TWI388831B - 溶液中基因微陣列分析 - Google Patents

Description

溶液中基因微陣列分析

本發明係關於使用磁珠進行溶液中微陣列分析之方法。

DNA微陣列雜交曾被廣泛地用於研究基因功能及單一核苷酸多形性(SNP)。亦期待蛋白質微陣列及其他分析成為研究及診斷之重要工具。

習用微陣列分析採用固定有探針(諸如寡核苷酸)之微晶片。製備此等晶片有許多不同的途徑。舉例言之，Affymetrix Inc.成功地開發及上市由光子－引發之核苷酸列印(nucleotide printing)。另一途徑為修改寡核苷酸之化學結構以使其固定在晶片表面。UV交聯為固定寡核苷酸之另一方法。

大部分的微陣列雜交方法在晶片表面進行。由於幾何上之限制，表面上之雜交反應通常需要花費長時間(例如，大於10小時)才能完成。再者，由於其之低特異性，表面上之雜交非為檢測單一核苷酸多形性(SNP)之最佳分析。

本發明包括使用磁珠在溶液中進行微陣列分析之方法。在本發明之範圍內亦包括進行該方法之套組及系統。

本發明一態樣之特徵為使用磁珠在溶液中進行微陣列分析之方法。該方法包括下列步驟：(1)提供具有許多孔之盤；(2)將磁珠分散在此等孔中，此等磁珠上附接不同的探針，而附接於各個磁珠之探針則為相同；(3)施加磁力以將此等磁珠固定於此等孔之底部；(4)在此等孔中加入懷疑含有一種或多種目標分子之溶液；(5)移除磁力以允許此等目標分子(若存在)與此等探針在溶液中結合；(6)再施加磁力以使此等磁珠再次固定於此等孔之底部；(7)沖洗此等孔以移除游離分子；以及(8)偵測在此等孔之任一者中之信號，該信號指示此等目標分子之一與此等探針之一結合。

附接於磁珠之探針可為核酸(例如寡核苷酸)、蛋白質、多肽、適體(aptamer)、碳水化合物、糖蛋白、糖脂質或小分子。目標分子可為核酸、蛋白質、多肽、適體、碳水化合物、糖蛋白、糖脂質或小分子。目標分子可用可檢測粒子(例如金奈米粒子或帶電粒子)、染料分子或生物分子(例如抗體或生物素)標記，該等可檢測的物質接著可藉由諸如ELISA之分析檢測。

在另一態樣，本發明之特徵為用於進行上述溶液中微陣列分析之套組。該套組包括一多孔盤及放置在此等孔中之磁珠，此等孔之各個含有一個或多個磁珠。將不同的探針附接在此等磁珠上，而附接在各個磁珠上之探針則相同。再者，在各個孔中之磁珠以相同的探針被覆。

再一態樣，本發明之特徵為用於進行上述方法之系統。該系統包括：含有許多孔之盤(1)，此等孔可含有或不含磁珠；以及緊貼在該盤下方之磁鐵(2)。由磁鐵(例如永久性磁鐵或電磁鐵)所產生之磁力可輕易移除。在一實施例中，盤中之此等孔含有附接不同探針之磁珠，且各孔含有1個或多個附接有相同探針之磁珠。

本發明之一個或多個具體實施例之細節將於附圖及下文之說明中敘述。本發明之其他特徵、目的及優點從該說明及圖式以及從申請專利範圍中可顯而易知。

第一a圖顯示本發明之套組。該套組100包括具有複數個孔110之盤105，所有孔或其一部分中放置有複數個磁珠115。參見第一b圖。在不同孔110中之磁珠用不同的探針120被覆，同時在相同孔中之磁珠用相同的探針被覆。此等探針可藉由本技術已知的方法附接於磁珠上。舉例言之，磁珠之表面可用以3－馬來醯亞胺基苯甲酸N－羥基琥珀醯亞胺酯活化之胺基修飾。硫醇化之DNA探針然後經由與活化胺基反應而附接於經修飾之磁珠。

第一a圖亦顯示本發明之系統。該系統150可包括上述套組100及緊貼於其下方之磁鐵125。該磁鐵產生足以固定磁珠之磁力。該磁力可輕易移除。若使用永久性磁鐵，可藉由以物理方式從套組取走磁鐵而移除磁力。若使用電磁鐵，可按照習用方式藉由關閉產生磁力之磁場而移除磁力。另外，本系統可包括上述之套組但孔內未放置磁珠者。

