 对照(噪音) PBS 2
如上表所示，通过MFI测量的实际杂交结果符合预期结果。在所有实施例中，表格的深色区域对应阳性杂交。
探针区域限于非线形构型，以避免探针区域与部分系列的靶序列在亚最佳条件下（如低温、高盐浓度）非特异性杂交，因此使信号噪音最小化。在特定条件下，探针区域打开，并且与可利用的靶序列杂交。结果与在同一分子上的A和B杂交导致较高的解链温度（Tm），因而提供了最高的信号水平。与不同分子上的A和B杂交通常降低Tm，因而提供了较低的信号水平。只与不同分子上的A或B之一杂交进一步降低了Tm和信号水平。既没有与A也没有与B杂交导致“零”信号水平。因此如上表所示，本实施例的探针设计能够基于信号强度，区分所有的结合组合。
在本实施例中，本发明的探针可以将在同一等位基因上含有全部两种靶序列的样品，从其它靶序列构型中区分出来。在本实施例中，信号噪音比的范围是从6到20。
实施例2
在本实施例中，下列探针用于检测多种测试样品当中HLA-A和HLA-DRB1两个基因座存在与否：
和
Figure BDA0000397540550000272
本实施例中探针的氨基接头为：
Figure BDA0000397540550000281
用于本实施例中的探针类似于图2所示的探针。在本实施例中，连接于胸腺嘧啶核苷酸的氨基接头置于间隔区的中间。所述间隔区因探针不同而为5’TTTTT3’或5’TTT3’。所述修饰允许将所述臂置于第一探针区域下游，所述第一探针区域与第二探针区域3’方向的半段互补，因此避免了在靶序列不存在的情况下，整个第一探针区域和第二探针区域暴露。上述样品的结果在下表中表示。
HLA-A等位基因1 HLA-A等位基因2 基序组合 MFI(第一探针)
A*0101 A*6801 A-/-- 17
A*2501 A*2601 A-/AB 320
A*3201 A*680102 A-/-B 32
A*0301 A*3201 -B/-- 16
A*0101 A*2501 AB/-- 281
A*2501 A*3201 AB/-B 122
对照(噪音) 对照(噪音) PBS 5
Figure BDA0000397540550000282
Figure BDA0000397540550000291
实施例3
在本实施例中，下列探针用于检测多种测试样品当中HLA-A和HLA-DRB1两个基因座存在与否：
Figure BDA0000397540550000292
和
Figure BDA0000397540550000301
和
Figure BDA0000397540550000302
和
Figure BDA0000397540550000303
其中接头（***）为：
Figure BDA0000397540550000304
本实施例中，所述接头为与实施例2位点相同的接头，用5’TTTTT3’作为间隔区，而且第一探针区域和第二探针区域的序列自己杂交形成环，这使得不需要附加的臂。上述实验结果如下表所示。
HLA-A等位基因1 HLA-A等位基因2 基序组合 MFI(第一探针)
A*0101 A*6801 A-/-- 23
A*2501 A*2601 A-/AB 759
A*3201 A*680102 A-/-B 58
A*0301 A*3201 -B/-- 31
A*0101 A*2501 AB/-- 834
A*2501 A*3201 AB/-B 563
Figure BDA0000397540550000312
Figure BDA0000397540550000322
Figure BDA0000397540550000331
用于本实施例中的探针类似于图3所示的探针。本实施例的第二和第三探针，探针的序列相同。区别只在臂的大小。在第二探针中，所述臂为6个核苷酸长；在第三探针中，所述臂为5个核苷酸长。在本实施例中，第三探针构型提供了被测探针构型的最高平均荧光强度，并且导致较高信号噪音比。这表明所述MFI至少部分依赖于臂的长度。
实施例4
在此实施例中，下列探针用于检测DRB1基因座在多种测试样品中是否存在：
Figure BDA0000397540550000342
和
Figure BDA0000397540550000351