第二圖例示說明本案之溶液中微陣列分析之具體實施例。該分析在盤之孔中進行。參見第二(a)圖。孔之直徑為1微米至數厘米，其視在分析中所進行之探針－目標分子間之結合反應之數目而定。孔之深度為數微米至數厘米，其視結合反應所需之溶液之體積而定。以在各孔中使用最小體積之溶液以節省成本為宜。

將被覆有不同探針之複數個磁珠置於孔中。見第二(b)圖。在相同孔中之磁珠以相同的探針被覆。此等探針可為核酸、蛋白質、多肽、碳水化合物、糖蛋白、糖脂質、適體(aptamer)或小分子。適體為與特異性目標分子結合之寡核酸或肽分子。其選自大型隨機序列池或從天然來源單離。

接下來，施加磁力，以將磁珠(諸如γ－氧化鐵珠或鈷珠)固定在孔之底部。見第二(c)圖。所施加之磁力之強度視特定分析中所用之磁珠及結合溶液之類型而定。其可用被覆有染料分子之磁珠預先決定。

然後，將懷疑含有一種或多種目標分子之檢體混合於或溶於結合溶液。該溶液必須能促使探針與目標分子結合。將含有檢體之結合溶液加至各孔中後，移除該溶液之任何溢流部分。在各孔中之溶液高度必須低於孔之邊緣，以致當移除磁力時，在不同孔中之磁珠不會混合。

移除磁力以懸浮磁珠後，探針與目標分子間之結合反應在溶液中進行。見第二(d)圖。將該盤於所示溫度下溫和地振搖以促使探針與目標分子間之結合。該結合溫度可根據各種因子決定，此等因子例如為所用之探針及待檢測之目標分子、該探針與該目標間之親和性或所需之嚴苛條件。當結合反應完全時，重覆施加磁力以使磁珠再度固定於此等孔之底部。結合於探針之目標分子因此亦被固定。見第一(e)圖。

從所有此等孔中洗除游離的目標分子後，測定孔中存在之任何被固定的目標分子。見第二(f)圖。一檢測方法為用可檢測的物質，諸如粒子(例如金粒子)、染料分子(例如Cy3或Cy5)或生物分子(例如抗體或生物素)，標記目標分子，該可檢測的物質接著可藉由諸如ELISA之分析檢測。在此等孔中可檢測物質之存在表示目標分子存在。可使用本技術已知之各種方法檢測上述可檢測物質之存在。例如可使用雷射掃描器檢測會產生雷射－誘發之螢光之染料分子。PC掃描器或數位相機可在進行或未進行銀染色下檢測金粒子(例如微米粒子或奈米粒子)。當使用生物分子標記目標分子時，可於該生物分子與可和其特異性結合之可檢測第二分子結合後，檢測該生物分子。例如，若使用生物素標記目標生物分子，則可用附接於金粒子之鏈黴抗生物素(strepavidin)經由與附接於目標分子之生物素結合而檢測被固定之目標分子之存在。

下文之特定實施例僅係為了例示說明，絕非以任何方式限定本揭示內容之其餘部分。咸信熟習本技術之人士在無需進一步努力下，可依據本文之說明充分利用本發明。本文所引用之所有刊物以參考文獻方式將其全文納入本文。

實施例1：附始於磁珠之寡核苷酸與信標(beacon)DNAs在溶液中之雜交

將具有下列序列之寡核苷酸：(1)5’－SH－AAAAAAAAAACATAGGTCTTAACTT－3’，(2)5’－SH－AAAAAAAAAACATAGGTGTTAACTT－3’，(3)5’－SH－AAAAAAAAAACATCGGTCTTAACTT－3’，以及(4)5’－SH－AAAAAAAAAAAGGTAACTTCATTCT－3’，與10－nm磁鐵奈米粒子結合，約有15個寡核苷酸分子附接於各奈米粒子(粒子－寡(1)、粒子－寡(2)、粒子－寡(3)及粒子－寡(4))。寡核苷酸(1)、(2)及(3)彼此相差一個核苷酸(如粗體字所示)。寡核苷酸(4)與其他寡核苷酸相較，包括多個核苷酸差異。

磁性奈米粒子之表面用藉由3－馬來醯亞胺基苯甲酸N－羥基琥珀醯亞胺酯所活化之胺基修飾。硫醇化寡核苷酸然後藉由與活化胺基反應而附接於經修飾之粒子。

分子信標1之序列為FAM－5’GCGAGAAGTTAAGACCTATGCTCGC－3’－DABCYL。FAM代表螢光部位以及DABCYL為消光(quencher)部位。分子信標1包括與寡核苷酸1互補之序列。

分子信標2之序列為FAM－5’GCGAGAAGTTAACACCTATGCTCGC－3’－DABCYL。

將上面附接有上述寡核苷酸之磁性奈米粒子置入盤中之微孔內。各孔含有1個或多個磁性奈米粒子，該等磁性奈米粒子上附接相同的寡核苷酸。施加電磁力以致將所有磁性奈米粒子固定在孔之底部上。然後，將含分子信標1或分子信標2之溶液加至此等孔之各個中，此二信標皆用FAM及DABCYL標記。以含100mM Tris－HCl(pH8)及1 mM MgCl₂ 之溶液誘使核酸雜交。移除任何溢流的溶液後，將電磁鐵之磁場關閉，以使磁性奈米粒子懸浮於該溶液中。附接於磁性奈米粒子之寡核苷酸然後與分子信標在溶液中雜交。雜交之實驗條件為：125pmol信標及25pmol目標核苷酸，該等溶於含1 mM MgCl₂ 之155μl 100 mM Tris－HCl(pH8)中。接著，再施加磁力以使磁性奈米粒子再度固定在孔之底部上。然後沖洗此等孔以移除任何不會與附接於磁性奈米粒子之寡核苷酸雜交之分子信標。最後，檢測及記錄在個別孔中之螢光信號。分子信標在494 nm激發以及於518 nm測量螢光信號。

在本實施例中使用游離寡核苷酸(1)作為對照組。重覆各雜交分析6次。

粒子－寡(1)與分子信標1間之雜交反應在30分鐘內完成(>90%)。該雜交速率和游離寡核苷酸(1)與分子信標1間之雜交反應之速率相同。

通常，完成習知的微陣列雜交反應，即將探針寡核苷酸固定在晶片之表面，花費超過10小時之時間。因此與習知的微陣列雜交分析相較，該方法增加雜交速率至少20倍。換言之，顯著減少完成該分析所需之時間。

來自本實施例之結果亦證明該方法為高度特異性。第一，粒子－寡(1)與分子信標2之雜交效率差，該分子信標2之序列與寡核苷酸(1)之序列不具有同源性。第二，粒子－寡(1)與分子信標1之雜交效率高，而粒子－寡(2)、粒子－寡(3)及粒子－寡(4)不與分子信標1雜交。注意寡核苷酸(2)及寡核苷酸(3)與寡核苷酸(1)只相差一個核苷酸。此等結果清楚表示該方法在識別單一核苷酸多形性(SNP)上具有高度效率。

該方法之可再現性亦高。在本實施例中之所有雜交反應均重覆6次，在所有複製之反應中得到相同結果。

實施例2：使用溶液中微陣列DNA雜交研究基因表現及SNP

將寡核苷酸固定在磁性奈米粒子上，其之尺寸小於150 nm。將此等磁性奈米粒子懸浮在促使DNA雜交之溶液中以及置於盤之微孔中，電磁鐵則緊貼在該盤之下方。置於各孔中之溶液之總體積為數奈升(nanoliter)至數微升(microliter)。磁性奈米粒子藉由打開電磁鐵之磁場而固定在孔之底部上。

從細胞中萃取出傳信RNA以及藉由使用此等mRNA作為模板以RT－PCR法製備目標cDNAs。此等cDNAs藉由本技術已知之方法以Cy3標記且溶於上述溶液中。然後將含目標cDNAs之溶液加入各孔中。移除任何溢流出之溶液後，將磁場關閉以允許磁性奈米粒子懸浮於該溶液中，以致寡核苷酸與目標cDNAs間之結合可在溶液中進行。在本實施例中使用與實施例1所述者相同的雜交條件。

完成雜交反應後，將磁場再次打開以使奈米粒子再次固定在孔之底部。將未與寡核苷酸雜交之目標cDNAs從各孔中洗除。然後藉由本技術已知之方法檢測在各孔中Cy3之信號。顯示信號之孔表示目標cDNA與附接於該孔中磁性奈米粒子之寡核苷酸雜交。依據該寡核苷酸之序列，將可知道在細胞中何種基因被表現。