其中接头（***）为：
Figure BDA0000397540550000352
在本实施例中所述接头与实施例2和实施例3的接头位点相同。将5’TTTTT3’或5’TTT3’作为间隔区，而且第一探针区域和第二探针区域的序列自己杂交形成环。正如本实施例中的第一探针所示，并不要求间隔区仅包括胸腺嘧啶核苷酸。实施例4中的探针大致图示了图2中的探针设计。实施例4探针的结果如下所示。
Figure BDA0000397540550000353
Figure BDA0000397540550000361
Figure BDA0000397540550000371
本发明的探针可以具有这里所描述的任意或全部的组分。同样地无论单独还是多种组合使用，本发明的方法都可以通过这里所描述的任何所述步骤完成。本领域技术人员能够认识到本发明的所有实施方式都能与这里所描述的其它本发明的合适的实施方式一起使用。此外，本领域技术人员可以认识到本发明的探针还包括多种本发明探针、构型及方法的变化。所述变化特别是除这里所述的一个或多个组分或步骤的变化。
本领域技术人员能够理解，出于任何的目的，特别是在提供书面说明书方面，这里所有公开的范围还包括任何和全部可能的附属范围及这些附属范围的组合。任何列举出的范围可以很容易被认为到是充分说明，并且能够支持同样的范围被至少等分、三等分、四等分、五等分、十等分。作为非限定实施例，这里讨论的每一范围可以被很容易的被分为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还能够理解到所有语言，如“达到”、“至少”、“高于”、“少于”、“多于”等类似的包括被引用的数目，如上所述指可以后来被分成亚范围的范围。同理，所有这里所公开的比例也包括落入宽比例的所有亚比例。
本领域技术人员还可以容易认识到在将成员以共同方式组合在一起时，如Markush组，本发明不仅包括作为整体的全组，而且包括所述组中的每一个成员个体，以及主组中所有可能的亚组。因此出于任何目的，本发明不仅包括主组而且包括缺失一个或多个组成员的主组。本发明还考虑了本发明所要求的一个或多个组成员中清楚的例外。
所有这里公开的文献、专利和出版物特别并入这里的参考文献。除非另外说明，“一个（种）”指“一个（种）或多个（种）”。
虽然优选实施方式已得到图解和描述，但是可以理解的是这里根据本领域普通技术不离开本发明下列权利要求中所限定较宽方面，可以进行的变化和修饰。
Figure IDA0000397540610000021
Figure IDA0000397540610000031

Claims (10)

1.一种核酸探针，包括：
（a）对第一靶序列特异的第一探针区域；和
（b）对第二靶序列特异的第二探针区域，
其中：
（i）第一探针区域和第二探针区域不连续，第一靶序列和第二靶序列不连续，或者第一探针区域和第二探针区域及第一靶序列和第二靶序列都不连续；和
（ii）所述核酸探针包括自身互补序列。
2.如权利要求1所述的核酸探针，其中，所述第一靶序列和第二靶序列在同一靶核酸上。
3.如权利要求2所述的核酸探针，其中，所述核酸探针能将同时包括第一靶序列和第二靶序列二者的靶核酸从不同时包括第一靶序列和第二靶序列二者的核酸区别出来。
4.如权利要求1所述的核酸探针，其中，所述第一靶序列和第二靶序列在不同靶核酸上。
5.如权利要求1所述的核酸探针，其中，存在两个或四个自身互补序列。
6.如权利要求1所述的核酸探针，其中，所述第一探针区域和第二探针区域都不包括至少部分的自身互补序列。
7.如权利要求1所述的核酸探针，其中，所述自身互补序列无一位于第一探针区域和第二探针区域之间。
8.如权利要求1所述的核酸探针，其中，第一探针区域和第二探针区域至少其中之一包括至少部分的所述自身互补序列之一。
9.如权利要求1所述的核酸探针，其中，第一探针区域和第二探针区域中只有其中之一包括所述自身互补序列之一。
10.如权利要求1所述的核酸探针，其中，所述第一探针区域至少包括所述自身互补序列之一的部分，并且所述第二探针区域至少包括另一所述自身互补序列的部分。
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