亦使用上述方法研究SNP。在該例中，藉由待研究之SNP位點之PCR擴增而得到目標DNAs。所有其他程序與上述者相同。

實施例3：溶液中微陣列分析，其中目標DNAs以粒子標記

進行該溶液中微陣列分析之步驟與實施例1及2中所述者相同，惟目標DNA分子以金粒子標記。金粒子之信號可藉由銀－染色擴增。經擴增之信號然後可藉由PC掃描器檢測。見Taton,et al.,Science, 289：1757(2000)以及Alexandre et al.,Analytical Biochemistry ,295：1－8(2001)。顯示信號之孔表示目標DNA與附接於該孔中磁性奈米粒子之寡核苷酸雜交。

或者，將目標DNAs用生物素標記。此等目標DNAs藉由用以鏈黴抗生物素被覆之金粒子進一步標記而檢測。金粒子之信號藉由方才所述之方法檢測。

其他具體實施例

本說明書所揭示之所有特徵可以任何組合方式加以組合。本說明書所揭示之各特徵可藉由用於相同、對等或相似目的之另外特徵取代。因此，除非另外明白陳述，所揭示之各特徵僅是一系列對等或相似特徵之例子。

從上述說明，熟習本技術人士可輕易地確認本發明之必要特徵，以及可在不偏離本發明之精神及範疇下進行本發明之各種改變及修飾，以適合各種用途及條件。因此，其他具體實施例亦在本發明之範圍內。

100．．．套組

105．．．盤

110．．．孔

115．．．磁珠

120．．．探針

125．．．磁鐵

150．．．系統

第一a圖為套組之透視圖，其含有供進行溶液中微陣列分析之具複數個孔之盤，以及附有緊貼在該盤下方之磁鐵。

第一b圖為說明第一a圖所示之各孔含有磁珠且磁珠上附有探針之示意圖。

第二圖為顯示進行溶液中微陣列分析之方法之示意圖。

100．．．套組

105．．．盤

110．．．孔

125．．．磁鐵

150．．．系統

Claims (11)

1. 一種用於檢測懷疑含有一種或多種目標分子之溶液之微陣列分析套組，其中該目標分子標記有信號，其包括：具有複數個孔之盤；以及複數個磁性奈米粒子，在該等磁性奈米粒子上附接不同的探針，而附接於每一個磁性奈米粒子上之探針則相同；其中將該複數個磁性奈米粒子放置於該複數個孔中，且各孔含有一個或多個附接有相同探針之磁性奈米粒子；當將該懷疑含有一種或多種目標分子之溶液加入該等孔中時，該等磁性奈米粒子可分散懸浮於該溶液中，使該等目標分子(若存在)與該等探針在溶液中互相作用。
2. 如申請專利範圍第1項之套組，其中該附接於磁性奈米粒子之探針為核酸、蛋白質、多肽、適體、碳水化合物、糖蛋白、糖脂質或小分子。
3. 一種用於進行微陣列分析之系統，其包括：如申請專利範圍第1或2項之微陣列分析套組；以及緊貼於該盤下方之磁鐵，其中磁鐵產生磁力，該磁力可輕易地移除。
4. 如申請專利範圍第3項之系統，其中該磁鐵為永久性磁鐵或電磁鐵。
5. 一種用於檢測懷疑含有一種或多種目標分子之溶液之微陣列分析方法，其中該目標分子標記有信號，該方法包括：提供具有複數個孔之盤；將複數個磁性奈米粒子放置在該等孔中，該等磁性奈米粒子上附接不同的探針，而附接於每一個磁性奈米粒子上之探針則為相同；施加磁力以將該等磁性奈米粒子固定於該等孔之底部；在該等孔中加入該懷疑含有一種或多種目標分子之溶 液；移除磁力以使該等目標分子(若存在)分散懸浮於該溶液中，與該等探針在溶液中互相作用；再施加磁力以使該等磁性奈米粒子再次固定於該等孔之底部；沖洗該等孔以移除游離分子；以及偵測在該等孔之任一者中之標記信號，該信號指示該等目標分子之一與該等探針之一結合。
6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該附接於磁性奈米粒子之探針為核酸、蛋白質、多肽、適體、碳水化合物、糖蛋白、糖脂質或小分子。
7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該探針為寡核苷酸。
8. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該目標分子為核酸、蛋白質、多肽、適體、碳水化合物或小分子。
9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該目標分子以粒子、染料分子或生物分子為信號標記。
10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該粒子為帶電粒子。
11. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該粒子為金奈米粒子。